腸道病毒71型激活人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中JNK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路*

許超，彭陽(yáng)，史偉峰

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

·研究生園地·

腸道病毒71型激活人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中JNK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路*

許超，彭陽(yáng)，史偉峰

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

目的 探討c-Jun N端激酶(JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腸道病毒71型(EV71)感染中的作用。方法 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)不同濃度抑制劑SP600125對(duì)人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)活性的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blot檢測(cè)EV71感染RD細(xì)胞后VP1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；western blot檢測(cè)JNK1/2、c-Fos、c-Jun蛋白及其磷酸化水平，并分析JNK1/2抑制劑SP600125對(duì)EV71復(fù)制及JNK1/2信號(hào)通路的影響。結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，5和10 μmol/L實(shí)驗(yàn)組存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而20 μmol/L抑制劑組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在EV71感染RD細(xì)胞8 h后，其VP1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均明顯下降(P均<0.01)。此外，western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)EV71感染RD細(xì)胞后，其JNK1/2、c-Fos和c-Jun的蛋白質(zhì)磷酸化水平均明顯升高(P均<0.05)。而經(jīng)抑制劑SP600125處理可明顯下調(diào)其JNK1/2、c-Fos、c-Jun磷酸化水平(P均<0.05)。結(jié)論 JNK1/2信號(hào)通路可被 EV71感染有效激活，并與EV71復(fù)制有關(guān)。

JNK1/2信號(hào)通路；腸道病毒71型；人橫紋肌肉瘤細(xì)胞

腸道病毒71型(EV71)感染嚴(yán)重者可引起無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、心肌炎和肺水腫等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，重癥患者常導(dǎo)致死亡[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，JNK信號(hào)通路在介導(dǎo)多種胞外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥、應(yīng)激、凋亡、周期和生長(zhǎng)等多種生理和病理過(guò)程中具有重要作用。EV71感染細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是在不同的宿主細(xì)胞中，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制各不相同[3]。人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞是EV71的易感細(xì)胞，主要用于EV71病毒的擴(kuò)增。目前，JNK信號(hào)通路激活與EV71感染性疾病的發(fā)生關(guān)系密切，但其機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)用JNK特異性抑制劑SP600125阻斷細(xì)胞信號(hào)通路，觀察JNK信號(hào)通路中蛋白質(zhì)分子的活性變化及VP1蛋白(病毒復(fù)制指標(biāo))在RD細(xì)胞中的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討RD細(xì)胞中JNK信號(hào)通路活化在EV71復(fù)制中的作用，以期為相關(guān)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒(臺(tái)盼藍(lán)染色法，Beyotime公司)，磷酸化蛋白質(zhì)提取試劑盒(凱基生物公司)，SP600125(JNK inhibitor,德國(guó)Selleck公司)，兔抗人JNK1/2、c-Fos、c-Jun及其磷酸化多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國(guó)SAB公司)，鼠抗人EV71/VP1抗體及HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(英國(guó)Abcam公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(美國(guó)ABI公司)，SMA1000超微量紫外分光光度計(jì)(北京普萊恒通公司)，CLINX化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤翔公司)。

1.2 病毒和細(xì)胞來(lái)源 EV71病毒株GDV083(BrCr)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.3 抑制劑制備 SP600125溶解于二甲基亞砜(DMSO)，終濃度為10 μmol/L，置于-20 ℃保存。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RD細(xì)胞，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(僅加PBS 2 μL)、DMSO組(僅加入DMSO 2 μL)和實(shí)驗(yàn)組(加入終濃度分別為5、10、20 μmol/L SP600125)，室溫溫育1 h后，更換為新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，按細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 EV71病毒感染RD細(xì)胞 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RD細(xì)胞，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔4×105個(gè))，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(2 μL DMSO+MOI=5的EV71)和實(shí)驗(yàn)組(終濃度為10 μmol/L SP600125+ MOI=5的EV71)，室溫溫育1 h后，加入相應(yīng)的病毒感染RD細(xì)胞，室溫溫育1 h后，更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并1 000 r/min離心5 min收集培養(yǎng)0、4、8、12、24 h的細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取1.5中的各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，SMA1000超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA濃度和純度，取濃度為300～500 ng/μL，吸光度(A260/280 nm)值為1.80～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。樣本置-20 ℃保存。

1.7 引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GenBank中VP1及GAPDH基因序列(序列號(hào)分別為EUO24958和NM_002046)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由蘇州金唯智公司合成。VP1上游引物序列：5′-GAGTGGCAGATGTGATTGA-3′，下游引物序列：5′-TCCAGTGTCTAAGCGATGA-3′ ，產(chǎn)物大小為215 bp；GAPDH上游引物序列：5′-TATGACAA

CAGCCTCAAGA-3′，下游引物序列：5′- ATGAGTCCT

TCCACGATAC-3′ ，產(chǎn)物大小為101 bp。PCR總體系為20 μL，包括SYBR Green Master mix 10 μL，ROX校正染料Ⅱ 0.4 μL,10 μmol/L上、下引物各0.4 μL, cDNA 2 μL,RNA Free ddH2O補(bǔ)足體積。PCR循環(huán)參數(shù): 95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,共40個(gè)循環(huán)。在60 ℃時(shí)用7500 v2.0.6軟件收集熒光信號(hào)。采用2-△△Ct法計(jì)算相VP1 mRNA的對(duì)表達(dá)水平，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 western blot 取上述各組細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并1 000 r/min離心5 min，加入蛋白質(zhì)裂解液 (1 mL裂解液含蛋白酶抑制劑1 μL、磷酸酶抑制劑10 μL和PMSF 10 μL)，冰上裂解40 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清，采用BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。以每孔35 μg的蛋白質(zhì)量加樣至10% SDS-PAGE凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓，分離膠采用100 V電壓)。電泳結(jié)束后在300 mA恒流條件下2 h將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；經(jīng)50 g/L脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別加入兔抗人抗JNK1/2、c-Fos、c-Jun、p-JNK1/2、p-c-Fos、p-c-Jun抗體、鼠抗人EV71/VP1抗體(均為1∶1 000稀釋)及兔抗人抗GAPDH多克隆抗體(1∶5 000稀釋)4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫溫育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL發(fā)光液顯色，在CLINX化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)及Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描進(jìn)及結(jié)果判讀。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SP600125對(duì)RD細(xì)胞存活率的影響 空白對(duì)照組、DMSO組、實(shí)驗(yàn)組(5、10、20 μmol/L)細(xì)胞存活率(%)分別為0.914±0.021，0.889±0.019，0.848±0.039，0.839±0.043，0.541±0.024，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.37,P<0.05)。組間兩兩比較結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，DMSO組、5、10 μmol/L實(shí)驗(yàn)組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為1.53，2.58，2.72，P均>0.05)，而20 μmol/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.26,P<0.05)；與20 μmol/L組相比，5、10 μmol/L實(shí)驗(yàn)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為11.61，10.48，P均<0.05)。

2.2 SP600125對(duì)RD細(xì)胞中EV71的復(fù)制影響

2.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VP1 mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組(1.43±0.18，13.14±0.23，14.53±0.11)相比，實(shí)驗(yàn)組在感染8、12和24 h后VP1 mRNA的表達(dá)水平降低(分別為0.55±0.12，3.51±0.15，4.97±0.13)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為7.05、60.74、97.23,P均<0.01)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在感染0和4 h時(shí)的VP1 mRNA都不表達(dá)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 western blot檢測(cè)VP1蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組(0.65±0.02，0.79±0.04，1.10±0.04)相比，實(shí)驗(yàn)組在EV71感染RD細(xì)胞8、12和24 h后VP1蛋白的灰度比值分別為0.14±0.05，0.25±0.06，0.53±0.03，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為16.4，12.97，19.75，P均<0.01 )；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在感染0和4 h時(shí)的VP1蛋白都不表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 SP600125對(duì)EV71感染RD細(xì)胞VP1蛋白表達(dá)的影響

2.3 EV71感染對(duì)激活JNK1/2信號(hào)通路的影響 western blot結(jié)果表明，對(duì)照組在感染EV71病毒0、4、8、12和24 h的p-JNK1/2蛋白灰度比值分別為0.26±0.03，0.57±0.04，0.35±0.06，0.21±0.02，0.18±0.03，而實(shí)驗(yàn)組中分別為0.12±0.02,0.14±0.03,0.09±0.01,0.10±0.02,0.08±0.01，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為6.73，14.90，7.40，6.74，5.48,P均<0.01)；對(duì)照組4、8、12和24 h的JNK1/2蛋白灰度比值分別為0.42±0.04，0.73±0，03，1.01±0.05，0.85±0.02, 而實(shí)驗(yàn)組分別為0.20±0.02，0.31±0.05，0.35±0.01，0.24±0.03，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為8.52，12.48，22.42，29.30，P均<0.01)；而對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在0 h時(shí)JNK1/2蛋白灰度比值(分別為0.10±0.02，0.11±0.01)，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.77，P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 SP600125對(duì)對(duì)照組(A)和實(shí)驗(yàn)組(B)JNK蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響

2.4 SP600125對(duì)JNK1/2通路下游轉(zhuǎn)錄因子的影響 western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組感染EV71病毒4、8、12和24 h相比，實(shí)驗(yàn)組c-Fos和c-Jun的蛋白質(zhì)磷酸化水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3和表1。

注：A、B,對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組c-Fos蛋白及其磷酸化的表達(dá)水平； C、D,對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組c-Jun蛋白及其磷酸化的表達(dá)水平。

圖3 SP600125對(duì)c-Fos、c-Jun蛋白及其磷酸化的影響

3 討論

JNK蛋白家族是絲裂原活化蛋白激酶超家族的成員之一，也被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶。JNK可介導(dǎo)多種胞外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒作用，如應(yīng)激、Fas、TNF-α等。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，EV71感染RD細(xì)胞后，JNK1/2、c-Jun、c-FosmRNA表達(dá)水平上調(diào)， IL-2、 IL-4、IL-10和TNF-α細(xì)胞因子分泌明顯增加，表明這些細(xì)胞因子的分泌可能促進(jìn)JNK信號(hào)通路的活化。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， EV71感染RD細(xì)胞8 h后，其VP1蛋白的表達(dá)水平明顯升高。另有研究發(fā)現(xiàn)[5]，EV71感染Hela細(xì)胞6 h即可出現(xiàn)VP1蛋白少量表達(dá)。研究表明[6]，VP1蛋白的表達(dá)水平主要是由病毒的毒力與細(xì)胞的抗病毒功能所決定。而JNK信號(hào)通路的激活能抑制細(xì)胞的抗病毒作用，促進(jìn)病毒的大量復(fù)制；本研究結(jié)果表明，用抑制劑SP600125處理EV71感染RD細(xì)胞后，可明顯下調(diào)JNK1/2、c-Fos和c-Jun的蛋白磷酸化，同時(shí)EV71/VP1 mRNA及其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯下降。表明抑制JNK信號(hào)通路可抑制感染RD細(xì)胞中EV71的增殖和復(fù)制。Zhou等[7]在研究Hsa-let-7c-5p對(duì)EV71病毒復(fù)制的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，EV71激活JNK信號(hào)通路后，其JNK蛋白磷酸化水平明顯增強(qiáng)，而在加入抑制劑SP600125后，EV71病毒滴度及VP1 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，與本研究的結(jié)果較為一致。Tung等[8]研究發(fā)現(xiàn)，EV71感染SK-N-SH細(xì)胞后可激活JNK信號(hào)通路，下游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和c-Jun的蛋白磷酸化水平明顯升高，促進(jìn)環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達(dá)，從而釋放大量的前列素E2(PEG2)，更有利于病毒的大量繁殖；當(dāng)加入抑制劑SP600125后，EV71病毒復(fù)制明顯受到抑制，表明抑制 JNK信號(hào)通路，下游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和c-Jun的蛋白磷酸化也相應(yīng)受到抑制，環(huán)COX-2的表達(dá)降低， PEG2釋放減少，不利于病毒的大量繁殖，與本研究結(jié)果較為類似。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EV71可激活JNK信號(hào)通路有利于病毒增殖，SP600125抑制劑可通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路影響EV71的復(fù)制，為臨床治療手足口病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但SP600125抑制劑對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用，且特異性較低，今后我們將針對(duì)JNK設(shè)計(jì)siRNA進(jìn)行特異性敲減，研究其對(duì)EV71復(fù)制的影響；此外，本研究?jī)H在細(xì)胞分子水平進(jìn)行分析，下一步我們將研究EV71感染小鼠后JNK信號(hào)通路相關(guān)基因變化，同時(shí)分析在JNK敲除小鼠中EV71感染情況，并檢測(cè)病毒RNA和蛋白質(zhì)水平變化，為JNK信號(hào)通路影響EV71的復(fù)制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Yang L, Liu Y, Li S,etal.A novel inactivated enterovirus 71 vaccine can elicit cross-protective immunity against coxsackievirus A16 in mice[J]. Vaccine, 2016,34(48):5938-5945.

[2]Liu J, Wang B, Huang P,etal.Microcystin-LR promotes cell proliferation in the mice liver by activating Akt and p38/ERK/JNK cascades[J]. Chemosphere, 2016,163(2):14-21.

[3]Zhang H, Li F, Pan Z,etal.Activation of PI3K/Akt pathway limits JNK-mediated apoptosis during EV71 infection[J]. Virus Res, 2014,19(2):74-84.

[4]Shi W, Hou X, Li X,etal.Differential gene expressions of the MAPK signaling pathway in enterovirus 71-infected rhabdomyosarcoma cells[J]. Braz J Infect Dis, 2013,17(4):410-417.

[5]Peng X, Fang X, Li J,etal.Enhancing immune responses of EV71 VP1 DNA vaccine by co-inoculating plasmid IL-12 or GM-CSF expressing vector in mice[J]. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2016,62(4):35-41.

[6]Wu HM, Zhou K, Wu T,etal. Synthesis of pyrazine-1,3-thiazine hybrid analogues as antiviral agent against HIV-1, influenza A (H1N1), enterovirus 71 (EV71), and coxsackievirus B3 (CVB3)[J]. Chem Biol Drug Des, 2016,88(3):411-421.

[7]Zhou B, Chu M, Xu S,etal.Hsa-let-7c-5p augments enterovirus 71 replication through viral subversion of cell signaling in rhabdomyosarcoma cells[J]. Cell Biosci, 2017,7(7):14-28.

[8]Tung WH, Lee IT, Hsieh HL,etal.EV71 induces COX-2 expression via c-Src/PDGFR/PI3K/Akt/p42/p44 MAPK/AP-1 and NF-kappaB in rat brain astrocytes[J]. J Cell Physiol, 2010,224(2):376-386.

(本文編輯：許曉蒙)

Enterovirus 71 activates the JNK1/2 signaling pathway in human rhabdosarcoma cells

XUChao,PENGYang,SHIWei-feng

(DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Changzhou213003,Jiangsu,China)

Objective To investigate the role of c-Jun N-terminal kinase (JNK1/2) signaling pathway in enterovirus 71 (EV71) infection. Methods The effects of different concentrations of SP600125 on the activity of human rhabdosarcoma (RD) cells were detected by trypanbalu staining. The levels of VP1 mRNA and protein in EV71-infected RD cells were detected by real time Q-PCR and western blot, respectively. The levels of total and phosphorylated JNK1/2, c-Fos and c-Jun protein were determined by western blot. Last, the effects of JNK1/2 inhibitor SP600125 on EV71 replication and JNK1/2 signaling pathway were analyzed. Results The results of trypanbalu staining showed that 5 and 10 μmol/L of SP600125 didn′t influence on the activity of RD cells (P>0.05), while 20 μmol/L of SP600125 decreased the survival of RD cells significantly (P<0.05). Compared with the control, the expression levels ofVP1 mRNA and protein in EV71-infected RD cells decreased obviously at 8 hours post-infection (P<0.01). In addition, after RD cells were infected EV71, the levels of phosphorylated JNK1/2, c-Fos and c-Jun increased significantly (P<0.05). However, the pretreatment of SP600125 decreased the phosphorylation levels of JNK1/2, c-Fos and c-Jun protein obviously (P<0.05). Conclusion EV71 infection may effectively activate the JNK1/2 signaling pathway in RD cells, which may be related to EV71 replication.

JNK1/2 signaling pathway; enterovirus 71; human rhabdosarcoma cell

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.20

國(guó)家自然科學(xué)基金(81572052)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20151178)。

許超，1990年生，男，碩士研究生，主要從事臨床微生物與免疫研究。

史偉峰，主任技師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:swf67113@163.com。

R512.5

A

2017-04-21)