奶牛乳房炎耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性及mecA耐藥基因分型研究

鐘召兵，侯磊，孫紅華，王寧，楊夫會(huì)，李慶雷

(1.泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000；2.泰安市畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000；3.山東高速生物工程有限公司，濟(jì)南 250000 )

奶牛乳房炎耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性及mecA耐藥基因分型研究

鐘召兵1，侯磊2，孫紅華1，王寧1，楊夫會(huì)1，李慶雷3

(1.泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000；2.泰安市畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000；3.山東高速生物工程有限公司，濟(jì)南 250000 )

為了解奶牛場(chǎng)乳房炎金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）的耐藥性，并對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的耐藥基因進(jìn)行研究，本研究采集奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎奶樣89份進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，采用K-B法檢測(cè)其對(duì)常用13種抗生素的敏感性；利用雙重PCR擴(kuò)增MRSA的nuc基因和mecA耐藥基因；應(yīng)用基因外重復(fù)回文序列（repetitive extragenic palindromic elements, REP）PCR對(duì)分離菌株進(jìn)行基因多樣性分析。結(jié)果顯示，共分離到16株MRSA；在監(jiān)測(cè)的13種藥物中，耐藥率超過(guò)50%的達(dá)到10種，其中對(duì)頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、環(huán)丙沙星（CIP）和亞胺培南(IPM)耐藥率高達(dá)93.75%（15/16），但未見(jiàn)對(duì)頭孢呃酮（SCF）耐藥的分離菌株；耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，16株菌中都攜帶有mecA耐藥基因，除1株外其他15株分離菌都攜帶特異致病nuc基因。REP-PCR把分離菌株分為13種基因型（A-M），同源性≥90%的只有6株菌。研究結(jié)果表明，奶牛乳房炎金黃葡萄球菌的多重耐藥比較嚴(yán)重，分子多樣性復(fù)雜，mecA是其耐甲氧西林類(lèi)藥物的重要機(jī)制，本研究為MRSA耐藥菌的有效檢測(cè)及奶牛乳房炎的治療提供了科學(xué)依據(jù)。

奶牛乳房炎；金黃色葡萄球菌；mecA基因；REP-PCR；基因型

奶牛乳房炎是一種常見(jiàn)且復(fù)雜的疾病，嚴(yán)重影響奶牛奶產(chǎn)量及牛奶品質(zhì)，并且影響公共食品衛(wèi)生安全[1]。引起奶牛乳房炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸埃希氏菌[2]。其中，金黃色葡萄球菌性乳房炎發(fā)病率最高，多呈慢性經(jīng)過(guò)，其特異性致病基因是nuc基因。值得注意的是，金黃色葡萄球菌中含有耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA），mecA基因是MRSA的耐藥基因。MRSA導(dǎo)致的乳房炎難以被治愈，患牛通常被淘汰，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。

本研究以奶牛場(chǎng)乳房炎患牛的新鮮奶樣為試驗(yàn)材料，分離鑒定金黃色葡萄球菌，并對(duì)MRSA耐藥菌株的耐藥性、耐藥基因和分子多樣性進(jìn)行系統(tǒng)研究，為奶牛乳房炎的有效鑒定和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本研究以泰安市5個(gè)奶牛場(chǎng)的臨床型乳房炎患牛為試驗(yàn)動(dòng)物，無(wú)菌采集38頭（次）奶牛的新鮮奶樣，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采集奶樣、預(yù)培養(yǎng)

用50mL無(wú)菌離心管采集奶樣，加入等體積的TBS肉湯（含15%NaCl），充分混勻，37℃培養(yǎng)18～24h。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將樣品與培養(yǎng)液接種到高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基（杭州天河）、37℃培養(yǎng)18～24h，挑取橘黃色的菌落接種到Baird-park瓊脂培養(yǎng)基上純培養(yǎng)一次，然后用API 20E（Bio Merieux, Marcy-I’Etoile, France）鑒定。

1.2.3 藥物敏感試驗(yàn)

采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推薦的K-B法檢測(cè)阿米卡星(AK)、頭孢他啶(CAZ)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(CN)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻肟 (CTX)、頭孢替坦(FEP)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、氨芐西林(SAM)、頭孢哌酮(SCF)、復(fù)方新諾明(SXT)、哌拉西林 (TZP)）共13種常用抗菌藥物的敏感性。結(jié)果判定及質(zhì)量控制按2010年CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.4 MRSA特異性基因nuc和mecA耐藥基因的檢測(cè)

按細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌DNA，提取后的產(chǎn)物于-20℃ 保存?zhèn)溆?。雙重PCR擴(kuò)增MRSA特異性基因nuc和mecA耐藥基因，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表1）。50μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4.0μL，20pmol/L引物各1μL，25mmol/μL MgCl23μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3μL，加ddH2O至50μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性25s，52℃退火40s，72℃延伸50s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸6min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.5 REP-PCR反應(yīng)

引物[3]REP1（5’-ACTATTCCCTCAGGCTCC-3’）和REP2（5’- GGAGTTAATCTACGTCTCATC -3’）均由大連寶生物公司合成。反應(yīng)體系為25uL，其中10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmoL/L dNTP 2.0μL，20pmol/L引物各1μL，25mmol/μL MgCl21.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板1.5μL，加ddH2O至 25μL。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性1min，56℃退火45s，72℃延伸5min，35個(gè)循環(huán)，65℃延伸10min后結(jié)束反應(yīng)。

1.2.6 REP-PCR聚類(lèi)分析

將REP-PCR電泳圖譜用Gel-Proanalyzer3.1軟件精確確定每條條帶分子量大小后，采用非加權(quán)對(duì)數(shù)算術(shù)平均法(unweighted pair group method using averages algorithm, UPGMA)，利用SAS8.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。另外，將每一個(gè)分離株看作是一個(gè)分類(lèi)學(xué)單位(operational taxonomic unit, OUT)，并且把相似性≥90%的菌株看作起源相同的菌株[4]。為了減少誤差，所有菌株在同一個(gè)反應(yīng)條件下一次完成，電泳也在同一塊凝膠中一次完成。

2 結(jié)果

2.1 MRSA分離株對(duì)常用13種藥物的敏感性

表2 MRSA對(duì)13種常用抗生素耐藥性分析

本研究從奶牛場(chǎng)乳房炎患牛的新鮮奶樣中共分離到16株MRSA。16株MRSA對(duì)頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、環(huán)丙沙星（CIP）、亞胺培南（IPM）的耐藥率為93.75%（15/16），對(duì)復(fù)方新諾明（SXT）的耐藥率為87.5%（14/16），對(duì)慶大霉素（CN）、哌拉西林（TZP）的耐藥率為81.25%（13/16），而對(duì)阿米卡星（AK）、頭孢替坦（FEP）、頭孢他啶（CAZ）的耐藥率分別為75%（12/16）、68.75%（11/16）、62.5%（10/16），對(duì)氨芐西林(SAM)、美羅培南(MEM)的耐藥率分別為43.75%（7/16）、37.5%（6/16），但對(duì)頭孢哌酮(SCF)幾乎都敏感或中度敏感（表2）。

2.2 MRSA的mecA耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

16株菌均含有mecA耐藥基因，除了第15株分離菌外，其他的菌株均含有nuc特異性致病基因（圖1）。

圖1 雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 REP-PCR對(duì)16株MRSA的檢測(cè)結(jié)果

16株MRSA進(jìn)行REP-PCR分子分型，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后呈現(xiàn)不同帶型，同一種細(xì)菌可出現(xiàn)泳動(dòng)速率各異的數(shù)條帶行，一般擴(kuò)增除4～9條條帶，所獲的分子量大小在109～2 212kb之間。根據(jù)每個(gè)聚類(lèi)群內(nèi)部和聚類(lèi)群之間菌株的遺傳距離相同或很相近，16株MRSA可分為13種基因型，分別是A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M。它們之間的同源性在57%～92%之間，大部分菌株間相似性低于90%，同源性大于90%的有菌株3和4、7和8以及9與10（圖2）。

3 討論

MRSA像一般的細(xì)菌一樣廣泛存在于水、土壤，甚至動(dòng)物和人體的表面。在機(jī)體抵抗力強(qiáng)時(shí)不會(huì)發(fā)作，而一旦機(jī)體抵抗力下降，它可通過(guò)多種途徑侵入機(jī)體，導(dǎo)致皮膚或器官的多種感染，甚至敗血癥；也能產(chǎn)生多種毒素，引起食物中毒、毒性休克癥和假膜性腸炎等疾病[5]。該菌對(duì)目前臨床上所使用的大多數(shù)抗生素有很高的耐藥率和多重耐藥性，除對(duì)甲氧西林耐藥外，對(duì)絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素呈交叉耐藥，并可對(duì)氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等常用抗生素產(chǎn)生多重耐藥，極易引起感染的暴發(fā)流行，給臨床治療帶來(lái)極大困難，已成為世界關(guān)注的難題。鑒于它的嚴(yán)重性，美國(guó)已將其列入傳染病管理。

在本研究中，16株MRSA對(duì)亞胺培南(IPM)的耐藥率是93.75%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2010年中國(guó)衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告所公布的數(shù)據(jù)。這與中國(guó)上海和陜西地區(qū)的研究結(jié)果一致[6,7]。這表明MRSA對(duì)IMP的耐藥性呈明顯增高趨勢(shì)。MRSA分離菌株對(duì)10種常用抗生素的耐藥率都大于60%，這說(shuō)明本地區(qū)MRSA耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻。值得一提的是，16株分離菌都對(duì)頭孢哌酮(SCF)敏感或中度敏感。但是以往的研究表明MRSA對(duì)頭孢哌酮(SCF)耐藥的上升速度非常快。因此，在應(yīng)對(duì)該菌感染時(shí)，需要更有效的藥物和方案。

本研究中所分離的16株MRSA都攜帶mecA基因，這與mecA基因是MRSA的固有基因有關(guān)[7]。本研究利用了REP-PCR對(duì)MRSA進(jìn)行分型[2,8]，16株菌分為13種基因型，而根據(jù)菌株的遺傳距離相同或接近，A型與B型、D型與E型、I型與J型之間的親緣關(guān)系較近；發(fā)現(xiàn)同一牛場(chǎng)中不同個(gè)體的分離株，也可以存在不同基因型；而不同牛場(chǎng)的分離株也可屬于同一基因型。同時(shí)也出現(xiàn)了遺傳距離較遠(yuǎn)的、親緣關(guān)系相差較大的菌株。這表明MRSA來(lái)源更為廣泛，不同地區(qū)、不同環(huán)境和條件下同一種病原菌的基因型也存在一定差異，可能存在多個(gè)MRSA的基因型[9]。

圖2 據(jù)REP-PCR做出的MRSA遺傳關(guān)系聚類(lèi)樹(shù)狀圖

規(guī)模奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)奶牛乳房炎的MRSA往往被人們所忽略。但是本研究的結(jié)果表明，從奶牛乳房炎患牛分離的MRSA的耐藥情況很?chē)?yán)重，而且基因型多且同源性較低。因此需要采取有效的措施來(lái)控制MRSA耐藥基因的散播。

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Typing of MecA gene and Meticillin-resistant Staphylococcus aureus Resistance in Cow Mastitis

ZHONG Zhao-bing1, HOU Lei2, SUN Hong-hua1, WANG Ning1, YANG Fu-hui1, LI Qing-lei3
(1.Tai,an Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Tai,an 271000; 2.Tai,an District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Tai,an 271000; 3. Shandong High Speed Biological Engineering Limited Company, Jinan 250000)

The purpose of this study is to understand the drug resistance of S.aureus within a dairy farm and study mecA resistant genes of MRSA.Totally 89 samples were Collected from the dairy dominant mastitis milk samples were employed for separation and identifcation of S.aureus,as well as the drug susceptibility test. K-B method was used to detect the sensitivity of 13 kinds of antibiotics,nuc gene and mecA resistance gene of MRSA amplifed by duplex PCR. The repetitive extragenic palindromic elements, PCR, REP-PCR method was applied to analyze gene diversity of S. aureus isolated.We were isolated from 16 MRSA strains, in the detection of the 13 drugs, the drug resistance rate of 10 kinds was more than 50%, the drug resistance rates of CRO, CTX, CIP, and IPM were as high as 93.75% (15/16), but there was no isolated strain of SCF resistance. The results of drug resistance gene detection showed that 16 strains were carrying pathogenic gene nuc, 15 strains were all carrying the mecA resistance gene in addition to the 1 strain.the separated strains were divided into 13 genotypes (A-M)using REP-PCR, homology of only 6 strains was over 90%. The research results showed that the multi drug resistance of S.aureus for cow mastitis was very serious and molecular diversity complex, mecA was an important mechanism in methicillin-resistant drug, provided scientifc guidance for the treatment of cow mastitis and effective detection of MRSA.

Cow mastitis; S.aureus; mecA; REP-PCR; Genotype

S858.23

A

1004-4264（2017）08-0041-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.08.010

2016-11-25

泰安市科技計(jì)劃項(xiàng)目：“奶牛高產(chǎn)高效繁育技術(shù)集成示范”[2016]。

鐘召兵（1980-），男，山東諸城人，碩士，研究方向?yàn)樾笄莪h(huán)境空氣病原微生物的分離與鑒定。