栽培環(huán)境對鐵皮石斛生長與代謝成分的影響

林弋凱 朱玉球 斯金平 秦郞 諸燕 吳令上 劉京晶 ??

[摘要]為明確栽培環(huán)境對鐵皮石斛的生長及代謝成分的影響，對鐵皮石斛C13品系在巖壁附生、梨樹附生和設施盆栽3種栽培環(huán)境下進行形態(tài)特征、顯微結構、多糖和浸出物含量的觀察與分析。結果表明，生長環(huán)境顯著地影響鐵皮石斛的生長，在農藝性狀上，巖壁附生和梨樹附生的鐵皮石斛葉片稀少、顏色由綠變紫紅、伸展角度減小，莖稈多呈紫色、較粗壯，莖長分別為34，40 cm，普遍比設施盆栽（75 cm）短，且根系特別發(fā)達；在顯微結構上，野外生長的鐵皮石斛與設施栽培比均表現(xiàn)出葉片增厚、上表皮厚度增加、下表皮表皮毛叢生、氣孔小而密，根被細胞、外皮層、內皮層的細胞壁均偏厚，且根被、外皮層、內皮層、髓部的細胞小且排列緊密，但栽培環(huán)境沒有產生特異性的組織結構，主要是結構參數(shù)大小和數(shù)量的變化，說明鐵皮石斛具有很好的環(huán)境適應能力；此外，生長環(huán)境顯著地影響鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物等代謝成分的積累，巖壁附生鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量最高，質量分數(shù)分別達3734%，1166%，梨樹附生次之，質量分數(shù)分別為3390%，962%，均高于設施盆栽；通過HPLC分析，巖壁附生鐵皮石斛中醇溶性浸出物成分比另外2種栽培模式更加復雜，說巖壁附生栽培環(huán)境更有利于鐵皮石斛次生代謝產物的合成和積累。

[關鍵詞]鐵皮石斛； 栽培環(huán)境； 形態(tài)特征； 顯微結構； 代謝成分

Effects of cultivation environments on Dendrobium catenatum

LIN Yikai1， ZHU Yuqiu2， SI Jinping1*， QIN Lang2， ZHU Yan3，WU Lingshang1， LIU Jingjing1

（1State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang A & F University， Lin′an 311300， China；

2 Anhui Mulongshan Ecotourism Development Co， Ltd， Quanjiao 239500， China；

3Hangzhou Zhenheng Biotechnology Co， Ltd， Lin′an 311300， China）

[Abstract]The study was aimed to clarify the effect of three cultivation environments on the growth and metabolism of Dendrobium catenatum C13 group There were three different cultivation conditions including rock epiphytic cultivation， pear epiphytic cultivation and pot cultivation Morphological characteristics and agronomic characters of D catenatum were observed and measured Microstructure， contents of polysaccharide and alcoholsoluble extracts were measured by paraffin section method， phenolsulfuric acid method and hotdip method， respectively The result showed that the cultivation environment significantly affected the growth of D catenatum， the leaves of D catenatum that cultivated on the rock and pear were sparse and small， the stems were short and purple and the root system was developed Compare with potted cultivation， D catenatum from rock epiphytic cultivation and pear epiphytic cultivation showed the following characteristics in the microstructure： the upper epidermis became thicker， the epidermal hair in the epidermis became denser， stomatal showed smaller and denser， the cell wall of exodermis， endoderm and medulla became thicker， the cell of velamen， exodermis， endoderm and medulla were smaller and arranged more closely， but the cultivation environment did not produce specific tissue structure， mainly changed in the structural parameters of size and quantity The growth environments also influenced contents of polysaccharides and alcoholsoluble extracts The dontents of polysaccharides and alcoholsoluble extracts in D catenatum from rock epiphytic were the highest， reached 3734% and 1166%， the second was pear epiphytic， both higher than pot cultivation， alcoholsoluble extracts contents in D catenatum from rock epiphytic are more complex， which shows that rock epiphytic is conducive to the accumulation of secondary metabolites in D catenatumendprint

[Key words]Dendrobium catenatum； cultivition environment； morphological characteristics； microstructure； effective components

鐵皮石斛Dendrobium catenatum （D officinale）是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有增強免疫力、抗腫瘤、滋陰清熱、益胃生津等功效[13]。因過度采挖與生境破壞，野生鐵皮石斛資源已近枯竭。進入新世紀以來，隨著栽培技術不斷突破，鐵皮石斛產業(yè)發(fā)展迅猛，不同栽培模式應運而生[46]，栽培模式對鐵皮石斛生長與產品質量的影響成為關注的熱點。本文用鐵皮石斛C13品系，開展了設施盆栽、巖壁附生、活樹附生（梨樹）3種環(huán)境下外觀形態(tài)、顯微結構、代謝成分的變異規(guī)律的研究。

1材料與方法

11供試樣品

栽培品種為本課題組選育的鐵皮石斛C13品系[7]，2012年11月采集種子，在浙江農林大學組培室無菌播種，2013年8月瓶苗移栽到設施大棚馴化種植。2015年3月將大棚種植苗分別移栽至花盆、巖壁、梨樹栽培，進行統(tǒng)一的管理。

12儀器與試劑

UV2550紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；D37520快速離心機（德國Heraeus公司）；MilliQ Academic超純水儀（美國Millipore公司）；Leica熒光顯微鏡（DM4000）；無水乙醇和苯酚均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。碘和碘化鉀購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

13試驗地概況

試驗地位于浙江省臨安市天目山鎮(zhèn)橫塘村麻泥角弄（東經119°26′11″，北緯30°20′30″，海拔280 m），系鐵皮石斛自然分布區(qū)的北緣，常年年均氣溫164 ℃，其中2016年最高溫達37 ℃、最低溫達-10 ℃，降水日158 d，無霜期237 d，受寒潮、臺風等極端天氣的影響。

14栽培環(huán)境

141設施盆栽設施塑料薄膜連拱大棚高55 m，長寬均為40 m，遮陽率50%，2015年3月種植，塑料花盆上口直徑15 cm，高13 cm，擺放在高90 cm的移動苗床上，以松樹皮為基質，厚度為9～11 cm。種植平面2016年1月平均溫度達70 ℃，最低溫達-73 ℃；2016年7月平均溫度達293 ℃，最高溫達431 ℃。在鐵皮石斛的生長季節(jié)，晴天每天噴霧1～2 h，當鐵皮石斛越冬期時，每隔2～3 d噴霧1次，夏季加強棚內通風，減少病害的發(fā)生。

142巖壁附生2015年3月種植在高為2 m的90°的巖壁上，種植密度20 cm×20 cm，采用包裝帶固定至2015年9月，試驗地上方無遮擋物，栽培過程中不用任何基質，不施加任何肥料。種植后生長季節(jié)晴天每天噴霧1～2 h，通過水分調控改善環(huán)境的濕度與溫度，2016年1月巖壁附生栽培環(huán)境平均溫度為44 ℃，最低溫達-148 ℃；2016年7月平均溫度達300 ℃，最高溫達481 ℃。

143梨樹附生以梨樹為活樹附生的載體，2015年3月將鐵皮石斛附生于樹齡20年左右梨樹的樹干、樹枝、樹杈上，用梨樹的樹木枝葉進行遮陰，用麻繩綁住鐵皮石斛的根莖處，間隔30 cm捆1層，層內叢距8～10 cm，種植后生長季節(jié)晴天每天噴霧1～2 h。2016年1月梨樹附生栽培環(huán)境平均溫度為39 ℃，最低溫達-136 ℃；2016年7月平均溫度達298 ℃，最高溫達443 ℃。

15外觀形態(tài)與顯微結構觀察

2016年4月分別測定設施盆栽、巖壁附生、梨樹附生3種環(huán)境鐵皮石斛各個生理年齡的萌糵數(shù)量、莖節(jié)數(shù)，用直尺和數(shù)顯游標卡尺分別測量二年生、三年生萌糵的莖高和莖粗，測定二年生萌糵的葉片數(shù)量、葉片長度、葉片寬度、莖粗，5株為1組，重復3次。

采用常規(guī)石蠟切片法觀測葉片與根的顯微結構[8]，2016年8月分別采集3種環(huán)境鐵皮石斛葉片（從上向下數(shù)第4片葉）和根（距離根尖2～5 cm處），制作石蠟切片，采用番紅固綠復染法分別對材料進行染色，中性樹膠封片，Leica熒光顯微鏡進行觀察、拍照。

采用氣孔保衛(wèi)細胞染色體計數(shù)法方法觀測葉片氣孔的變化 2016年10月分別采摘鐵皮石斛葉片（從上向下數(shù)第4片葉），迅速放入裝有固定液（無水乙醇冰乙酸3∶1）的樣品瓶中，靜置至葉片褪色發(fā)白；將褪色的葉片剪成上、中、下三等分，取中部的葉片置于無菌水中，浸泡約3 min后取出，置于載玻片上，用1%碘碘化鉀溶液染色，蓋上蓋玻片后立即用Leica熒光顯微鏡觀測葉片的下表皮[9]。3個環(huán)境各設立3個重復，用Leica熒光顯微鏡在每張玻片中隨機采集5張圖片。用顯微鏡中的標尺測量每張圖片中每個氣孔保衛(wèi)細胞的長度、寬度和氣孔個數(shù)，用橢圓的周長近似公式計算葉片氣孔及2個保衛(wèi)細胞組成整體的外周周圍長（L）[10]。用SPSS 180軟件處理數(shù)據(jù)，并進行方差分析，標注顯著性差異結果。

16代謝成分分析

2016年4月25日分別采集3種栽培環(huán)境的鐵皮石斛二年生和三年生萌條，每個栽培環(huán)境采樣不少于25個萌條，每叢植株各采集1條二年生和三年生萌條，重復3次。將采集的樣品莖葉分離，100 ℃殺青后，置于60 ℃烘箱內烘至恒重，粉碎過60目篩后保存于干燥器中待用。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，根據(jù)2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅤA項下的熱浸法測定醇溶性浸出物含量。3種環(huán)境莖醇溶性成分參照朱波等的方法[11]。

2結果與分析

21栽培環(huán)境對鐵皮石斛形態(tài)特征與農藝性狀的影響

鐵皮石斛C13在設施盆栽、巖壁附生、梨樹附生3種環(huán)境中均能正常生長發(fā)育，但環(huán)境條件對形態(tài)特征與農藝性狀影響十分明顯（表1）。

從表1可見，3種環(huán)境的莖稈長度差異明顯，設施盆栽的二年生平均株高75 cm，明顯高于梨樹附生和巖壁附生的34，40 cm，3種環(huán)境莖粗沒有顯著差異；設施盆栽葉片繁茂且顏色呈深綠色，莖稈呈淺綠色，巖壁附生和梨樹附生葉片稀少，葉片長和寬明顯小于設施盆栽，二年生莖稈和葉片的顏色多呈紫紅色，說明設施栽培的遮陽功能有利于莖稈的高生長，巖壁附生和梨樹附生因陽光直射影響葉片色素的合成與比例大小。endprint

3種環(huán)境的根系分布存在顯著差異：設施盆栽根系直立向下，多數(shù)扎在基質之中；巖壁附生的根系特別發(fā)達，根系呈扁平狀、無吸盤，緊貼著巖壁向四周發(fā)散，根系偶有分叉；梨樹附生的根系多數(shù)彎曲的扎入梨樹樹皮中，體現(xiàn)了鐵皮石斛根對3種環(huán)境的生態(tài)適應性（圖1）。

22栽培環(huán)境對鐵皮石斛顯微結構的影響

221栽培環(huán)境對葉的影響鐵皮石斛的葉片由表皮、葉肉和葉脈3部分組成，3種不同環(huán)境的鐵皮石斛葉的上、下表皮均有1層近方形的生活細胞組成，上表皮細胞略大于下表皮細胞，上表皮無表皮毛、下表皮表皮毛叢生。氣孔僅分布于下表皮，不同栽培環(huán)境下葉片解剖結構主要參數(shù)存在顯著差異（表2）。

從表2可見，大棚栽培的氣孔長、外周長平均達到3625，13750 μm，均極顯著高于巖壁栽培和梨樹附生，而3個栽培環(huán)境之間的氣孔寬差異不顯著。梨樹附生、巖壁附生、大棚栽培的氣孔密度分別每平方毫米為10235，7053，5348個，三者存在極顯著差異。氣孔密度與外周長呈現(xiàn)負相關關系，氣孔外周長越大，氣孔密度就越?。▓D2）。為適應野外強光和干旱環(huán)境，氣孔密度明顯增大、氣孔周長減小。

3種栽培環(huán)境的鐵皮石斛葉肉均沒有明顯分化為海綿組織和柵欄組織，巖壁附生和梨樹附生的葉片厚度、葉肉厚度、上表皮厚度均顯著大于大棚栽培

從圖4可見，生長于3種環(huán)境的鐵皮石斛根的根被細胞層數(shù)不同。梨樹附生和巖壁附生的鐵皮石斛根被細胞層數(shù)為3～4層，而大棚栽培的根被細胞層數(shù)為3～7層、排列不規(guī)則，且最外層多了一層排列緊密的生活細胞；巖壁附生和梨樹附生的細胞壁明顯加厚，且?guī)r壁附生的細胞壁表現(xiàn)為最厚。大棚栽培的鐵皮石斛根被層里的細胞大、排列疏松；巖壁附生和梨樹附生的根被層里的細胞小且排列緊密，且在根與巖壁或梨樹的接觸面的細胞表現(xiàn)的最為明顯。

3種環(huán)境鐵皮石斛的外皮層均由一層徑向延長、排列緊密的馬蹄形細胞組成且細胞壁加厚，中間偶爾夾雜著幾個近方形的通道細胞，是植物養(yǎng)分和水分的交換通道。但大棚栽培的外皮層細胞較巖壁附生和梨樹附生的細胞大且排列疏松。巖壁附生和梨樹附生的外皮層與大棚栽培有明顯的差異，在與巖壁或梨樹的接觸面，外皮層細胞呈直線排列且極為緊密，而大棚栽培的地下根的外皮層整體呈類圓形，充分體現(xiàn)了鐵皮石斛對不同環(huán)境的適應性。大棚栽培的皮層薄壁細胞均比其他環(huán)境小且排列疏松。

皮層以內，根的中心部分為中柱，由中柱鞘、維管束和髓組成。3個不同環(huán)境鐵皮石斛的維管束結構有顯著差異。生長于3個不同的環(huán)境，木質部的發(fā)育程度也不同，大棚栽培的木質化程度最高，占中柱的比例最大。

23栽培環(huán)境對鐵皮石斛代謝成分的影響

231栽培環(huán)境對鐵皮石斛多糖和浸出物的影響多糖和醇溶性浸出物含量是鐵皮石斛主要的有效成分，是評價鐵皮石斛品質的主要指標，栽培環(huán)境顯著地影響多糖和浸出物的含量（表3）。

從表3可見，梨樹附生和巖壁附生的鐵皮石斛二年生和三年生多糖和醇溶性浸出物含量均高于設施盆栽，且?guī)r壁附生的多糖含量最高，二年生和三年生多糖質量分數(shù)分別達到3734%，3663%比設施盆栽高447%，1047%；醇溶性含量比設施盆栽高353%，263%。鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量與生理年齡密切相關，3個環(huán)境的鐵皮石斛二年生多糖含量均顯著高于三年生。設施盆栽、梨樹附生、巖壁附生二年生多糖含量比三年生分別高661%，358%，071%。二年生和三年生巖壁附生的多糖和醇溶性浸出物總量最高，均高于設施盆栽和梨樹附生。

232栽培環(huán)境對鐵皮石斛莖醇溶性成分的影響通過HPLC分析，3個栽培環(huán)境的鐵皮石斛莖醇溶性成分有明顯差異（圖5）。巖壁附生的鐵皮石斛特征峰最多，達10個，其中，6，12，13，14號峰分離度較好，且是巖壁附生獨有的差異特征峰，4，5，8號峰是大棚栽培特有的特征峰；1，2，3號峰為梨樹附生特有的特征峰，而11號峰是生長于3種環(huán)境下鐵皮石斛莖共有的特征峰，其三年生峰面積均高于二年生，說明該成分的含量隨著年份的增加而累積。

3結論與討論

生長環(huán)境顯著地影響鐵皮石斛的生長，野外惡劣環(huán)境下巖壁附生和梨樹附生的鐵皮石斛整叢植株逐漸變成紫紅色，而且葉片稀少、伸展角度的減小，莖條粗壯矮小，根系特別發(fā)達，生物量明顯低于設施盆栽；野生環(huán)境下的鐵皮石斛在組織結構上明顯不同于設施栽培，均表現(xiàn)出葉片增厚、上表皮厚度增強、下表皮表皮毛叢生、氣孔小而密，根被細胞、外皮層、內皮層的細胞壁偏厚，且根被、外皮層、內皮層、髓部的細胞小且排列緊密，以利于增強保溫作用、減少水分蒸騰、降低強光在葉肉的通量、減少強光對葉表皮的損傷、有利于提高水分利用效率、維持光合效率，體現(xiàn)出鐵皮石斛對野外低溫、強光環(huán)境的適應性。

次生代謝物質積累與環(huán)境關系密切[12]，在3種生長環(huán)境下，巖壁附生鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量最高，梨樹附生次之，均高于設施盆栽。說明巖壁附生的栽培環(huán)境更有利于鐵皮石斛次生代謝產物的積累；另外，巖壁附生鐵皮石斛中醇溶性物質組成比另外2種栽培模式樣品復雜，不同的野外環(huán)境影響植物的次生代謝途徑，導致次生代謝產物組成不同。

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[責任編輯呂冬梅]endprint