腎細(xì)胞癌中Wif-1基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)

倪曉辰, 張愛莉, 衛(wèi)書飛

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 泌尿外科, 河北 石家莊, 050011)

腎細(xì)胞癌中Wif-1基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)

倪曉辰, 張愛莉, 衛(wèi)書飛

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 泌尿外科, 河北 石家莊, 050011)

目的 檢測腎細(xì)胞癌(RCC)中Wnt抑制因子-1(Wif-1)基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)水平，探討其在腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。方法 分別應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測56例腎細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁正常腎組織中Wif-1基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)水平。結(jié)果 Wif-1基因在RCC組織中的甲基化率顯著高于相應(yīng)癌旁正常腎組織(P<0.05)。Wif-1基因在RCC組織中的相對表達(dá)量顯著低于相應(yīng)癌旁正常腎組織(P<0.05)。在RCC組織中, Wif-1基因甲基化陽性組mRNA的相對表達(dá)量與甲基化陰性組mRNA的相對表達(dá)量比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 Wif-1基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化在腎細(xì)胞癌的發(fā)生中是一個(gè)頻發(fā)事件。

腎細(xì)胞癌; Wif-1; 甲基化; 表達(dá)

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于膀胱癌。隨著環(huán)境的惡化以及不良生活習(xí)慣等因素的改變，其發(fā)病率逐年上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。由于其早期臨床癥狀不明顯，增加了早期診斷和治療的困難。近年來關(guān)于腫瘤在表觀遺傳學(xué)方面的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條及其復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面有著極其重要的作用, Wif-1是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)抑癌基因，通過阻斷Wnt信號的傳導(dǎo)對腫瘤起到抑制作用。它的異常甲基化可能引起轉(zhuǎn)錄的異常，從而導(dǎo)致腫瘤的形成。本實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用MSP和RT-PCR技術(shù)分別檢測56例RCC組織及相應(yīng)癌旁正常腎組織中Wif-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和mRNA的表達(dá)情況，并分析其與腎癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，希望為RCC的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷以及預(yù)后判斷提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集: 研究對象來自2012—2013年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院泌尿外科住院手術(shù)治療的患者共56例，其中男35例，女21例，年齡21～78歲，平均年齡為59.6歲?；颊咝g(shù)前均未接受任何放療或化療，手術(shù)方式均為腎根治性切除術(shù)，標(biāo)本取腎細(xì)胞癌原發(fā)灶及相應(yīng)癌旁正常組織。標(biāo)本采集后立即于液氮保存。腫瘤直徑最大者約12 cm, 最小約2 cm, 平均約7 cm, 其中小于7 cm的為47例(84%), 大于等于7 cm為9例(16%)。按美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期: Ⅰ期43例(77.0%), Ⅱ期9例(16.0%), Ⅲ期3例(5.3%), Ⅳ期1例(1.7%)。

1.1.2 主要試劑及儀器: RT-PCR引物、MSP引物: 北京賽百盛基因有限公司; 逆轉(zhuǎn)錄RNA試劑盒: 美國Foments公司; DNA純化試劑盒: 美國Promega公司; VERITI PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng): 基因有限公司; DYY-6C電泳儀: 北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP): 取新鮮組織標(biāo)本100 mg, 放入研磨器中充分研磨，加入消化酶，最后收集到1.5 mL的離心管中進(jìn)行DNA提取，測定濃度及純度。取DNA標(biāo)本2 μg嚴(yán)格按照DNA純化試劑盒步驟進(jìn)行純化。DNA經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾后，沒有發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)變?yōu)槟蜞奏?U)。而本身發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)則保持不變。根據(jù)此原理設(shè)計(jì)引物: Wif-1特異性甲基化引物(MSP): F: 5′-CGCTCCACTGGGCGCACCGC-3′, R: 5′-TCGCACCTCGCTCGCGCCAGC-3′。Wif-1特異性非甲基化引物(USP): F: 5′-GGGTGTTTTATTGGGTGTATTGT-3′, R: 5′-AAAAAAACTAACACAAACAAAATACAAAC-3′。退火溫度分別是: 54 ℃, 50 ℃，產(chǎn)物大小: 145 bp, 154 bp。設(shè)置擴(kuò)增的反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性10 min; 95 ℃變性45 s; 退火45 s; 72 ℃延伸50 s, 35個(gè)循環(huán)后, 72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用紫外線凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。將正常人的外周血經(jīng)SssI甲基化酶處理后作為陽性對照; 菌雙蒸水替代DNA模板進(jìn)行PCR作為陰性對照。隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)以確保MSP的可靠性。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR): 取新鮮組織每例大約100 mg剪碎研磨，按照Trizol法進(jìn)行RNA的提取，測定濃度及純度。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, -20 ℃保存?zhèn)溆?。以GAPDH作為內(nèi)參照, RT-PCR引物的設(shè)計(jì): Wif-1基因RT-PCR引物: F: 5′-GTCTAAACGGGAACAGCCCT-3′, R: 5′-GCTGGCATTCTCTGTTGTGC-3′。GAPDH: F: 5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′, R: 5′-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3′。退火溫度分別是: 48℃, 57℃, 產(chǎn)物大小: 354 bp, 104 bp。cDNA擴(kuò)增的反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性, 10 min; 95 ℃變性, 45 s; 退火, 45 s; 72 ℃延伸, 50 s, 35個(gè)循環(huán)后, 72 ℃延伸7min, 4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像儀分析系統(tǒng)下掃描電泳條帶，運(yùn)用軟件Gel Pro Analysizer 3.1測定條帶灰度值進(jìn)行半定量分析, Wif-1mRNA相對表達(dá)量=Wif-1的灰度值/GAPDH的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最終取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用配對χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，計(jì)量資料采用配對或成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)方法。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RCC組織中的Wif-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

56例RCC組織及癌旁正常組織均成功進(jìn)行了MSP檢測(圖1、2)。Wif-1基因啟動(dòng)子在RCC組織中甲基化率為46.4%(26/56), 顯著高于正常腎組織的甲基化率3.6%(2/56)(P<0.05)。

2.2 RCC組織中Wif-1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床資料之間的關(guān)系

Wif-1基因啟動(dòng)子的甲基化率與性別、年齡、臨床分期及腫瘤大小等臨床資料無顯著關(guān)系(P>0.05)。見表1。

2.3 RCC組織中Wif-1基因mRNA相對表達(dá)量與臨床資料之間的關(guān)系

Wif-1基因mRNA相對表達(dá)量與年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期等無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 腎癌組織和正常腎組織中Wif-1甲基化狀態(tài)

圖2 腎癌組織和正常腎組織中Wif-1基因mRNA和GAPDH相對表達(dá)量的分析

表1 腎癌組織Wif-1甲基化和mRNA臨床資料的關(guān)系

2.4 RCC組織和正常腎組織中Wif-1基因mRNA相對表達(dá)量

Wif-1基因mRNA在RCC組織中的相對表達(dá)量(0.65±0.17), 顯著低于正常腎組織mRNA的相對表達(dá)量(0.77±0.06),P<0.05。

2.5 Wif-1基因甲基化與表達(dá)之間的相關(guān)性

在RCC組織中, Wif-1基因甲基化陽性組mRNA的相對表達(dá)量(0.68±0.17), 與甲基化陰性組mRNA的相對表達(dá)量(0.63±0.17)比較無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究一直都是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，而近年來關(guān)于表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用引起越來越多學(xué)者的關(guān)注。表觀遺傳學(xué)最早由Waddington[1]在1939年首先提出，它的提出為腫瘤生物學(xué)和癌癥生物標(biāo)記方面提供了一種新的見解。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，也是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段之一。

Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面有著極其重要的作用，它由19個(gè)分泌型糖蛋白組成，而這些糖蛋白之間的相互作用可能涉及到腫瘤的形成和發(fā)展[2]。Wif-1是Wnt信號通路一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，基因位于染色體12p14.3[3], 可編碼高度保守的分泌型蛋白，最初發(fā)現(xiàn)表達(dá)于人類視網(wǎng)膜上[4], 通過直接與Wnt蛋白結(jié)合，阻斷蛋白與受體之間的結(jié)合，阻斷了經(jīng)典和非經(jīng)典通路，從而可抑因Wnt信號紊亂引起的惡性腫瘤。當(dāng)Wif-1發(fā)生甲基化時(shí)，可能會(huì)激活Wnt通路，致使核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄活化，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和分化。當(dāng)本研究應(yīng)用MSP的方法檢測到Wif-1基因在RCC組織中甲基化率為46.4%, 明顯高于癌旁正常腎組織的甲基化率3.6%, 這與Ding等[5]報(bào)道肝的癌組織中Wif-1的甲基化率顯著高于癌旁正常組織這一結(jié)果相一致，表明甲基化可能參與了腎癌的發(fā)生，此外在其他腫瘤同樣報(bào)道了存在Wif-1的高甲基化現(xiàn)象，如乳腺癌[6], 膀胱癌[7], 鼻咽癌[8], 結(jié)直腸癌[9]。Wissman等[3]用基因芯片技術(shù)檢測到在很多人類腫瘤中存在Wif-1表達(dá)下調(diào)，如前列腺癌、胃腸道腫瘤等，而后在乳腺癌和肺癌應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測到Wif-1蛋白水平的降低。Mazieres等[10]的研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中Wif-1的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，且在肺癌組織中甲基化陽性組的表達(dá)顯著低于未發(fā)生甲基化組，而且Wif-1表達(dá)缺失的肺癌細(xì)胞株經(jīng)去甲基化藥物5-氮雜-2′脫氧胞苷(ADC)處理后Wif-1基因可以恢復(fù)表達(dá)。由此推測Wif-1基因啟動(dòng)子區(qū)的異常高甲基化導(dǎo)致的基因沉默可能肺癌發(fā)生的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在腎細(xì)胞癌組織中存在Wif-1表達(dá)的降低，與上述報(bào)道相一致。但是與Mazieres等人實(shí)驗(yàn)結(jié)果不太一致是在本實(shí)驗(yàn)56例RCC組織中, Wif-1基因mRNA在甲基化陽性病例中的相對表達(dá)量高于甲基化陰性病例中mRNA的相對表達(dá)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 表明其mRNA表達(dá)的減低可能由于其他轉(zhuǎn)錄異常引起的。因此該實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步研究腎癌經(jīng)過去甲基化試劑作用后其表達(dá)變化的情況，繼續(xù)探討兩者在腎癌中的具體作用機(jī)制以及兩者之間的相互關(guān)系，為腎癌的發(fā)生機(jī)制提供更多的理論基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌組織中Wif-1基因的甲基化率顯著高于癌旁正常組織，并伴有轉(zhuǎn)錄水平的降低。因此Wif-1有可能作為腎細(xì)胞癌的一個(gè)新的分子靶標(biāo)，對臨床早期診斷與治療發(fā)揮一定指導(dǎo)作用。

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Methylation and mRNA expression of Wif-1 gene in renal cell carcinoma

NI Xiaochen, ZHANG Aili, WEI Shufei

(Department of Urinary Surgery, The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei, 050011)

Objective To detect the methylation of Wif-1 gene promoter and its mRNA expression level in renal cell carcinoma, and to explore its possible mechanisms in the development of renal cell carcinoma. Methods The methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) and reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) were applied to investigate the methylation status of Wif-1 gene promoter and its mRNA expression levels in renal cell carcinoma (RCC) and normal kidney tissue. Results The percentage of methylation of Wif-1 gene in RCC tissue was significantly higher than that in the corresponding normal kidney tissue (P<0.05). The relative expression quantity of Wif-1 mRNA in RCC tissue was significantly lower than that in corresponding normal kidney tissue (P<0.05). In the RCC tissue, the relative expression of mRNA in the Wif-1 methylation positive group showed no significant difference with that in the methylation negative group. Conclusion Hypermethylation of the Wif-1 promtor in RCC is a frequent phenomenon.

renal cell carcinoma; Wnt inhibitory factor-1; methylation; expression

2017-01-12

張愛莉

R 737.11

A

1672-2353(2017)15-074-04

10.7619/jcmp.201715020