基于Cole- Cole模型評(píng)價(jià)納米二氧化鈦的細(xì)胞毒性作用

包秀玲 廖 聰 馬 青

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

基于Cole- Cole模型評(píng)價(jià)納米二氧化鈦的細(xì)胞毒性作用

包秀玲 廖 聰 馬 青*

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

利用Cole- Cole模型評(píng)價(jià)不同劑量納米二氧化鈦(Nano- TiO2)的細(xì)胞毒性作用，并探討電生理機(jī)制。150和300 mg/L的Nano- TiO2懸液作用人胃癌MGC803細(xì)胞24 h后，制備成細(xì)胞懸浮液。在1 kHz～100 MHz范圍，采用Agilent 4294A精密阻抗分析儀測(cè)量了人胃癌MGC803細(xì)胞懸浮液電阻抗的幅值和相位角，經(jīng)電阻抗頻譜和Nyquist圖的曲線擬合的殘差分析，建立Cole- Cole模型參數(shù)，評(píng)估Nano- TiO2對(duì)MGC803細(xì)胞導(dǎo)電性能的影響。結(jié)果表明，150和300 mg/L的Nano- TiO2引起第一電阻抗增量(ΔZ1)分別減少18.18%(P<0.001)和39.39%(P<0.001)，第二電阻抗增量(ΔZ2)分別減少6.56%(P<0.001)、8.2%(P<0.001)，降低了MGC803細(xì)胞膜及其核膜的電阻，增加了其導(dǎo)電性能；第一特征頻率(fC1)分別增加19.74%(P<0.001)和29.67%(P<0.001)，第二特征頻率(fC2)分別增加6.28%(P<0.001)、23.43%(P<0.001)；第一散射角(β1)分別降低1.35%(P>0.05)和2.70%(P<0.05)。Cole- Cole模型可評(píng)價(jià)Nano- TiO2的細(xì)胞毒性作用并解釋其電生理機(jī)制，為納米顆粒的細(xì)胞毒理研究提供一種電特性方法。

納米二氧化鈦；胃癌；電阻抗譜；Cole- Cole模型；細(xì)胞毒性作用

引言

納米二氧化鈦(Nano- TiO2)在藥品、化妝品和食品添加劑中得到了廣泛使用[1]，并可通過(guò)血液注射、呼吸道吸入、胃腸道攝取和皮膚滲透等方式進(jìn)入人體[2]。2006年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)認(rèn)定Nano- TiO2為2B組致癌物[3]，引起人們對(duì)其毒性作用關(guān)注。以往研究表明，Nano- TiO2對(duì)人胃癌BGC- 823細(xì)胞具有毒性作用[4]，可激活巨噬細(xì)胞的氧化損傷[5]和凋亡[6]，引發(fā)人肺腺癌A549細(xì)胞的DNA損傷[7]，增加人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)內(nèi)噬作用[8]等。Nano- TiO2與細(xì)胞膜相互作用，伴隨一系列的生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧(ROS)[9]，過(guò)多的ROS對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。Nano- TiO2細(xì)胞毒性的電生理機(jī)制尚不清楚，有待闡明。

細(xì)胞電阻抗是利用不同頻率的交流電壓(V)施予細(xì)胞懸浮液，測(cè)其電流(I)，依據(jù)歐姆定律，電阻抗(Z=V/I)獲得電阻抗譜。它是一種快速、廉價(jià)、非損傷的細(xì)胞電生理方法[10]，已經(jīng)成功地用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖和遷移[11]、細(xì)胞活力[12]、抗癌藥物的評(píng)價(jià)[13]等研究。細(xì)胞膜是Nano- TiO2接觸的第一對(duì)象。一些有毒物質(zhì)作用細(xì)胞的早期反應(yīng)表現(xiàn)在細(xì)胞膜特性的改變[14]。而細(xì)胞的電阻抗譜能直觀反映細(xì)胞膜的變化，具有衡量細(xì)胞膜電特性的優(yōu)點(diǎn)[9]。

故此，本研究利用電阻抗譜技術(shù)檢測(cè)Nano- TiO2對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC803的毒性作用，并基于Cole- Cole模型參數(shù)變化，探討Nano- TiO2改變細(xì)胞膜和核膜的電阻抗作用機(jī)制，為納米TiO2的細(xì)胞毒性作用提供一種電學(xué)評(píng)價(jià)方法。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株MGC803購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，使用RPMI- 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清(Hyclone公司)和1%100 U/mL青霉素和鏈霉素(GIBCO公司)，置于溫度37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 制備Nano- TiO2母液

在無(wú)菌條件下，使用超純水配制1 g/L Nano- TiO2母液(Sigma公司)，120 ℃高溫滅菌1 h，采用超聲波儀(SB- 120DT)分散30 min后，使用RPMI-

1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)稀釋至所需濃度。

1.3 細(xì)胞分組

對(duì)照組：培養(yǎng)細(xì)胞不加Nano- TiO2處理，即0 mg/L Nano- TiO2組，n=15；實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞加入Nano- TiO2染毒，依據(jù)Nano- TiO2終濃度不同分成：實(shí)驗(yàn)組1∶150 mg/L Nano- TiO2組，n=16；實(shí)驗(yàn)組2∶300 mg/L Nano- TiO2組，n=17。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，通過(guò)2%胰蛋白酶消化后，收集到15 mL離心管中，配制細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)(cell volume fraction，CVF)約30%的細(xì)胞懸浮液，待電阻抗測(cè)量。

1.4 電阻抗測(cè)量

測(cè)量池(measuring cell)是由透明的有機(jī)玻璃制成圓筒形室，嵌入兩平行鉑片，電極圓盤直徑d=3 mm，電極間距L=9.4 mm, 容積約66 μL，測(cè)量溫度(25±1)℃[15]。

電阻抗譜測(cè)量由4194A阻抗分析儀、42942A適配器和16192A夾具組成。在1 kHz～100 MHz頻率范圍選取N=156個(gè)頻率點(diǎn)。每個(gè)樣本在1 min內(nèi)完成測(cè)量。交流激勵(lì)電壓100 mV，測(cè)量幅值|Z|和相位角θ，復(fù)電阻抗Z*=|Z*|e-jθ=ReZ-jImZ，電阻抗實(shí)部ReZ=|Z*|cosθ,電阻抗虛ImZ=|Z*|sinθ。

1.5 Cole- Cole模型[16]

(1)

因胃癌細(xì)胞存在細(xì)胞膜和核膜，故采用兩項(xiàng)式Cole- Cole模型，其計(jì)算解析方法見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。

1.6 擬合曲線的殘差分析

利用最小二乘法對(duì)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)與Cole- Cole方程計(jì)算數(shù)據(jù)進(jìn)行殘差分析[18]，其殘差為

(2)

式中，D和Dcal是實(shí)測(cè)值和Cole- Cole方程計(jì)算的數(shù)值，Dmax和Dmin是實(shí)測(cè)值的最大值和最小值，N=156。具體殘差數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 電阻抗譜的擬合殘差Tab.1 Fitting residual of electrical impedance spectra

1.7 統(tǒng)計(jì)處理

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.5時(shí)，認(rèn)為兩組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Nano- TiO2對(duì)人胃癌細(xì)胞電阻抗譜的影響

圖1(a)顯示Nano- TiO2對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞電阻抗實(shí)部(ReZ)頻譜的影響。

表2 Nano- TiO2對(duì)人胃癌細(xì)胞Cole- Cole方程參數(shù)的影響Tab.2 Effect of Nano- TiO2 on parameters of the Cole- Cole equation of the human gastric cancer cells

注：*P<0.05，***P<0.001與對(duì)照組比較；###P<0.001 與實(shí)驗(yàn)組1比較。

Note：*P<0.05，***P<0.001 compared with the control group；###P<0.001 compared with experience group 1.

1) ReZ頻率依存性：在1～100 kHz頻段，ReZ數(shù)值恒定不變，稱為電阻抗低頻極限值ReZL；在100 kHz～10 MHz頻段，ReZ數(shù)值隨頻率增大而減小，構(gòu)成第一個(gè)阻抗弛豫變化，稱為第一電阻抗增量(ΔZ1)；在10～50 MHz頻段，ReZ出現(xiàn)較緩平臺(tái)；當(dāng)電場(chǎng)頻率>50 MHz時(shí)，構(gòu)成第二個(gè)阻抗弛豫變化，稱為第二電阻抗增量(ΔZ2)。

2) ReZ的劑量依存性：隨Nano- TiO2劑量(150 mg/L、300 mg/L)增加，電阻抗低頻極限值(ReZL)和電阻抗增量(ΔZ1，ΔZ2)隨之減小。具體地講，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組(150 mg/L、300 mg/L)的ΔZ1分別減小18.18%(P<0.001)和39.39%(P<0.001)；ΔZ2分別減小6.56%(P<0.001)、8.2%(P<0.001)；ReZh分別減小6.25%(P<0.001)、12.5%(P<0.001)。

圖1(b)顯示Nano- TiO2對(duì)MGC803細(xì)胞的電阻抗虛部(ImZ)的影響。

1) ImZ頻率依存性：在1 kHz～10 kHz頻段，ImZ數(shù)值不變，稱為電阻抗虛部低頻極限值ImZL；在10 kHz～10 MHz頻段，ImZ隨頻率變化出現(xiàn)第一個(gè)弛豫峰，峰值對(duì)應(yīng)的頻率是第一特征頻率(fC1)；在10 MHz～10 GHz頻段，ImZ出現(xiàn)第二個(gè)峰，峰值對(duì)應(yīng)的頻率是第二特征頻率(fC2)。

2)劑量依存性：隨Nano- TiO2劑量(150 mg/L、300 mg/L)增加，特征頻率(fC1、fC2)隨之增加。也就是說(shuō)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組(150 mg/L、300 mg/L)的fC1分別增加19.74%(P<0.001)和29.67%(P<0.001)；fC2分別增加6.28%(P<0.001)、23.43%(P<0.001)。Nano-TiO2對(duì)人胃癌細(xì)胞Cole-Cole方程參數(shù)的影響如表2所示。

圖1 Nano- TiO2對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞阻抗譜的影響。(a)實(shí)部；(b)虛部Fig.1 Effect of Nano- TiO2 on the impedance spectra of human gastric carcinoma MGC803 cells. (a)The real part; (b)The imaginary part

2.2 Nano- TiO2對(duì)人胃癌細(xì)胞復(fù)平面圖的影響

圖2是Nano- TiO2影響MGC803細(xì)胞電特性的三維圖。曲線具有2個(gè)半圓弧，左側(cè)半圓由第一弛豫形成，右側(cè)半圓屬于第二弛豫。兩個(gè)圓弧頂點(diǎn)的頻率分別是第一、第二特征頻率(fC1、fC2)。左截距是電阻抗低頻極限值(ReZL)，右截距是電阻抗高頻極限值(ReZh)。隨著Nano- TiO2劑量的增加，圓弧曲線向右移動(dòng)，且圓弧面積變小。散射角(β1，β2)分別決定第一、第二半圓弧彎曲程度。Nano- TiO2對(duì)β1的影響：實(shí)驗(yàn)組(150 mg/L、300 mg/L)分別低于對(duì)照組1.35%(P>0.05)和2.70%(P<0.05)。Nano- TiO2對(duì)β2的影響：實(shí)驗(yàn)組(150 mg/L、300 mg/L)高于對(duì)照組1.22%(P>0.05)，但無(wú)顯著性差異。

圖2 Nano- TiO2對(duì)MGC803細(xì)胞三維Nyquist圖的影響Fig.2 Effect of Nano- TiO2 on the Nyquist plot of human gastric carcinoma MGC803 cells at 3D

3 討論

胃癌細(xì)胞由細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞核膜和細(xì)胞核質(zhì)構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)的電學(xué)性質(zhì)各異，特別是膜性結(jié)構(gòu)(細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜)主要由脂質(zhì)和少量蛋白質(zhì)組成，其電導(dǎo)率幾乎為零[19]。當(dāng)寬頻電場(chǎng)作用MGC803細(xì)胞時(shí)，因非導(dǎo)電的膜性結(jié)構(gòu)存在，在膜的內(nèi)側(cè)和外側(cè)聚集的帶電離子形成了界面極化效應(yīng)，稱為Maxwell- Wagner效應(yīng)[20]。此效應(yīng)在電阻抗譜表現(xiàn)出兩個(gè)弛豫：第一弛豫和第二弛豫，它們分別來(lái)源于細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜的極化效應(yīng)。并且用Cole- Cole模型參數(shù)分別表征第一弛豫(ΔZ1、fC1和β1)和第二弛豫(ΔZ2、fC2和β2)的特征。

在圖1(a)中，當(dāng)f=1～100 kHz頻段，細(xì)胞膜界面極化作用較大，細(xì)胞膜容抗(Zm=1/(jωCm)，Cm細(xì)胞膜電容)較大，電流選擇低電阻的細(xì)胞外液流動(dòng)，繞過(guò)細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞膜相當(dāng)于電容性斷路狀態(tài)或高阻抗特性。當(dāng)外加電場(chǎng)頻率f=100 kHz～10 MHz頻段，細(xì)胞膜的界面極化作用減弱，細(xì)胞膜容抗(Zm=1/(jωCm))逐漸減小，電流可以通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，電阻抗逐漸減小，形成了第一弛豫的電阻抗增量(ΔZ1)，故ΔZ1反映細(xì)胞膜對(duì)電磁場(chǎng)響應(yīng)的參量，也體現(xiàn)細(xì)胞膜的導(dǎo)電性能。當(dāng)電場(chǎng)頻率增至f=10～50 MHz頻段，細(xì)胞膜跟不上如此高頻電場(chǎng)變化，也來(lái)不及產(chǎn)生極化作用，相當(dāng)于細(xì)胞膜電容短路，電流直接穿過(guò)細(xì)胞膜，流入細(xì)胞質(zhì)，ReZ出現(xiàn)了較緩的平臺(tái)，此平臺(tái)反映細(xì)胞質(zhì)的信息。流入細(xì)胞質(zhì)的電流引起細(xì)胞核膜的界面極化，當(dāng)外加電場(chǎng)頻率f=50 MHz～1 GHz時(shí)，細(xì)胞核膜的界面極化作用減弱，核膜容抗(Zne=1/(jωCne))隨之減小，構(gòu)成了第二弛豫的電阻抗增量(ΔZ2)，故ΔZ2反映細(xì)胞核膜對(duì)電磁場(chǎng)響應(yīng)的參數(shù)，也代表細(xì)胞核膜的離子通透性。當(dāng)電場(chǎng)頻率f=1～10 GHz頻段，造成核膜的電容性短路，電流通過(guò)細(xì)胞核膜進(jìn)入核質(zhì)，電阻抗高頻極限值(ReZh)代表細(xì)胞核內(nèi)的信息。

在圖1(b)中，外加交變電場(chǎng)誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)(細(xì)胞膜和核膜)界面極化作用，當(dāng)外加電場(chǎng)頻率分別等于fC1和fC2時(shí)，電阻抗虛部(ImZ)產(chǎn)生了兩個(gè)極大的損耗，分別出現(xiàn)了兩個(gè)峰值，其峰值對(duì)應(yīng)的頻率(fC1、fC2)反映了MGC803細(xì)胞的頻率特性。

Nano- TiO2可以損傷胃癌細(xì)胞株BGC的膜結(jié)構(gòu)，引起膜通透性增加，導(dǎo)致其導(dǎo)電性增加[4]。故在圖1中，隨Nano- TiO2劑量增加，胃癌細(xì)胞株MGC803的電阻抗高頻極限值(ReZh)降低，細(xì)胞膜電阻抗增量(ΔZ1)和核膜電阻抗增量(ΔZ2)皆降低，Nano- TiO2造成細(xì)胞膜和核膜的電阻抗降低，電導(dǎo)率增加。其可能原因是在Nano- TiO2處理24 h后，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生活性氧(ROS)，引起膜細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重排[6]，造成細(xì)胞膜損傷，且隨著濃度的增加，毒性作用遞增，最后導(dǎo)致Nano- TiO2染毒組的電阻抗低于對(duì)照組的電阻抗。

在圖2中，Nano- TiO2劑量增加的同時(shí)，特征頻率(fC1、fC2)變大，第一散射角(β1)變小，第二散射角(β2)變化不大。這可能是大多數(shù)情況中，活性氧(ROS)在誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞損傷過(guò)程中扮演著重要角色。已知的細(xì)胞功能損害包括ROS的產(chǎn)生過(guò)?？蓪?dǎo)致DNA鏈斷裂，通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[21]，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞尺度變小，使得界面極化效應(yīng)加快，導(dǎo)致特征頻率變大[22]。

本研究實(shí)測(cè)頻率在1 kHz～100 MHz范圍內(nèi)，為了深入了解Nano- TiO2對(duì)胃癌細(xì)胞的毒性作用，今后有必要擴(kuò)展電場(chǎng)實(shí)測(cè)頻率范圍，研究其對(duì)核膜的影響。此外，考慮到細(xì)胞對(duì)納米材料的敏感性不同，引起的毒性作用也可能存在差異。需要進(jìn)一步研究其他類型的細(xì)胞，探究其是否存在相同的作用。

4 結(jié)論

1)利用電阻抗譜的Cole- Cole模型評(píng)價(jià)納米TiO2的細(xì)胞作用，闡述其電生理機(jī)制。

2)納米TiO2對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞電特性的作用是降低細(xì)胞膜和核膜電阻，增加其導(dǎo)電性能，增加特征頻率(fC1、fC2)，降低第一散射角(β1)。

3)納米TiO2對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞電特性的影響具有劑量依賴性，即隨納米TiO2劑量增加，電阻抗增量(ΔZ1、ΔZ2)隨之減小，而特征頻率(fC1、fC2)隨之增加。

Cole- Cole模型可以簡(jiǎn)便地觀察細(xì)胞膜和核膜導(dǎo)電性能或通透度，有效地解釋Nano- TiO2對(duì)胃癌細(xì)胞膜的電性能，為納米顆粒的細(xì)胞毒理性研究提供一種電生理學(xué)方法。

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Evaluation of Cytotoxicity of Nano Titanium Dioxide Based on Cole- Cole Model

Bao Xiuling Liao Cong Ma Qing*

(The Medicine School, Ningbo University, Ningbo 351211, Zhejiang, China)

The aim of this work is to evaluate the cytotoxicity of titanium dioxide nanoparticles (Nano- TiO2) at different doses based on Cole- Cole model and explore the electrophysiological mechanism. The human gastric cancer cell MGC803 was exposed to 150 mg/L and 300 mg/L Nano- TiO2suspension for 24 h. The amplitude and phase angle of the impedance of human gastric cancer MGC803 cell suspension were measured by 4294A Agilent precision impedance analyzer in the range of 1 kHz-100 MHz. Based on the residual analysis of the curve fitting of the electrical impedance spectroscopy and the Nyquist plot, the parameters of the Cole- Cole model were established, and the effect of Nano- TiO2on the conductivity of MGC803 cells was evaluated based on the Cole- Cole model. Results showed that 150 mg/L and 300 mg/L of Nano- TiO2induced the first impedance increment (ΔZ1) decreased 18.18% (P<0.001) and 39.39% (P<0.001) respectively, the second impedance increment (ΔZ2) decreased 6.56% (P<0.001) and 8.2% (P<0.001) respectively, and reduced the resistance of cellular membrane and nuclear membrane of MGC803 cells, increased its conductivity. The first characteristic frequency (fC1) was increased by 19.74% (P<0.001) and 29.67% (P<0.001) respectively, and second characteristic frequency (fC2) was increased by 6.28% (P<0.001) and 23.43% (P<0.001) respectively. The first dispersion angle (β1) was reduced by 1.35% (P>0.05) and 2.70% (P<0.05), respectively. The Cole- Cole model can be applied to evaluate the role of Nano- TiO2and explain its electrophysiological mechanism, providing a method for the study of cytotoxicity of nanoparticles.

Nano titanium dioxide; gastric cancer; electrical impedance spectroscopy; Cole- Cole model; cytotoxicity

10.3969/j.issn.0258- 8021. 2017. 03.011

2016-06-24， 錄用日期:2016-11-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51277099)；寧波市科技惠民項(xiàng)目(2015C5009)

R318

A

0258- 8021(2017) 03- 0336- 06

*通信作者(Corresponding author)，E- mail: maqing@nbu.edu.cn