促性腺激素釋放激素和宮頸癌的相關(guān)性研究

李鳳艷, 陳志燕, 李小翠, 苗媛秋, 劉春靜

(1. 河北省秦皇島經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)醫(yī)院, 河北 秦皇島, 066004;2. 河北省秦皇島市海港醫(yī)院, 河北 秦皇島, 066000)

促性腺激素釋放激素和宮頸癌的相關(guān)性研究

李鳳艷1, 陳志燕1, 李小翠1, 苗媛秋2, 劉春靜1

(1. 河北省秦皇島經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)醫(yī)院, 河北 秦皇島, 066004;2. 河北省秦皇島市海港醫(yī)院, 河北 秦皇島, 066000)

目的 檢測促性腺激素釋放激素(GnRH)在宮頸癌中的表達(dá)，探討二者的相關(guān)性。方法 選取68例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者和45例慢性宮頸炎患者，分別利用免疫組化以及原位雜交等兩種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)癌細(xì)胞組織和宮頸炎中GnRH的表達(dá)進(jìn)行檢測，觀察2組患者GnRH的蛋白質(zhì)水平及核酸水平。結(jié)果 45例宮頸炎患者的宮頸上皮組織GnRH以及GnRH mRNA表達(dá)結(jié)果均為陰性，而68例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌細(xì)胞組織中GnRH的陽性表達(dá)率為82.36%, GnRH mRNA的陽性表達(dá)率為64.71%, 宮頸炎和宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的GnRH和GnRH mRNA水平有顯著差異(P<0.05); 不同臨床期別的宮頸癌組織的GnRH的定性表達(dá)率為Ⅰb期55.56%, Ⅱa期87.10%, Ⅱb期及以上100%; GnRH mRNA的定性表達(dá)率為Ⅰb期38.89%, Ⅱa期70.97%, Ⅱb期及以上84.21%。不同臨床期別宮頸癌患者的GnRH和GnRH mRNA水平有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論 宮頸癌組織中存在較高促性腺激素釋放激素，其有可能參與到癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的過程。

促性腺激素釋放激素; 宮頸癌; 臨床期別; 表達(dá)

宮頸癌是當(dāng)前全球女性高發(fā)的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌[1-2]。促性腺激素釋放激素(GnRH)是從下丘腦分離出來的十肽激素，主要用于調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌，對(duì)生殖功能有著重要的調(diào)節(jié)控制作用[3]。GnRH在刺激促性腺激素分泌的同時(shí)，還可以對(duì)性腺分泌的特異性激素的合成及分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)，在生殖器官、乳腺、骨骼生長、甲狀腺以及腎上腺皮質(zhì)中均發(fā)揮重要作用[4]。GnRH可以通過自分泌系統(tǒng)和旁分泌系統(tǒng)同時(shí)起作用，與人體中其他細(xì)胞生長因子共同對(duì)腫瘤細(xì)胞生長進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。近年來臨床研究[6]發(fā)現(xiàn), GnRH除在乳腺、睪丸、卵巢、胎盤、大腦等垂體外正常組織中存在外，乳腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌以及宮頸癌等腫瘤組織中也有GnRH的表達(dá)。本研究利用免疫組化以及原位雜交等兩種實(shí)驗(yàn)方法，探討GnRH蛋白及GnRH mRNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌細(xì)胞組織中的表達(dá)，并分析其與宮頸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2016年11月本院就診的45例慢性宮頸炎患者和68例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，年齡25～72歲，平均年齡(45.3 ±6.9)歲。所有患者均無放療、化療以及免疫治療病史，也未通過口服藥物進(jìn)行治療。根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者分為Ⅰb期18例, Ⅱa期31例, Ⅱb期及以上19例。采集標(biāo)本，利用焦碳酸二乙酯滅活RNA酶的去離子水對(duì)離體后的標(biāo)本進(jìn)行固定，并由基礎(chǔ)病理科將其制成石蠟標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后常規(guī)病理檢查對(duì)診斷進(jìn)行明確。

1.2 檢測方法

免疫組化方法: GnRH鼠抗人多克隆抗體購于武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物科技發(fā)展有限公司, DAB顯色試劑以及超敏S-P免疫組化試劑盒購于上海酶研生物科技有限公司，根據(jù)試劑盒進(jìn)行操作。原位雜交檢驗(yàn): GnRH原位雜交試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司。GnRH探針合成序列為5′-CTTCTTCTGCCCAGTTTCCTCTTCAATCA-3′。操作步驟根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 陽性結(jié)果判定

定性判定: 將細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中棕黃色顆粒狀物視為陽性，滴加陰性對(duì)照探針雜交液或以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)染色程度以及陽性細(xì)胞數(shù)目，采用雙盲法: (-)表示無陽性細(xì)胞; (+)表示細(xì)胞膜或細(xì)胞漿被染成淺棕色或陽性細(xì)胞數(shù)目<10%; (2+)代表染色介于深淺棕色或陽性細(xì)胞數(shù)目在10%～50%; (3+)表示被染成深棕色或陽性細(xì)胞數(shù)目在50%以上。

定量判定: 利用連續(xù)成像顯微鏡對(duì)樣本進(jìn)行拍照，采用IPP(Image-Pro Plus)軟件對(duì)采集到的圖像進(jìn)行分析處理，定量分析已經(jīng)過定性檢測呈陽性的GnRH和GnRH mRNA。采用普通光源照明，在顯微鏡下放大400倍。將輸入條件固定后，隨機(jī)在每張切片中選取10個(gè)單位面積，對(duì)陽性細(xì)胞平均灰度進(jìn)行測定并計(jì)算單位面積內(nèi)GnRH和GnRH mRNA的相對(duì)含量，取平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料均通過秩和檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn); 計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，利用四格表確切概率法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織法檢測結(jié)果

利用免疫組織化學(xué)方法定性檢測GnRH在慢性宮頸炎和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn), 45例慢性宮頸炎患者的宮頸上皮組織GnRH的表達(dá)為陰性 (圖1A); 而68例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中, GnRH表達(dá)為陽性的有56例，陽性表達(dá)率達(dá)82.36%。顯微鏡下可見陽性細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞，主要分布在癌細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色 (圖1B) 。2組細(xì)胞組織中陽性表達(dá)有顯著差異(P<0.05); 不同臨床期別的宮頸癌組織中GnRH的陽性表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。定量檢測結(jié)果顯示，對(duì)采集圖像進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，不同臨床期別的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織單位面積的GnRH含量無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.2 GnRH mRNA在慢性宮頸炎和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

利用原位雜交方法定性檢測GnRH mRNA在慢性宮頸炎和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn), GnRH mRNA在45例慢性宮頸炎上皮組織中表達(dá)為陰性(圖2A); 68例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中GnRH mRNA表達(dá)為陽性的共44例，陽性表達(dá)率為64.71%。GnRH mRNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，呈棕黃色(圖2B)。2組GnRH mRNA的表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)。比較不同臨床期別宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中GnRH mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見表3。定量檢測結(jié)果顯示，對(duì)采集圖像進(jìn)行分析，不同臨床期別宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中GnRH mRNA的相對(duì)含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

A. GnRH在慢性宮頸炎中表達(dá)為陰性; B. GnRH在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)為陽性

表2 不同臨床期別的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織單位面積的GnRH相對(duì)含量

H=0.2531。

A. GnRH在慢性宮頸炎中表達(dá)為陰性; B. GnRH在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)為陽性

與Ⅰb期比較, *P<0.05; 與Ⅱa期比較, #P<0.05。

3 討 論

宮頸癌是當(dāng)前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其病理類型多以鱗狀細(xì)胞癌為主。中國宮頸癌發(fā)病率位居世界第2位，且患者發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，其防治工作也變得愈加重要[7-8]。盡管宮頸癌的臨床治愈率較高，但治療后30%以上的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因。因此，針對(duì)初次就診的患者進(jìn)行復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，預(yù)測患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于宮頸癌的防治來說至關(guān)重要。

表4 不同臨床期別宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織GnRH mRNA相對(duì)含量差異

H=6.734,P<0.05。

研究[9]證實(shí)，內(nèi)源性激素水平與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)，而GnRH在內(nèi)源性性激素水平的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。GnRH具有多種生物功能，能夠作為腫瘤細(xì)胞的自分泌調(diào)節(jié)因子進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長產(chǎn)生作用。有學(xué)者[10]認(rèn)為, GnRH-A能夠直接對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在一些惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。Rizzo等[11]發(fā)現(xiàn), GnRH-A能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子等引起子宮內(nèi)膜異位癥或子宮肌瘤的生長因素，阻止促進(jìn)腫瘤生長的血管的生成，這也進(jìn)一步提示, GnRH與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著密切關(guān)聯(lián)。

本研究利用免疫組化和原位雜交的方法對(duì)68例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者標(biāo)本與45例慢性宮頸炎患者標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 2組的GnRH和GnRH mRNA陽性表達(dá)率均存在顯著差異，提示在宮頸癌細(xì)胞組織中，無論是蛋白質(zhì)還是核酸水平均有GnRH的存在[12-14]。進(jìn)一步比較不同臨床期別宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織GnRH和GnRH mRNA的差異，定性比較顯示二者均有顯著差異; 定量比較顯示, 2組的GnRH水平無顯著差異，而GnRH mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由以上結(jié)果來看，宮頸癌組織可能具備合成GnRH的作用。定量分析不同臨床期別的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織發(fā)現(xiàn)，不同組的GnRH水平無顯著差異，而GnRH mRNA水平差異明顯，說明GnRH在不同分期的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平具備不協(xié)同性，癌細(xì)胞組織不僅僅通過自分泌途徑對(duì)GnRH的表達(dá)產(chǎn)生影響，很可能還存在其他旁分泌途徑[15-17]。

綜上所述, GnRH在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)于減少晚期宮頸癌患者接受治療后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、提高患者生存率具有重要意義。

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Correlation between gonadotropin-releasing hormone and cervical cancer

LI Fengyan1, CHEN Zhiyan1, LI Xiaocui1, MIAO Yuanqiu2, LIU Chunjing1

(1. Hospital of Qinhuangdao Economic and Technological Development Zone, Qinhuangdao, Hebei, 066004; 2. Qinhuangdao Seaport Hospital, Qinhuangdao, Hebei, 066000)

Objective To detect the expression of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in cervical cancer and to explore the correlation. Methods A total of 68 patients with cervical squamous cell carcinoma and 45 patients with chronic cervicitis were selected. Immunohistochemistry and hybridization in situ were used to detect the expression of GnRH in cancer tissue and cervicitis. Protein and nucleic acid level were observed in patients with GnRH. Results In 45 patients with cervicitis, both GnRH and GnRH mRNA expressions were negative in cervical epithelial tissue, while in 68 cases of cervical squamous cell cancer, the positive expression of GnRH in cancer tissues was 82.36%, and positive expression rate of GnRH mRNA was 64.71%. There were significant differences in levels of GnRH and GnRH mRNA between patients with cervicitis and cervical squamous cell carcinoma (P<0.05). The qualitative expression rates of GnRH in different clinical stages of cervical cancer were 55.56% of Ib, 87.10% of IIa and 100% of IIb, and qualitative expression rates of GnRH mRNA in different clinical stages of cervical cancer were 38.89% of Ib, 70.97% of IIa and 84.21% of IIb. There were significant differences in GnRH and GnRH mRNA levels between patients with different clinical stages of cervical cancer (P<0.05). Conclusion There is a high level of gonadotropin-releasing hormone in cervical cancer, which may be involved in the development of cancer cells.

gonadotropin-releasing hormone; cervical cancer; clinical stage; expression

2017-01-17

河北省衛(wèi)計(jì)委資助項(xiàng)目(20160521)

R 737.33

A

1672-2353(2017)15-057-04

10.7619/jcmp.201715015