以二抗為基底豬瘟抗體ELISA 檢測方法建立

劉麗婭 汪萍 苗書魁[新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 （新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心） 830000]

以二抗為基底豬瘟抗體ELISA 檢測方法建立

劉麗婭 汪萍 苗書魁*[新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 （新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心） 830000]

為驗(yàn)證以鼠抗豬IgG為基底，用辣根過氧化物酶標(biāo)記豬瘟E2蛋白，建立的豬瘟抗體ELISA檢測方法的可行性，對影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的主要條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，鼠抗豬IgG最佳包被濃度為1μg/ml，酶標(biāo)豬瘟E2蛋白最佳稀釋度為1：500，最佳封閉液為1%BSA。建立的方法對豬藍(lán)耳病陽性血清、豬圓環(huán)病陽性血清、豬亞洲1型口蹄疫陽性血清、豬O型口蹄疫陽性血清均無交叉反應(yīng)。通過對50份試驗(yàn)樣本的檢測，對比該方法與商品化IDEXX的豬瘟病毒抗體檢測試劑盒的符合性，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測豬瘟抗體的相對敏感性為76.9% （30/39），相對特異性為90% （45/50）。

二抗；豬瘟；抗體；ELISA方法

豬瘟是流行較早的疫病，在疫病監(jiān)測與防控中豬瘟病毒抗體ELISA試劑盒發(fā)揮著重要作用。目前針對豬瘟病毒抗體的ELISA檢測方法有：IDEXX豬瘟抗體試劑盒和荷蘭賽迪公司的豬瘟抗體試劑盒檢測效果相對較好[1-5]。國內(nèi)對豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒的研究一直是熱點(diǎn)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所等研制的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒2016年獲批新獸藥。本實(shí)驗(yàn)采用包被二抗的方法，包被的二抗與豬血清中的IgG抗體結(jié)合，第三步將經(jīng)過酶標(biāo)記的豬瘟E2蛋白與豬瘟抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)[1]，從而對豬瘟抗體進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑盒購自東仁化學(xué)科技 （上海）有限公司，豬瘟E2蛋白由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所病毒室自制，包被緩沖液、PBST溶液、酶標(biāo)終止液均為自配。96孔高親和力可拆分酶標(biāo)板，購自從Costar公司；小鼠抗豬二抗購自上海士峰生物；酶標(biāo)底物TMB購自Promega公司，BSA購自上海百賽生物科技有限公司。

1.2 辣根過氧化物酶標(biāo)記豬瘟E2蛋白

按試劑盒說明書對豬瘟E2蛋白進(jìn)行酶標(biāo)記。

1.3 抗體包被濃度與血清稀釋度的選擇

將鼠抗豬二抗以1.5μg，1μg，0.5μg包被酶標(biāo)板，血清稀釋為1：2、1：5、1：10，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD450值，根據(jù)OD450值選擇最佳抗體包被濃度及血清最佳稀釋度。

1.4 最佳封閉液的選擇

封閉液分別為1%BSA、2%馬血清、5%脫脂奶粉，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD450值，根據(jù)OD450值選擇最佳封閉液。

1.5 以二抗為基底的豬瘟抗體ELISA診斷方法建立

將100μl的1：2稀釋待檢血清及陽性、陰性對照血清分別加入已經(jīng)包被過二抗的96孔酶標(biāo)板中，用封板膜封板后置37℃溫育1h，棄去液體，每孔加300μl的PBST洗滌3～5次，加入100μl的1：500倍稀釋HRP-豬瘟E2蛋白，用封板膜封板后置37℃溫育1h，棄去液體，每孔加300μl的PBST洗滌3～5次，每孔加入50μl的TMB溶液，15min后每孔加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀讀取OD450值。

1.6 結(jié)果判定

要使試驗(yàn)有效，需符合下列條件：陽性對照的平均值減去陰性對照的平均值必須大于或等于0.150；此外，陰性對照的平均值必須小于或等于0.150。結(jié)果計(jì)算方法：陽性對照平均值陰性對照平均值樣本的計(jì)算結(jié)果判定：CSFV抗體的有無是通過計(jì)算每個(gè)樣品的S/P值判定。如果S/P值低于0.40，樣品應(yīng)判為CSFV抗體陰性。如果S/P值大于或等于0.40，樣品應(yīng)判定為CSFV抗體陽性。

1.7 對其他豬病血清的交叉反應(yīng)

將豬藍(lán)耳病陽性血清、豬圓環(huán)病陽性血清、豬亞洲1型口蹄疫陽性血清、豬O型口蹄疫陽性血清，檢測有無血清交叉反應(yīng)。

1.8 與商品化試劑盒對比的符合性試驗(yàn)

通過檢測樣本的陽性數(shù)量與陰性數(shù)量的關(guān)系判定與IDEXX試劑盒的相對特異性及相對敏感性。

2 結(jié)果

2.1 抗體包被濃度與血清稀釋度的選擇

通過正交試驗(yàn)進(jìn)行9次不同組合的篩選，最終確定二抗最佳包被濃度為1μg/ml，待檢血清最佳稀釋度為1：2，見表1。

2.2 最佳封閉液

選擇1%BSA、2%馬血清、5%脫脂奶粉為封閉液，通過對不同稀釋度的陽性血清、陰性血清進(jìn)行檢測，根據(jù)OD450值確定1%BSA為最佳封閉液，見表2。

2.3 對其他豬病血清的交叉反應(yīng)

檢測該方法對豬藍(lán)耳病陽性血清、豬圓環(huán)病陽性血清、豬亞洲1型口蹄疫陽性血清、豬O型口蹄疫陽性血清有無交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果均為陰性，見表3。

2.4 與商品化試劑盒對比的符合性試驗(yàn)

通過對50份試驗(yàn)樣本的檢測，對比該方法與商品化IDEXX的豬瘟病毒抗體檢測試劑盒的符合性，該方法檢測豬瘟抗體的相對敏感性為76.9% （30/39），相對特異性為90%（45/50）， 見表 4。

3 討論

本試驗(yàn)使用HRP標(biāo)記試劑盒對豬瘟E2蛋白進(jìn)行標(biāo)記，通過對二抗包被、血清稀釋度、酶標(biāo)抗原稀釋度等主要參數(shù)的篩選，建立以二抗為基底的豬瘟抗體ELISA診斷方法。該方法的優(yōu)勢在于可以通過增加酶標(biāo)抗原，完成兩種針對性抗體的檢測。使用者可以根據(jù)需求對樣品進(jìn)行隨機(jī)檢測，可分別檢測兩種標(biāo)記抗原的抗體，也可只選擇其中任意一種標(biāo)記抗原進(jìn)行對應(yīng)抗體的檢測，降低使用成本。

本方法對試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陽性及陰性對照血清的檢測效果良好，通過臨床試驗(yàn)樣品檢測證實(shí)該方法的相對敏感性為76.9% （30/39）， 相對特異性為90% （45/50）。 該方法的敏感性不高，分析原因與自然條件下豬感染的疾病較復(fù)雜，接觸的病原更具多樣性，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲等，產(chǎn)生的針對性抗體會與豬瘟抗體競爭結(jié)合于二抗，從而使該方法對臨床樣本的敏感性降低。

表1 不同濃度二抗、不同血清稀釋度CSFV抗體檢測結(jié)果

表2 不同封閉液CSFV抗體的檢測結(jié)果

表3 幾種陽性血清的交叉性試驗(yàn)

表4 兩種檢測方法的符合率試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)：

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[2]魏海燕,曾靜,張偉,等.ELISA檢測試劑盒在出入境檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用與質(zhì)控[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2015,25(4)：55-57.

[3]李紅梅,陳佳,徐斐,等.ELISA測定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2010(2)：126-130.

[4]張偉,傅溥博,高宏偉,等.ELISA操作注意事項(xiàng)及不確定度分量分析[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2015,25(4)：52-55.

[5]常婭莉,席仲興,吳智遠(yuǎn),等.鼠疫菌F1抗體雙抗原夾心ELISA診斷試劑盒的研制[J].中國生物制品學(xué)雜志,2013,26(12)：1801-1804.

[6]Mijung J,Byungki C,Young SC.Development of a Quantitative Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for De tecting the MPT64 Antigen of Mycobacterium tuberculosis[J].Yonsei Med J,2014,55(3)：746-752.

劉麗婭 （1984-），女，安徽省阜陽市人，助理研究員，主要從事動(dòng)物傳染病研究。*

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