一株抗白葉枯病菌的嗜溫菌的代謝物組成分析*

張 君， 張 靜， 張 曉， 樊凌志， 孫梅好， 鞏菊芳， 蒲首丞

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

一株抗白葉枯病菌的嗜溫菌的代謝物組成分析*

張 君， 張 靜， 張 曉， 樊凌志， 孫梅好， 鞏菊芳， 蒲首丞

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

為分析抑制白葉枯病菌生長的嗜溫芽孢桿菌(TH07)的代謝產(chǎn)物組成成分，對TH07的生長條件進(jìn)行了優(yōu)化，并利用紅外光譜與核磁共振氫譜分析了TH07代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物.基于響應(yīng)面方法的優(yōu)化，得到了該菌的最佳生長條件：初始培養(yǎng)基pH為9，1 000 mL錐形瓶裝液量為381 mL，接種量為6.37%(體積比).在上述條件下培養(yǎng)TH07，用乙酸乙酯萃取得到該菌的代謝產(chǎn)物，紅外光譜與核磁共振氫譜對粗提物的分析結(jié)果表明：粗提物里含有小肽類物質(zhì)、芳香族化合物或乙酰胺的芳香族化合物，可能是這些化合物參與了抑制白葉枯菌的生長.

響應(yīng)面優(yōu)化；白葉枯病菌；嗜溫芽孢桿菌；抑菌活性

水稻白葉枯病是一直以來影響水稻產(chǎn)量的主要病害之一，該病害分布范圍廣泛，危害嚴(yán)重.目前，水稻白葉枯病已危及到了世界各個水稻生產(chǎn)地，其中南亞和東南亞的水稻受害最為嚴(yán)重[1].水稻一旦感染該病菌,將會導(dǎo)致20%～40%[2]的產(chǎn)量損失.作為水稻病害主要的防治措施，化學(xué)防治仍舊存在諸多弊端，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用不僅對人體健康造成很大的危害，也會嚴(yán)重地污染環(huán)境，長期使用還會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性.微生物防治因其成本低、污染小、效果持久穩(wěn)定[3-4]而被廣泛應(yīng)用到植物病害的防治中.因此，從自然界中尋找抗水稻白葉枯病的菌株已是植物保護(hù)方面的研究熱點(diǎn)之一，具有重大的意義[5-6].

本實(shí)驗(yàn)室已在前期通過高溫篩選從土壤中得到了一株嗜熱芽孢桿菌TH07，實(shí)驗(yàn)證明，TH07的乙酸乙酯粗提物對白葉枯病菌具有明顯的抑制作用.為了進(jìn)一步研究TH07抑制白葉枯菌生長的具體的活性成分，本文做了大量的前期工作.首先，利用響應(yīng)面方法優(yōu)化了TH07的生長條件，提高菌株的生長量，以便后期更好地研究其抗菌物質(zhì)；另外，借助紅外光譜與核磁共振氫譜技術(shù)對TH07的代謝物成分進(jìn)行了初步的分析，為后期繼續(xù)分離鑒定TH07的有效活性成分奠定了一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試細(xì)菌

供試生防菌：嗜熱芽孢桿菌(TH07)，自行分離于浙江師范大學(xué)校區(qū)土壤，于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存.

供試病原菌：水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)為菲律賓6號小種(PR6)，本實(shí)驗(yàn)室提供，保存在-80 ℃冰箱中.

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然 pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

NA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，蔗糖10 g，牛肉膏3 g，瓊脂10 g，蒸餾水1 000 mL，自然 pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

紅外光譜儀(NEXUS 智能傅里葉，美國尼高力公司)；核磁共振波譜儀(NMR AV600，瑞士布魯克公司).

1.4 濾紙片法

參照文獻(xiàn)[7].

實(shí)驗(yàn)中采用濾紙片方法測試TH07的乙酸乙酯粗提物(甲醇溶解，50 mg/mL)對白葉枯菌的抑菌圈直徑大小，所用的直徑為5 mm濾紙片已進(jìn)行滅菌處理，每個平板均勻放置3個濾紙片，其中2片浸入藥液，另一片浸入甲醇作為對照.具體操作如下：

吸取0.2 mL白葉枯菌液(A600=0.75)，均勻涂布到NA培養(yǎng)基平板上；用無菌鑷子夾取浸入藥液和甲醇的濾紙片均勻貼在涂有菌液的平板培養(yǎng)基上；將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后記錄分析結(jié)果，用十字交叉法測量抑菌圈直徑大小(含濾紙片直徑5 mm).實(shí)驗(yàn)分3組并重復(fù)3次取平均值.

1.5 試管二倍梯度稀釋法

對照文獻(xiàn)[8-9].

取已滅菌的試管若干，從1開始編號.向1號試管中加入10 mL NA培養(yǎng)基，向另外5支試管里加入5 mL NA培養(yǎng)基；再向1號試管中加入0.02 g TH07乙酸乙酯萃取物，充分混勻；按照二倍稀釋的方法，從1號試管中吸取5 mL液體加于2號試管中，充分混勻，依次進(jìn)行，第5號試管中取出的5 mL液體棄去，6號試管為空白對照；向上述6支試管中分別接入100 μL已稀釋的白葉枯菌的菌液，28 ℃培養(yǎng)16 h，觀察現(xiàn)象，記錄澄清無菌生長的藥液濃度即為最小抑菌濃度，測定所有試管中的液體在600 nm波長處的吸光度值.

1.6 紅外光譜法[10-11]

將乙酸乙酯萃取得到的TH07代謝粗提物放在真空干燥箱中50 ℃干燥至恒重，冷卻到室溫后備用.KBr壓片制樣:取樣品10 mg研磨成2 μm以下的粉末后均勻分散到KBr中，用壓片機(jī)制成薄片.開始測試，分別進(jìn)行背景采集和樣品信息采集，條件：4 cm-1的分辨率，400～4 000 cm-1范圍內(nèi)室溫下掃描16次.

1.7 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響TH07菌株生長的因素很多，在進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)前選取3個對該菌生長影響相對較大的因素，分別為起始pH、接種量和裝液量.

按照體積比為1%，2%，3%，4%，5%，6%和7%的接種比例，將TH07菌液接種到500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，55 ℃ 搖床培養(yǎng)36 h，之后于波長600 nm處測定吸光度值.

以1%的接種量接種TH07到500 mL LB液體培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)前已經(jīng)調(diào)節(jié)不同的pH(7.0，8.0，8.5和9.0)，于55 ℃搖床培養(yǎng)36 h后測吸光度A600.

以1%接種量接種TH07菌液分別于100，200，300，400和500 mL LB培養(yǎng)基中，保證相同的pH，同樣55 ℃搖床培養(yǎng)36 h后測吸光度A600.

以上所有實(shí)驗(yàn)均在1 000 mL的搖瓶中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次后取平均值.

1.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定出起始pH、接種量和裝液量3個因素的合適的取值范圍，再根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以起始pH、裝液量和接種量為自變量，以TH07的吸光度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)，擬合自變量與響應(yīng)值之間的模型方程[12].

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)

圖1為TH07乙酸乙酯粗提物對水稻白葉枯菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果.從圖1(a)可以看出，圖片上方2個浸入藥液的濾紙片周圍無菌生長，圖片下方浸入甲醇的濾紙片周圍長滿菌.可見，TH07粗提物對白葉枯菌有明顯的抑制作用，通過十字交叉法測量了3組實(shí)驗(yàn)的平均抑菌圈直徑達(dá)到(17.800±0.350) mm(含濾紙片直徑5 mm).圖1(b)顯示了試管二倍稀釋法的結(jié)果，隨著藥液濃度的增大，菌體濃度呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，加入藥液的濃度為1.00 mg/mL時，試管里的液體是完全澄清的，3次結(jié)果基本一致，通過分光光度計(jì)測得A600平均值為0.043 0±0.001 8，基本上沒有白葉枯菌生長，此時的濃度即為最小抑菌濃度.

在答卷提交設(shè)置里，可以設(shè)置基礎(chǔ)顯示: 實(shí)時排名、答題人和總得分、作答題目和正確答案。評語設(shè)置里可以根據(jù)答題得分情況設(shè)置一些俏皮幽默的評語，學(xué)生成功提交答卷后，即可根據(jù)得分情況，看到不同評語，有助于增強(qiáng)答卷成就感，拉近師生感情，提高答卷興趣。經(jīng)費(fèi)充足的科室也可根據(jù)需要設(shè)置獎品和紅包，通過身份驗(yàn)證的學(xué)生可以獲得隨機(jī)紅包及獎品。

圖1 TH07代謝物對白葉枯菌的抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2 單因素條件實(shí)驗(yàn)

圖2～圖4是單因素條件對TH07生長的影響.分析各圖，選擇最高點(diǎn)作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)點(diǎn)，最

終確定為pH 8.5，裝液量300 mL，接種量6%，在這3個條件下,A600分別為 0.703 0±0.006 5，0.504 0±0.003 4和0.722 0±0.000 7，達(dá)到最大.

圖2 裝液量對菌株TH07生長的影響

圖3 起始pH對TH07生長的影響

圖4 接種量對菌株TH07生長的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面因素與水平

通過以上單因素實(shí)驗(yàn)，確定了起始pH、接種量和裝液量這3個因素的水平范圍，應(yīng)用Box-Behnken模型設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)如表1所示.

2.3.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)共分17組，其中包括12個析因點(diǎn)、5個中心點(diǎn)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以TH07的A600為響應(yīng)值[13].實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2.

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.3.3 回歸模型與顯著性

利用Design Expert 8.0.6.1對表3中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，模擬出TH07的A600對起始pH、裝液量和接種量的多元二次回歸方程模型：

A600= 0.64+0.009 5A+0.008 125B+

0.078C+0.006AB+0.011AC+

0.003 25BC-0.022A2-

0.008 625B2+0.064C2.

其中:A為pH;B為裝液量;C為接種量.

響應(yīng)面的二次模型方差分析結(jié)果如表3所示，P與F值表明該模型是高度顯著的(P<0.000 1).R2為99.18%，表明該模型可以解釋總變異的99.18%，調(diào)整后的決定系數(shù)R2Adj為98.12%，也足以證明模型有很高的擬合度[14].表3中模型失擬項(xiàng)P值為0.225 0，大于0.05，模型的失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型較準(zhǔn)確[15].

分析回歸方程系數(shù)的顯著性可知:一次項(xiàng)A,B和C均顯著;二次項(xiàng)A2和C2顯著，B2不顯著;交互項(xiàng)AB，AC和BC均不顯著[16].方差分析表明，影響菌株生長的顯著性因素是：接種量>初始pH>裝液量.

2.3.4 優(yōu)化結(jié)果與驗(yàn)證

為了得到最大的TH07菌株生長量，筆者采用Design-Expert里的Box-Behnken模型進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到了最佳組合條件：裝液量為381 mL，接種量為6.37%，pH為9.模型預(yù)測的響應(yīng)值為0.789，結(jié)果比之前提高了22.52%.上述顯著性分析已證明該模型是顯著的.為了確認(rèn)模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)又做了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在優(yōu)化的最佳條件下，55 ℃培養(yǎng)36 h后測吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次得到的平均值為0.803，相對誤差為1.77%，說明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值擬合良好，結(jié)果是可信的.所以，上述優(yōu)化模型適用于TH07菌株的實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)[17].

2.4 TH07代謝產(chǎn)物的組成成分分析

圖5 TH07代謝物的紅外光譜

圖6 TH07代謝物的二階紅外導(dǎo)數(shù)光譜

TH07代謝物的核磁共振氫譜(CD3OD,600 MHz)顯示：高場處主要是甲基、亞甲基和次亞甲基的氫信號，化學(xué)位移在3.8～4.8,說明化合物中含有強(qiáng)吸電子的原子或基團(tuán)；低場區(qū)出現(xiàn)的幾組峰δH：7.423(d，J=7.8 Hz)，7.309(m，J=7.2 Hz)，7.262(d，J=7.2 Hz)，7.211(q，J=3.6，7.8 Hz)，7.061(d，J=8.4 Hz)，6.998(d，J=8.4 Hz)，6.726(d，J=8.4 Hz).從耦合常數(shù)、氫的化學(xué)位移和各組峰的面積積分比進(jìn)一步證實(shí),該粗提物中含有多個芳香族化合物.

綜合上述紅外光譜與核磁共振譜的分析結(jié)果，推測TH07代謝物中可能含有乙酰氨基的小肽類物質(zhì)、芳香族化合物或乙酰胺的芳香族化合物.

3 結(jié) 論

總結(jié)以上的分析，推測可能是上述這些化合物參與了抑制白葉枯菌的生長.今后的工作是借助各種分離鑒定方法進(jìn)一步探索分析TH07代謝產(chǎn)物抗白葉枯病菌的有效成分.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

Composition analysis of metabolites from antagonistic thermophilic bacteria againstXanthomonasoryzaepv.oryzae

ZHANG Jun, ZHANG Jing, ZHANG Xiao, FAN Lingzhi, SUN Meihao, GONG Jufang, PU Shoucheng

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

In order to analyze the composition of the metabolites from antagonistic thermophilic bacteria TH07 againstXanthomonasoryzaepv.oryzae, growth conditions for TH07 was optimized, secreted metabolites extracted by ethyl acetate were analyzed by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and1H NMR. Based on optimization of response surface methodology, the optimum fermentation conditions for TH07 were obtained as following: initial medium pH = 9, medium volume of 381 mL with one liter conical flasks, and inoculums size of 6.37% (V/V), respectively. Using the optimized conditions to culture TH07, secreted metabolites were extracted by ethyl acetate, and crude extracts were further analyzed by FTIR spectrum and1H NMR. The results showed that the crude extraction contained small peptides, aromatic compounds or acetamide aromatic compounds, which suggested that these compounds may be involved in inhibiting growth ofXanthomonasoryzaepv.oryzae.

response surface optimization；Xanthomonasoryzaepv.oryzae； TH07; antibacterial activity

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.03.012

?2016-11-09；

2016-12-22

浙江省重中之重學(xué)科“生物學(xué)”開放基金資助項(xiàng)目(KFJJ2014002)

張 君(1991-)，女，安徽六安人，碩士研究生.研究方向：生物小分子.

蒲首丞.E-mail: pu2002@126.com>

Q93

A

1001-5051(2017)03-0318-06