血清miR-216a檢測(cè)在急性胰腺炎診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)中的價(jià)值*

陸攀，宋佳希，王鋒，閆靜，萬(wàn)淑君，汪俊軍

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，南京 210002)

·液體活檢與臨床實(shí)驗(yàn)研究·

血清miR-216a檢測(cè)在急性胰腺炎診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)中的價(jià)值*

陸攀，宋佳希，王鋒，閆靜，萬(wàn)淑君，汪俊軍

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，南京 210002)

目的 檢測(cè)急性胰腺炎(AP)患者血清miR-216a的表達(dá)水平，探討其作為AP診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)80例輕癥急性胰腺炎(MAP)、80例重癥急性胰腺炎(SAP)患者及74例健康人對(duì)照血清miR-216a的表達(dá)水平。全自動(dòng)生化免疫分析儀檢測(cè)各組淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LPS)、Ca2+、葡萄糖(Glu)、紅細(xì)胞比容(HCT)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)和C反應(yīng)蛋白(CRP)等指標(biāo)。 ROC曲線及相關(guān)性分析評(píng)估m(xù)iR-216a對(duì)AP患者的臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果 與健康人對(duì)照組[(11.12×10-5(5.83×10-5，19.12×10-5)]相比，AP患者血清miR-216a的水平 [38.49×10-5(24.05×10-5，62.02×10-5)]明顯升高(U=-9.10，P<0.01)。但MAP與SAP患者血清miR-216a水平[分別為36.46×10-5(22.29×10-5，55.80×10-5),40.44×10-5(25.84×10-5，65.48×10-5)]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=-0.96,P>0.05)。miR-216a用于鑒別對(duì)照組和AP患者的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.870(95%CI:0.825～0.915)，cut-off值為0.61；用于鑒別對(duì)照組和MAP患者的AUCROC為0.865(95%CI:0.808～0.921)，cut-off值為0.59；用于鑒別對(duì)照組與SAP患者的AUCROC為0.876 (95%CI:0.822～0.930)，cut-off值為0.66。AP患者治療好轉(zhuǎn)后，其血清miR-216a的表達(dá)水平由[41.88×10-5(24.24×10-5，64.44×10-5)]下降至[20.58×10-5(11.01×10-5，41.91×10-5)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=5.24，P<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AP患者血清miR-216a的表達(dá)水平與CRP呈正相關(guān)(r=0.215P=0.006)。結(jié)論 AP患者血清miR-216a水平明顯升高，可用于AP輔助診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)。

急性胰腺炎；miR-216a；生物學(xué)標(biāo)志物；預(yù)后監(jiān)測(cè)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及生活方式和飲食習(xí)慣在內(nèi)的多種因素，但其發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚[1]。臨床上對(duì)AP的診斷主要基于患者的臨床癥狀和體征，影像學(xué)檢查(CT和MRI)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)[血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LPS)和C反應(yīng)蛋白(CRP)等]，尚無(wú)單一的診斷指標(biāo)。目前評(píng)估AP病情嚴(yán)重程度主要依靠評(píng)分系統(tǒng)(如急性生理和慢性健康評(píng)估APACHE Ⅱ評(píng)分和Ranson評(píng)分)等方法[2]。但均具有一定的局限性。因此，迫切需要一種簡(jiǎn)便、特異的AP診斷生物學(xué)標(biāo)志物。研究證實(shí)，miRNA與AP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]，另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，AP大鼠或小鼠血清/血漿中miR-216a水平明顯上調(diào)[4]，AP患者的血清/血漿中 miR-216a 水平也明顯升高[5]。然而，miR-216a與AP疾病嚴(yán)重程度和病情變化的關(guān)系仍不清楚。因此，本研究旨在對(duì)不同嚴(yán)重程度及治療前后AP患者血清miR-216a的表達(dá)水平進(jìn)行分析，以期為AP的診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月至2017年1月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(南京總醫(yī)院)消化內(nèi)科和普外科就診的AP患者160例，男 110例，女50例，年齡 18 ～ 87歲，中位年齡46 歲。AP診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《急性胰腺炎診治指南(2014)》[6]；臨床上符合以下3項(xiàng)特征中的2項(xiàng)，即可診斷為AP：(1)與AP相符合的腹痛；(2)血清AMY酶和(或)LPS活性至少高于參考值上限3倍；(3)腹部影像學(xué)檢查符合AP影像學(xué)改變。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合AP診斷；(2)患者入院之前未經(jīng)任何治療，且于發(fā)病48 h內(nèi)來(lái)我院就診者；排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18周歲，患有惡性腫瘤，HIV感染，乙肝，自身免疫性疾病，妊娠，糖尿病，慢性胰腺炎等。根據(jù)APACHE Ⅱ評(píng)分≥8或Ranson評(píng)分≥3，存在持續(xù)性器官衰竭及局部或全身并發(fā)癥者作為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP) 80例，男51例，女29例，年齡18～87歲，中位年齡48.5歲。根據(jù)APACHE Ⅱ評(píng)分<8且Ranson評(píng)分<3，無(wú)器官衰竭及局部或全身并發(fā)癥者作為輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP) 80例，男59例，女21例，年齡18～76歲，中位年齡41.5歲。選擇同期體檢健康者74例為健康人對(duì)照組，男46例，女28例，年齡28～74歲，中位年齡44.5歲。

1.2 主要儀器及試劑 WH-851型渦旋儀(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)；1612-1型高速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械公司)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；SAS67120型超純水機(jī)(Millipore公司)；7300型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；VITROS 5600全自動(dòng)生化免疫分析儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；BC-5390 CRP 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(邁瑞公司)；XN2000 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex公司)；NanoDrop(美國(guó)Thermo Fisher科技公司)；miRNA測(cè)定用TaqMan探針(美國(guó)ABI公司)；酸性水飽和酚(索萊寶公司)；分析純級(jí)氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(上海化學(xué)試劑公司)；DEPC處理的ddH2O(美國(guó)Sigma公司)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR檢測(cè)試劑盒(大連TaKaRa公司)；人工合成的miRNA成熟體(Invitrogen公司)；AMY、LPS、Ca2+、葡萄糖(Glu)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)強(qiáng)生公司)；C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)試劑(邁瑞公司)。

1.3 標(biāo)本采集 采用真空采血促凝管收集健康人對(duì)照(禁食12 h以上)和AP患者(入院時(shí)首次采集，后經(jīng)2～8周治療，病情好轉(zhuǎn)者出院當(dāng)日再次采血)的空腹靜脈血液標(biāo)本3.5 mL，均于室溫、3 500 r/min離心5 min，收集血清，置-80 ℃保存。

1.4 臨床指標(biāo)檢測(cè) 按照VITROS 5600全自動(dòng)生化免疫分析儀及各自檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)血清AMY、LPS、Ca2+、Glu、TC和TG的表達(dá)水平，其中AMY和LPS采用兩點(diǎn)速率法，Ca2+測(cè)定采用砷化物比色法，Glu測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法，TC測(cè)定采用膽固醇氧化酶法，TG測(cè)定采用終點(diǎn)法；紅細(xì)胞比容(HCT)用XN2000 血細(xì)胞分析儀(溫氏法)測(cè)定；CRP用BC-5390 CRP 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(免疫散射比濁法)測(cè)定，結(jié)果均按照試劑盒提供的參考范圍判定。

1.5 血清RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 血清RNA采用酸性苯酚-氯仿一步抽提法進(jìn)行[7]，RNA提取后溶于20 μL DEPC處理的ddH2O中，分別檢測(cè)吸光度A260 nm和A260/280 nm計(jì)算RNA的濃度和純度(A260/280 nm值為1.8～2.0認(rèn)為純度較好，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn))。按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置-20 ℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用基于Taqman探針的qRT-PCR法檢測(cè)，引物及探針由美國(guó)ABI公司設(shè)計(jì)并合成。qRT-PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括ddH2O 14.77 μL，10×PCR 緩沖液2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，rTaq酶0.3 μL，相應(yīng)miRNA探針(miR-216a：MIMAT0000273, miR2911：MI0012634)0.33 μL，cDNA 1 μL。qRT-PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。于60 ℃時(shí)用7300 system software軟件采集熒光信號(hào)，以MIR2911作為外參照。陰性對(duì)照的樣本為DEPC處理的ddH2O(不含cDNA模板)。結(jié)果采用2-ΔCt法計(jì)算，公式：ΔCt=Ct目的miRNA-CtMIR2911。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 與健康人對(duì)照組相比，AP患者血液中Glu和TG水平明顯升高(P<0.01)，HCT明顯降低(P<0.01)。進(jìn)一步進(jìn)行亞組間的分析結(jié)果表明，與MAP患者相比，SAP患者CRP、Glu表達(dá)水平以及APACHⅡ評(píng)分和Ranson評(píng)分明顯升高(P<0.01)；而Ca2+和HCT的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 AP患者與健康人對(duì)照組的臨床基本資料比較

注：*，數(shù)據(jù)在分析之前已進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換；與健康人對(duì)照組比較，△，P<0.05；與MAP組比較，#，P<0.05。

2.2 各組血清miR-216a檢測(cè)結(jié)果 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康人對(duì)照組[(11.12×10-5(5.83×10-5，19.12×10-5)]相比，AP患者血清miR-216a水平 [38.49×10-5(24.05×10-5，62.02×10-5)]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=-9.10，P<0.01)。進(jìn)一步進(jìn)行亞組間比較發(fā)現(xiàn)，MAP與SAP患者血清miR-216a水平[分別為36.46×10-5(22.29×10-5，55.80×10-5)，40.44×10-5(25.84×10-5，65.48×10-5)],差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=-0.96，P>0.05)。

2.3 ROC曲線分析 以AP患者作為疾病組，健康人作為對(duì)照組， miR-216a用于鑒別AP患者的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.870(95%CI:0.825～0.915)，cut-off值為0.61，敏感性66%，特異性95%。以MAP患者作為疾病組，健康人作為對(duì)照組，其AUCROC為0.865(95%CI:0.808～0.921)，cut-off值為0.59，敏感性75%，特異性84%。以SAP患者作為疾病組，健康人作為對(duì)照組，其AUCROC為0.876 (95%CI:0.822～0.930)，cut-off值為0.66，敏感性71%，特異性95%。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-216a鑒別AP、MAP和SAP患者與健康人對(duì)照的ROC曲線

2.4 AP患者治療前后miR-216a的水平 進(jìn)一步比較71例AP患者治療前后血清中miR-216a水平的變化，結(jié)果顯示，經(jīng)治療后，AP患者血清miR-216a的表達(dá)水平由[41.88×10-5(24.24×10-5，64.44×10-5)]下調(diào)至[20.58×10-5(11.01×10-5，41.91×10-5)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=5.24，P<0.01)。

2.5 血清miR-216a的水平與其他檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，miR-216a與CRP呈正相關(guān)(r=0.215，P=0.006)，而與AMY(r=-0.011，P=0.889)，LPS(r=0.040，P=0.618),Glu(r=0.105，P=0.191),HCT(r=0.007，P=0.932)，Ca2+(r=-0.111，P=0.164)，TG(r=0.132，P=0.099)和TC(r=0.036，P=0.652)均無(wú)相關(guān)性。

3 討論

血清中含有大量源自不同組織和器官的循環(huán)miRNAs，具有取材方便，穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，已成為多種疾病的生物學(xué)標(biāo)志物[8]。本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同嚴(yán)重程度的AP患者血清中的miR-216a表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并觀察了AP患者治療好轉(zhuǎn)后miR-216a的水平變化情況，同時(shí)，結(jié)合患者的臨床資料進(jìn)行綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAP和SAP患者血清中miR-216a的表達(dá)水平明顯升高，且患者病情好轉(zhuǎn)，炎癥指標(biāo)基本恢復(fù)正常，胰周滲出較前有所減輕，無(wú)腹痛腹脹等不適后，其表達(dá)水平亦明顯下降。ROC曲線分析顯示，血清miR-216a對(duì)健康人對(duì)照組和AP患者，MAP患者及SAP患者均具有一定的鑒別意義。AP患者血清miR-216a水平的升高可能是由于其胰腺細(xì)胞損傷，促進(jìn)該細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)釋放miR-216a到血液中，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，血清miR-216a水平不僅可較好的區(qū)分健康人和AP患者，甚至對(duì)癥狀較輕的MAP患者也具有較好的區(qū)分能力，由此可見(jiàn)， miR-216a可以反映胰腺的損傷，可作為AP潛在的診斷標(biāo)志物。本研究結(jié)果還顯示，當(dāng)患者病情好轉(zhuǎn)后，其血清miR-216a的水平趨于正常，可輔助反映患者的病情變化；提示miR-216a可能參與AP病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展。目前AP的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，廣為接受的假說(shuō)是，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰酶的過(guò)早激活，導(dǎo)致胰腺的自我消化并伴隨著白細(xì)胞的浸潤(rùn)與活化[9]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，AP小鼠AR42J細(xì)胞中TGF-β 誘導(dǎo)miR-216a表達(dá)升高，miR-216a靶向作用于PTEN和Smad7蛋白，使其表達(dá)降低，從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)AP的進(jìn)展。miR-216a是否還靶向其他關(guān)鍵蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)胰腺炎的病理機(jī)制，將是我們今后研究的方向。本研究通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CRP與miR-216a呈正相關(guān)，提示miR-216a可能與炎癥相關(guān)。由此可見(jiàn)，miR-216a可能參與AP的病理生理過(guò)程。

本研究初步探索了AP患者血清miR-216a水平與治療前后病情變化的關(guān)系，但仍在不足之處：首先樣本量有限，尚需要大樣本量的驗(yàn)證。而miR-216a在胰腺炎發(fā)生中的異常表達(dá)，提示其可能對(duì)胰腺炎的進(jìn)展發(fā)揮重要作用，需要對(duì)其作用機(jī)制深入研究。除此之外，應(yīng)增加對(duì)病情惡化的SAP患者的觀察，動(dòng)態(tài)追蹤miR-216a的變化，以期為臨床提供準(zhǔn)確的預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

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(本文編輯：許曉蒙)

Clinical significance of serum miR-216a in diagnosis and prognosis monitoring of patients with acute pancreatitis

LUPan,SONGJia-xi,WANGFeng,YANJing,WANShu-jun,WANGJun-jun

(DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,JinlingHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity，Nanjing210002,Jiangsu,China)

Objective To detect altered levels and clinical significance of serum miR-216a and prognosis monitoring in acute pancreatitis (AP) patients. Methods Serum miR-216a levels were determined by quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) assay among 80 mild acute pancreatitis (MAP) patients, 80 severe acute pancreatitis (SAP) patients and 74 healthy controls. And amylase (AMY), lipase (LPS), Ca2+, glucose (Glu), hematocrit (HCT), triglyceride (TG), total cholesterol (TC) and C reactive protein (CRP) were measured by biochemical analyzer. The clinical usefulness of miR-216a for AP patients was assessed by ROC curve analysis and correlation analysis. Results Compared with healthy controls (11.12×10-5[5.83×10-5，19.12×10-5], the serum miR-216a levels were significantly increased in AP patients(38.49×10-5[24.05×10-5，62.02×10-5], (U=-9.10，P<0.01)。The serum miR-216a levels in MAP and SAP patients were (36.46×10-5[22.29×10-5，55.80×10-5]vs 40.44×10-5[25.84×10-5，65.48×10-5])，there was no significant difference between MAP and SAP patients(U=-0.96,P>0.05). The areas under ROC curve (AUCROC) of miR-216a for differential healthy controls and AP patients was 0.870 (95%CI:0.825-0.915), cut-off value is 0.61. AUCROCof miR-216a for differential healthy controls and MAP patients was 0.865 (95%CI: 0.808-0.921), cut-off value is 0.59. And AUCROCof miR-216a for differential healthy controls and SAP patients was 0.876 (95%CI:0.822-0.930), cut-off value is 0.66. Moreover, after the clinical improvement of the patients, the levels of serum miR-216a were significantly lowered from (41.88×10-5[24.24×10-5，64.44×10-5]) to (20.58×10-5[11.01×10-5，41.91×10-5]), the differences was significant(U=5.24，P<0.01). Correlation analysis showed that miR-216a was positively correlated with CRP (r=0.215,P=0.006) in AP patients. Conclusion The levels of miR-216a in serum of AP patients were increased, which is a potential biomarker for the diagnosis and prognosis monitoring of AP.

acute pancreatitis; miR-216a; biomarkers; prognosis monitoring

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.05

國(guó)家自然科學(xué)基金(81572073；81572074)。

陸攀，1991年生，女，碩士研究生，研究方向：疾病分子標(biāo)志物的基礎(chǔ)和臨床研究。

汪俊軍，主任技師，教授，博士，E-mail:wangjj9202@163.com。

R657.5+1

A

2017-06-02)