5p部分單體3例全基因組拷貝數(shù)變異分析

楊 琳 倪錦文 詹國(guó)棟 王慧君 陳 超 黃國(guó)英 周文浩

Cri du chat綜合征(貓叫綜合征、5p缺失綜合征)在活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率為1/15 000～1/50 000，見(jiàn)于所有種族的人群[1],其中約1%患兒有嚴(yán)重智力低下(IQ<20)[1]。Cri du chat綜合征是由于5號(hào)染色體短臂末端的缺失所致，但缺失的片段大小在不同患兒中相差很大，最小可僅包含5p15.2，最大可累及整個(gè)短臂。有研究認(rèn)為p15.2缺失與發(fā)育遲緩相關(guān)，p15.3缺失與貓叫樣哭聲和語(yǔ)言發(fā)育障礙相關(guān)，且大片段的缺失引起的智力低下和發(fā)育遲緩更為嚴(yán)重[2]。但也有學(xué)者提出除片段大小外，還有其他因素決定表型[3]，缺失片段位于末端(5p15.33)，包含端粒逆轉(zhuǎn)錄酶基因(TERT)，可能與表型相關(guān)[4]。也有研究提示位于p15.2的CTNND2基因的缺失與嚴(yán)重智力障礙有關(guān)[5]。但由于之前研究技術(shù)所限，定位欠精確，并且在缺失范圍內(nèi)其他基因的作用、在缺失范圍外其他拷貝數(shù)變異(CNVs)的作用尚不清楚。

2004年CNVs報(bào)道以來(lái)[6]，因其在基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)遠(yuǎn)大于單核苷酸多態(tài)性(SNP)而倍受關(guān)注，CNVs正不斷被用以解釋很多復(fù)雜疾病，如智力低下、孤獨(dú)癥和多發(fā)畸形等。比較基因組雜交芯片(CGH)和SNP芯片技術(shù)的應(yīng)用日趨增多，使得疾病關(guān)鍵區(qū)域的定位更為準(zhǔn)確，建立精確表型基因型關(guān)聯(lián)性的可能性不斷增加。本研究的目的在于通過(guò)對(duì)具有部分相同基因型(5p部分缺失)病例的分析，建立罕見(jiàn)潛在致病性CNVs合理的篩選和分析流程，進(jìn)一步解釋Cri du chat綜合征的表型基因型關(guān)聯(lián)性。

1 方法

1.1 病例來(lái)源 2009年6月至2010年5月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院新生兒病房收治的3例染色體核型分析提示為Cri du chat綜合征的患兒。

1.2 倫理學(xué) 本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書(shū)后進(jìn)入本研究。

1.3 臨床資料采集 包括：一般情況(性別、胎齡和出生體重等)、Cri du chat綜合征特征性表現(xiàn)(哭聲等)、特殊面容、指趾畸形、合并先天性疾病的情況等。

1.4 全基因組CNVs檢測(cè)

1.4.1 DNA提取 取外周靜脈血經(jīng)EDTA抗凝，使用FUJI公司QuickGene-Mini80及DNA全血試劑盒，從全血樣本中提取DNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及吸光度值，電泳檢測(cè)DNA降解程度。

1.4.2 芯片檢測(cè) 取基因組DNA 3～5 μg進(jìn)行微陣列芯片檢測(cè)。采用Affymetrix公司Cytogenetic Whole-Genome 2.7M 芯片。采用Chromosome Analysis Suite (ChAS)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。

1.5 CNVs片段的篩選步驟 ①ChAs軟件分析的結(jié)果中，選擇重復(fù)片段>150 kb，缺失片斷>50 kb的CNVs數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步分析；②對(duì)照原始圖像除外假陽(yáng)性結(jié)果；③除外在國(guó)際基因組拷貝數(shù)變異多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(DGV)中報(bào)道為正常人群的CNVs(片段至少有80%以上的重合，且重復(fù)或缺失類型相同)；④除外片段區(qū)域內(nèi)不包含基因的CNVs。

1.6 臨床表型基因型關(guān)聯(lián)性分析 搜索DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的5p部分缺失病例(不包含除5p外的CNVs)，CNVs片段有較大重合病例的臨床表現(xiàn)及基因型信息，結(jié)合本研究3例與DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道的Cri du chat綜合征患兒的臨床表型，進(jìn)行5p缺失大小及范圍分析，對(duì)重復(fù)區(qū)域行候選基因分析。

2 結(jié)果

2.1 CNVs篩選 分析ChAs軟件結(jié)果中，選取重復(fù)片段>150 kb，缺失片段>50 kb的CNVs，共29個(gè)CNVs片段，除外4個(gè)假陽(yáng)性CNVs、11個(gè)DGV上報(bào)道為正常人群CNVs和3個(gè)不包含基因的CNVs，獲得罕見(jiàn)具有潛在臨床意義的CNVs共11個(gè)(圖1)。

圖1 CNVs的篩選步驟

Fig 1 Flow chart of CNVs selection procedure

11個(gè)CNVs片段大小在66～31 328 kb，其中缺失為9個(gè)(81.2%)，重復(fù)為2個(gè)(18.2%)。例1有3個(gè)CNVs位于5p，且位置相近，故連接為1個(gè)片段進(jìn)行分析；例2有4個(gè)CNVs位于5p，且位置相近，連接為1個(gè)片段；1個(gè)CNVs位于9p；例3有2個(gè)CNVs位于5p，且位置相近，連接為1個(gè)片段；1個(gè)CNVs位于7p。最終得到5個(gè)CNVs，基本特征見(jiàn)表1，缺失或重復(fù)情況見(jiàn)圖2。

表1 3例Cri du chat綜合征患兒篩選出的CNVs的基本特征

圖2 3例Cri du chat綜合征患兒的缺失和重復(fù)

Fig 2 Deletions and duplications of 3 patients by Affymetrix array

Notes Each probe represented a single dot and plots on X axis according to its genome position.Duplication/deletion was shown respectively as up/down dot according to the base line.The blue/red bar represented the affected region.A: 31 866 kb deletion in 5p15.33-13.3 in case 1; B: a 15 552 kb deletion in 5p15.33-15.1 in case 2; C: 31 328 kb duplication in 9p24.3-21.1 in case 2; D: 19 312 kb deletion in 5p15.33-14.3 in case 3; E: 3 217 kb duplication in 7p22.3-22.2 in case 3

2.2 臨床表型 例1為女性，例2和3均為男性。例1有宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、Cri du chat綜合征特征性的高調(diào)哭聲、先天性心臟病(右室雙出口、室間隔缺損、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉和肺動(dòng)脈高壓)和指趾畸形；例2有宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、先天性喉軟骨發(fā)育不良、特殊面容(眼距過(guò)寬、雙眼下斜和耳位異常)、末指兩節(jié)畸形和單一掌紋畸形(通貫掌)(圖3)；例3有哭聲異常(為外院轉(zhuǎn)入病例，描述為生后哭聲異常)、高腭弓，有先天性巨結(jié)腸(表2)。

DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到CNVs片段與本組病例較大重合的Cri du chat綜合征患兒有5例(編號(hào)為249537、249606、249117、249796和251341)，其臨床表型如表1所示，其中4例存在發(fā)育遲緩或智力低下，1例有Cri du chat綜合征特征性的高調(diào)哭聲，3例(編號(hào)為249796、249537和249606)表現(xiàn)為鼻音重，2例(編號(hào)為249117和249537)有特殊面容，表現(xiàn)為眼瞼過(guò)小、眼睛深陷和小耳，伴指趾畸形。

圖3 例2患兒特殊面容及掌指畸形

Fig 3 The facial features and deformities of palma and finger in case 2

Notes A:facial features of case 2 including hypertelorism, blepharo-phimosis, low set right ear; B: two sections of right little finger, single palmar crease

表2 本研究3例和DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)5例Cri du chat綜合征的臨床表現(xiàn)

Notes GA:gestational age; MR/DD:mental retardation/developmental delay; CHD: congenital heart disease; HD:hirschsprung's disease; 1)at initial presentation; 2)two outflows of right ventical; 3)three sections of right thumb;4)two sections of little finger;5) thin upper lip,thin/long face

2.4 臨床表型基因型相關(guān)性分析 本組3例和DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)中5例Cri du chat綜合征患兒的5p缺失大小及位置見(jiàn)圖4，區(qū)域1為異常哭聲的重復(fù)區(qū)域，區(qū)域2為異常面容的重復(fù)區(qū)域。進(jìn)一步分析重復(fù)區(qū)域1的基因，覆蓋IRX1、IRX2和ADAMTS16等基因(圖5)，重復(fù)區(qū)域2覆蓋DNAH5、TRIO和ANKH等基因(圖6)。

圖4 本組3例及DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)中5例Cri du chat綜合征患兒5p缺失大小及范圍

Fig 4 Characteristics of the 5p deletion and sizes of both 3 cases and 5 DECIPHER patients

Notes 1: overlapping region of cases with abnormal cry or voice; 2: overlapping region of cases with facial deformation

圖5 重合區(qū)域1范圍內(nèi)包含的候選基因

Fig 5 Covered candidate genes in the overlapping region 1

Notes:In the top panel, an ideogram showed deletion band of chromosome 5p15.33-15.31.In the middle panel, six green bars represented overlapping deleted region in six cases.Bottom panel showed affected genes in this region

圖6 重合區(qū)域2范圍內(nèi)包含的候選基因

Fig 6 Covered candidate genes in the overlapping region 2

Notes In the top panel, an ideogram showed deletion band of chromosome 5p15.2-15.1.In the middle panel, five green bars represented overlapping deleted region in five cases.Bottom panel showed affected genes in this region.The blue bars represented OMIM genes and red bars represented morbid OMIM genes

3 討論

Cri du chat綜合征的典型臨床表現(xiàn)有：低出生體重和生長(zhǎng)遲緩、智力發(fā)育遲緩和運(yùn)動(dòng)發(fā)育延遲；哭聲高調(diào)、尖銳似貓叫；小頭、小下頜畸形、眼距寬、內(nèi)眥皺褶、眼睛下斜、耳低位或形狀異常；并指(趾)和異常掌紋(通貫掌)[9]。15%～20%患兒伴有先天性心臟病[10]。在新生兒，典型貓叫樣哭聲是最具特征性的表現(xiàn)，通常在數(shù)個(gè)月或數(shù)年后消失。也有不具備此特征性表現(xiàn)患兒的報(bào)道，且貓叫樣哭聲還可見(jiàn)于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，故而不能作為特征性診斷指標(biāo)。此外缺氧發(fā)作、青紫和吸氣性喉鳴等表現(xiàn)亦見(jiàn)于部分Cri du chat綜合征病例。本病多數(shù)發(fā)生于卵子或精子的發(fā)育過(guò)程或胚胎發(fā)育早期，僅10%的患兒是由于父母一方攜帶有5號(hào)染色體的平衡易位[9]。

本組3例均表現(xiàn)為哭聲異常，表現(xiàn)為高調(diào)哭聲或哭聲弱伴吸氣性喉鳴，DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)中5例患兒有3例表現(xiàn)為高調(diào)哭聲或鼻音重。Zhang等[18]報(bào)道特殊哭聲的關(guān)鍵區(qū)域位于5p15.31的末端；Church等[19]報(bào)道癥狀不典型的5p部分單體患兒貓叫樣哭聲關(guān)鍵區(qū)域位于5p15.2末端；Mainardi等[3]報(bào)道典型貓叫樣哭聲的關(guān)鍵區(qū)域位于5p15.3。本研究基因分析結(jié)果顯示，重合區(qū)域?yàn)?p15.33-15.31，大小為3.86 Mb，與上述文獻(xiàn)報(bào)道并不一致。5p15.33-15.31可能為哭聲和聲音異常的關(guān)鍵區(qū)域，覆蓋基因IRX1、IRX2和ADAMTS16等候選基因。IRX1和IRX2均屬于Iroquois同源基因家族，該家族的基因與脊椎動(dòng)物的胚胎形成相關(guān)。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，該基因家族與胚胎神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的前-后軸、背-腹軸模式化的形成相關(guān)，并與耳的發(fā)育及肢體的形成相關(guān)[11]。目前未見(jiàn)與咽、喉部等影響哭聲及構(gòu)成發(fā)音的部位發(fā)育相關(guān)的報(bào)道。ADAMTS16基因編碼產(chǎn)物為鋅依賴的金屬蛋白酶，主要表達(dá)于腎臟，為血壓調(diào)節(jié)的候選基因[12]，未見(jiàn)與發(fā)育等相關(guān)報(bào)道。

本研究1例(例2)和 DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)2例患兒均表現(xiàn)為特殊面容。本研究基因分析結(jié)果顯示，重疊區(qū)域?yàn)?p15.1-15.2，大小為2.51 Mb，可能為5p部分單體特殊面容的關(guān)鍵區(qū)域。該區(qū)域包含DNAH5、TRIO和ANKH基因。DNAH5編碼微管相關(guān)動(dòng)力蛋白復(fù)合物的重鏈部分，該基因的突變與纖毛動(dòng)力缺乏相關(guān)，可引起反復(fù)呼吸道感染及精子活動(dòng)力缺乏[13]。TRIO的編碼蛋白質(zhì)有3個(gè)功能區(qū)，1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶功能區(qū)和2個(gè)鳥(niǎo)嘌呤交換因子功能區(qū)，這些功能區(qū)提示該蛋白可能參與多個(gè)信號(hào)通路，并調(diào)控細(xì)胞的增殖。Ferraro等[14]通過(guò)在大鼠和小鼠模型上調(diào)該基因，發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中分泌型顆粒的成熟相關(guān)，這2個(gè)基因目前尚無(wú)與特殊面容相關(guān)的功能學(xué)方面的報(bào)道。ANKH編碼一多通道跨膜蛋白，介導(dǎo)調(diào)控焦磷酸水平，故而可能參與組織鈣化，并為高等動(dòng)物關(guān)節(jié)炎的易感因素[15]，該基因的突變與顱骨干骺端發(fā)育不良及軟骨鈣質(zhì)沉著病相關(guān)[16，17]，可能與特殊面容等表型具有相關(guān)性。此外，文獻(xiàn)報(bào)道小頭畸形和智力發(fā)育遲緩關(guān)鍵區(qū)域也位于5p15.2，因本研究納入均為新生兒病例，故無(wú)法評(píng)價(jià)是否存在智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和語(yǔ)言障礙，無(wú)法對(duì)相應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行分析。

本研究還發(fā)現(xiàn)，例2除5p部分缺失外，還有9p24.3-p21.1片段的重復(fù)。9p全部或部分三體報(bào)道較少，迄今尚不足200例[20]，且多數(shù)報(bào)道合并有其他染色體的缺失。9p部分或全部重復(fù)的典型表型有智力發(fā)育遲緩、小短頭畸形、眼窩深、眼距寬且眼裂下斜、寬鼻、鼻尖圓、嘴角下斜、低位耳、手腳的畸形和骨齡延遲等[21～25]。有報(bào)道9p部分重復(fù)與表型相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域?yàn)?p22.1和9p22.2[26]，與本研究例2缺失的區(qū)域一致。例2存在眼距寬、耳位低，與9p部分重復(fù)癥狀符合，但該異常面容亦為5p部分缺失的表型；例2同時(shí)有指、趾畸形，與9p重復(fù)表型相符，但不為5p部分缺失的表型。但例2尚處于新生兒期，特征性面部表現(xiàn)不典型，且智力、語(yǔ)言發(fā)育情況尚不能評(píng)估。故例2可能同時(shí)存在5p部分缺失與9p部分重復(fù)。

例3除5p部分缺失外，還發(fā)現(xiàn)7p22.3內(nèi)有3 217 kb的重復(fù)。7p22.3為較大片段重復(fù)，檢索相關(guān)文獻(xiàn)，7p部分重復(fù)較罕見(jiàn)，可表現(xiàn)為智力發(fā)育遲緩、前囟大、眼距過(guò)寬、低位耳、腭異常、心血管異常、骨骼肌肉畸形和異常掌紋[27，，28]。本組例3的主要表型為先天性巨結(jié)腸，與既往研究報(bào)道不一致。先天性巨結(jié)腸染色體異常多見(jiàn)于唐氏綜合征[29]、13q22(EDNRB)缺失[30]、10q11.2(RET)缺失[31]和2q22(ZFHX1B)[32]缺失相關(guān)，單基因及非綜合征的先天性巨結(jié)腸與4p12(PHOX2B)、5p13.1-p12(GDNF)、20q13.2-q13.3(EDN3)、11p13(BDNF)、9p21-p12(RMRP)、22q13(SOX10)、10q11.2、19p13.3和1p36.1等多基因、多區(qū)域相關(guān)。但例3患兒的CNVs累及區(qū)域均不在相關(guān)位點(diǎn)中，是否這些區(qū)域亦為先天性巨結(jié)腸的關(guān)鍵區(qū)域或包含有關(guān)鍵的致病基因有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究采用罕見(jiàn)CNVs的分析方法，得到如下結(jié)論和啟示：①對(duì)于多發(fā)畸形患兒進(jìn)行全基因組CNVs分析能發(fā)現(xiàn)常規(guī)G帶染色體核型分析所不能發(fā)現(xiàn)的異常，尤其對(duì)于表型不典型且部分表型辨別困難的新生兒提供了早期診斷的可能；②為5p部分缺失建立表型-基因型的關(guān)聯(lián)性提供幫助，并提出了新的可能與疾病相關(guān)的候選基因；③本研究報(bào)道了1例可能同時(shí)存在5p部分缺失和9p部分重復(fù)的患兒。④為先天性巨結(jié)腸提供了未報(bào)道的可能相關(guān)區(qū)域。由于病例數(shù)量較少，上述發(fā)現(xiàn)需要擴(kuò)大樣本量的驗(yàn)證及進(jìn)一步的相關(guān)基因功能的研究。

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