腎和肺的去細(xì)胞器官支架體外灌注制備方法的優(yōu)化

陳翩翩 林 倩 朱群燕 趙應(yīng)征

(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325025)

腎和肺的去細(xì)胞器官支架體外灌注制備方法的優(yōu)化

陳翩翩 林 倩 朱群燕 趙應(yīng)征*

(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325025)

研究采用體外灌注法制備腎和肺去細(xì)胞器官支架的最優(yōu)方法。將10只成年SD雄鼠作為器官支架供體，進(jìn)行去細(xì)胞器官支架制備，不同器官采用不同血液循環(huán)方法進(jìn)行體外大氣壓灌注(基于大氣壓力往循環(huán)體系中注入)0.75% SDS、1% Triton X-100、0.1% H2O2制備器官去細(xì)胞支架，通過(guò)HE染色、DAPI熒光染色方法檢測(cè)去細(xì)胞程度，通過(guò)掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)和去細(xì)胞程度，通過(guò)阿利新藍(lán)- 過(guò)碘酸雪夫氏染法(AB- PAS)、Masson染色、免疫組化染色方法檢測(cè)去細(xì)胞器官支架的成分保留。結(jié)果表明，采用體外大氣壓灌注法制備的去細(xì)胞器官支架能有效去除細(xì)胞，且糖原、膠原、纖連蛋白(Fibronectin)、彈性蛋白(Elastin)、層粘連蛋白(Laminin)、IV 型膠原(Collagen IV)等有效保留，同時(shí)支架能保持良好的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)。通過(guò)大氣壓注入去細(xì)胞化試劑，能有效保留良好的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，同時(shí)達(dá)到有效的去細(xì)胞程度(去細(xì)胞程度大于99%)，且營(yíng)養(yǎng)成分能有效保留。

體外灌注；去細(xì)胞化；器官支架

引言

在臨床上，器官原位移植已經(jīng)成為臟器不可逆性損傷、衰竭的唯一治療手段，而每年急需移植的人數(shù)大幅上升，許多患者在等待器官的過(guò)程中失去生命[1]，移植供體缺乏成為器官移植技術(shù)的瓶頸。同時(shí)，移植術(shù)后的排斥反應(yīng)也存在很大障礙。

近些年，組織器官工程學(xué)的快速發(fā)展為克服器官移植術(shù)后的排斥問(wèn)題提供了解決思路。具有功能的器官移植替代物已經(jīng)在體外被創(chuàng)造，并且成功地被移植入受體[2]。本課題意在制備有效的器官支架材料，去細(xì)胞支架擁有良好的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，且保留許多的營(yíng)養(yǎng)成分，相對(duì)于其他的支架材料，去細(xì)胞器官支架的成分和結(jié)構(gòu)更加接近于活體器官，同時(shí)，它的低免疫原性以及高生物相容性使它更適用于移植，成為一種最具優(yōu)勢(shì)的移植替代物。

1 材料與方法

1.1 材料

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Sprague Dawley成年雄性大鼠(SD大鼠)，10只，體重(300±20)g，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2)試劑：Triton X- 100(阿拉丁，中國(guó))，SDS(阿拉丁，中國(guó))，F(xiàn)ibronectin(abcam，英國(guó))，Elastin(abcam，英國(guó))，Laminin(abcam，英國(guó))，Collagen IV(abcam，英國(guó))。

3)儀器： IX71 倒置研究型顯微鏡(Olympus公司，日本)，掃描電鏡(Hitachi, H- 7500, 日本)。

1.2 方法

1.2.1灌注法制備去細(xì)胞支架過(guò)程

基于器官的血液循環(huán)，以腎和肺支架制備為代表，優(yōu)化灌注方法，目前大多數(shù)的去細(xì)胞支架的灌注法采用蠕動(dòng)泵等外力壓入各種去細(xì)胞試劑[3]，其去細(xì)胞程度和成分保留均能達(dá)到效果，但是結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的完整性會(huì)因灌注時(shí)蠕動(dòng)泵的壓力過(guò)強(qiáng)而在一定程度上產(chǎn)生破碎，而本研究的體外灌注法是通過(guò)大氣壓導(dǎo)入去細(xì)胞試劑，最大程度緩和了壓強(qiáng)過(guò)大導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的破壞。制備過(guò)程如下：首先構(gòu)建臟器的閉合血液循環(huán)通路，接著進(jìn)行去細(xì)胞化過(guò)程：1% Triton X- 100灌注3個(gè)循環(huán)→PBS灌注3個(gè)循環(huán)→0.75% SDS灌注3個(gè)循環(huán)→PBS灌注3個(gè)循環(huán)→0.1% H2O2灌注3個(gè)循環(huán)→PBS灌注3個(gè)循環(huán)。以上每次循環(huán)使用250 mL試劑。

1% Triton X- 100用于破細(xì)胞膜，0.75% SDS能有效去除細(xì)胞成分，筆者采用的Triton X- 100和SDS是較為溫和的洗滌劑，其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的破壞可以降到最低[4]，0.1% H2O2用于殺菌，PBS用于清除殘留的細(xì)胞碎片。整個(gè)過(guò)程器官都處于懸空，上面接著留置針，其針連著25 mL針筒，試劑都加入針筒，通過(guò)大氣壓，試劑緩慢通過(guò)器官進(jìn)行去細(xì)胞化過(guò)程。通過(guò)大氣壓力把試劑導(dǎo)入器官，相對(duì)于手動(dòng)導(dǎo)入試劑或蠕動(dòng)泵導(dǎo)入試劑，能更完整地保持血管脈絡(luò)網(wǎng)，避免其由于過(guò)強(qiáng)的壓力而破碎、滲漏。

灌注法制備大鼠腎和肺去細(xì)胞化支架：制備腎去細(xì)胞化支架時(shí)，從單側(cè)腎動(dòng)脈插入留置針，伴行的腎靜脈剪開(kāi)切口，形成單腎循環(huán)，手術(shù)線結(jié)扎固定留置針，注入生理鹽水沖洗血液后，移出體外，將腎懸掛在簡(jiǎn)易裝置中；而肺的灌注采取心肺循環(huán)灌注，先從下腔靜脈注入肝素抗凝，再結(jié)扎心臟主動(dòng)脈弓，將留置針從右心室插入、結(jié)扎固定，灌注生理鹽水沖洗血液后，最后將心肺一起移出體外，懸掛在簡(jiǎn)易裝置中。接著分別加入去細(xì)胞試劑進(jìn)行去細(xì)胞化處理(見(jiàn)圖1、2)。經(jīng)過(guò)上述處理獲得去細(xì)胞化腎支架(dKECM)和去細(xì)胞化肺支架(dLECM)。

圖1 大鼠肺組織去細(xì)胞化過(guò)程。(a)箭頭處表示大鼠下腔靜脈；(b)往大鼠下腔靜脈打入肝素；(c)結(jié)扎大鼠心臟主動(dòng)脈弓，再將留置針從右心室插入、結(jié)扎固定；(d)將肺組織移入裝置；(e)組織去細(xì)胞化前近觀；(f)組織去細(xì)胞化后；(g)組織去細(xì)胞化后近觀Fig.1 The preparation of rat lung decellularization. (a) Arrow represents the inferior vena cava of rats; (b) Inject heparin to the inferior vena cava of rats; (c) Ligate rat cardiac aortic arch and insert the detained needle to the right ventricle and fasten it; (d) Move the tissue to appliance; (e) Amplification of tissue before decellularization; (f) The final decellularization; (g) Amplification of final decellularized tissue

圖2 大鼠腎組織去細(xì)胞化過(guò)程。(a)往大鼠單側(cè)腎動(dòng)脈插入留置針，伴行的腎靜脈剪開(kāi)切口，形成單腎循環(huán)； (b)將組織移入裝置；(c)組織去細(xì)胞化后近觀；(d)組織去細(xì)胞化過(guò)程中的形態(tài)變化Fig.2 The preparation of rat kindey decellularization. (a) Insert the detained needle into the unilateral renal artery and cut the following renal vein with an incision, developing a single renal circulation; (b) Move the tissue to appliance; (c) Amplification of final decellularized tissue; (d) The tissue changes during decellularized process.

1.2.2 去細(xì)胞程度檢測(cè)

通過(guò)HE染色和DAPI熒光染核，對(duì)去細(xì)胞化程度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 去細(xì)胞化器官支架的成分保留

通過(guò)Masson染色檢測(cè)其膠原纖維的保留；AB- PAS染色檢測(cè)其糖原的保留；免疫組化染色檢測(cè)纖連蛋白(Fibronectin)、彈性蛋白(Elastin)、層粘連蛋白(Laminin)、IV 型膠原(Collagen IV)的保留。

1.2.4去細(xì)胞化器官支架結(jié)構(gòu)的完整性

通過(guò)掃描電鏡可以看出去細(xì)胞器官支架的脈絡(luò)網(wǎng)的完整性。

1.2.5 去細(xì)胞化器官支架免疫原性檢測(cè)

通過(guò)皮下埋植去細(xì)胞肺支架以及腦內(nèi)填充去細(xì)胞化腎支架，于第7 d處理老鼠后，肉眼觀察組織的炎癥情況以及RT- PCR檢測(cè)埋植物周?chē)M織的CD68的表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以 (x±s) 表示，兩組間差異比較行t檢驗(yàn)，P<0. 05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎和肺去細(xì)胞程度評(píng)價(jià)

通過(guò)HE染色和DAPI染色顯示出dLECM(見(jiàn)圖3)、dKECM(見(jiàn)圖4)和正常肺、腎組織相比，沒(méi)有細(xì)胞核的表達(dá)，從掃描電鏡結(jié)果能觀察到其保留了器官完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)。

圖3 肺去細(xì)胞程度評(píng)價(jià)。(a)肺組織的HE染色；(b)肺組織的DAPI染色；(c) 肺去細(xì)胞支架的HE染色；(d)肺去細(xì)胞支架的DAPI染色；(e)肺去細(xì)胞支架的掃描電鏡圖Fig.3 Evaluation of the decellularized lung. (a) HE stain of normal lung; (b) DAPI stain of normal lung; (c) HE stain of decellularized lung; (d) DAPI stain of decellularized lung; (e) SEM result of decellularized lung.

圖4 腎去細(xì)胞程度評(píng)價(jià)。(a)腎組織的HE染色；(b)腎組織的DAPI染色；(c)腎去細(xì)胞支架的HE染色；(d)腎去細(xì)胞支架的DAPI染色；(e)腎去細(xì)胞支架的掃描電鏡圖Fig.4 Evaluation of the decellularized kindey. (a) HE stain of normal kindey; (b) DAPI stain of normal kindey; (c) HE stain of decellularized kindey; (d) DAPI stain of decellularized kindey; (e) SEM result of decellularized kindey.

圖5 去細(xì)胞腎和肺支架的免疫原性檢測(cè)。(a)肺去細(xì)胞支架大鼠皮下埋植7 d；(b)腎去細(xì)胞支架埋入大鼠腦；(c)正常大鼠大腦；(d)假手術(shù)組；(e)腎去細(xì)胞支架埋入大鼠腦7 dFig.5 Immunogenicity detection of decellularized kidney and lung. (a) Lung scaffolds subcutaneous embedment in normal rat for 7 days; (b) Lung scaffolds embedded in rat brain. (c) Normal rat brain; (d) Control group; (e) Lung scaffolds embedded in rat brain for 7 days

2.2 去細(xì)胞腎和肺支架的免疫原性檢測(cè)

肺去細(xì)胞支架埋植入大鼠皮下7 d后(見(jiàn)圖5(a))，可以看出，埋植物與周?chē)M織并沒(méi)有發(fā)生炎癥。而腎去細(xì)胞支架埋植入腦的示意圖(見(jiàn)圖5(b))以及7 d后狀況(見(jiàn)圖5(e))，對(duì)比與正常大腦(見(jiàn)圖5(c))和假手術(shù)組大腦(見(jiàn)圖5(d))可觀察出其沒(méi)有明顯的炎癥，并且組織相容性良好。取移植后的腦組織周?chē)M織進(jìn)行RT- PCR檢測(cè)CD68含量的表達(dá)，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖6)，埋植物周?chē)M織沒(méi)有炎癥發(fā)生，說(shuō)明本課題組制備的去細(xì)胞化肺、腎支架有良好的免疫原性。

圖6 經(jīng)去細(xì)胞組織移植后腦周?chē)M織的CD68 mRNA水平Fig.6 Relative CD68 mRNA levels in surrounding brain tissues after decellularized tissue transplantation.

2.3 去細(xì)胞腎和肺支架的成分保留

從AB- PAS染色看出dLECM(見(jiàn)圖7)、dKECM(見(jiàn)圖8)的糖原、中性黏蛋白等各種糖蛋白的保留(呈紫紅色)、Masson染色看出膠原纖維的保留(呈藍(lán)色)、免疫組化染色結(jié)果可看出支架能有效保留Fibronectin、Elastin、Laminin、Collagen IV(呈棕色陽(yáng)性點(diǎn))。

圖7 肺支架成分保留(上為肺組織、下為肺去細(xì)胞支架)。(a) Masson染色；(b) AB- PAS染色；(c) Elastin免疫組化染色； (d) Fibronectin免疫組化染色； (e) Collagen Ⅳ免疫組化染色Fig.7 Composition retaining in lung scaffold(The above is fresh lung, below is the decellularized lung). (a) Masson stain; (b)AB- PAS stain; (c) Elastin stain; (d) Fibronectin stain; (e) Collagen Ⅳ stain

圖8 腎支架成分保留(上為腎組織、下為腎去細(xì)胞支架)。(a) Masson染色；(b) AB- PAS染色；(c)腎組織Elastin免疫組化染色； (d)腎組織Fibronectin免疫組化染色； (e)腎組織Laminin免疫組化染色； (f)腎去細(xì)胞支架Collagen Ⅳ免疫組化染色Fig.8 Composition Retaining in kidney scaffold. The above is fresh kidney, below is the decellu.larized kidney(a) Masson stain; (b) AB- PAS stain; (c) Elastin stain; (d) Fibronectin stain; (e) Laminin stain;(f)Collagen Ⅳstain

3 討論

去細(xì)胞支架是通過(guò)不同方法去除組織或者器官的細(xì)胞以及可溶性蛋白，使其達(dá)到低免疫原性、高生物相容性的天然生物支架材料。對(duì)比于現(xiàn)有的體外灌注方法，大多數(shù)都是采用蠕動(dòng)泵等額外的壓力往器官中注入試劑，這額外的壓力在一定程度上會(huì)破壞支架的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，而本實(shí)驗(yàn)主要采取大氣壓灌注導(dǎo)入試劑，最大程度地避免由于過(guò)強(qiáng)的壓力導(dǎo)致結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的破碎，在保留完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的同時(shí)，去細(xì)胞化程度也達(dá)到要求。

目前，在血管、膀胱以及氣管等組織的工程化已經(jīng)取得可喜的進(jìn)步。而整個(gè)器官重建要求在移植后血液能迅速支持，這就增加了支架制備和再細(xì)胞化的難度。因此，植入性生物人工器官發(fā)展的障礙之一，是缺乏能重現(xiàn)整個(gè)組織功能的生物學(xué)相適應(yīng)的器官支架器官[5]和適合組織形成的生長(zhǎng)環(huán)境[6]。

在過(guò)去的幾年里，去細(xì)胞支架已經(jīng)成功地用于修復(fù)各種損傷或病變的器官[7]，比如皮膚[8]、氣管[9- 10]、食道[11- 12]、心[13- 15]等。

為了有效去除器官的細(xì)胞，保留超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)成分[16]，大多數(shù)實(shí)體器官的去細(xì)胞化過(guò)程都采用灌注法[3, 17]，基于它通過(guò)脈絡(luò)循環(huán)來(lái)清除所有的細(xì)胞成分，并維持器官細(xì)胞外基質(zhì)的完整性[18- 19]，同時(shí)保留了其原始的血管脈絡(luò)系統(tǒng)，這種能保持完整結(jié)構(gòu)脈絡(luò)的去細(xì)胞化支架能被用于種植培養(yǎng)多種細(xì)胞[20]。而采取的灌注法能有效去除細(xì)胞成分并保留完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，同時(shí)保留膠原、糖原以及各種營(yíng)養(yǎng)蛋白，相對(duì)于傳統(tǒng)意義上的灌注法，采取了依靠大氣壓導(dǎo)入去細(xì)胞化試劑，能最大程度地保留器官的血管脈絡(luò)網(wǎng)，有效地避免其由外界壓力過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致的血管破裂。在移植替代物中，可以看到去細(xì)胞化器官支架的低免疫原性排除了傳統(tǒng)移植的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)其保留的營(yíng)養(yǎng)成分和結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)又是一般生物支架材料所不具備的，并且由于其完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)能讓接種的細(xì)胞黏附、爬行、增殖，有效實(shí)現(xiàn)去細(xì)胞支架的再細(xì)胞化。

本研究證明，基于血循環(huán)通路的體外大氣壓自然灌注法能有效制備去細(xì)胞化器官支架，同時(shí)確立了一個(gè)有效且快速的大鼠器官去細(xì)胞方法，為以后支架的再細(xì)胞化及體內(nèi)移植奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本課題的體外灌注法制備的去細(xì)胞器官支架相對(duì)于大多數(shù)通過(guò)蠕動(dòng)泵灌注制備的去細(xì)胞支架，不僅有效去除細(xì)胞，保留營(yíng)養(yǎng)成分，消除免疫原性，且最大程度地保存了器官的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的完整性，這為開(kāi)發(fā)組織工程支架帶來(lái)新的機(jī)遇,開(kāi)拓了良好前景，是組織工程學(xué)進(jìn)展的關(guān)鍵一步。

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The Advanced Method of Kidney and Lung De- Cellularized Scaffold through in vitro Perfusion

Chen Pianpian Lin Qian Zhu Qunyan Zhao Yingzheng*

(School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzho 325035u, Zhejiang, China)Key words：in vitro perfusion; de- cellularized; organ scaffold

10.3969/j.issn.0258- 8021. 2017. 03.019

2016- 07- 26， 錄用日期:2016- 01- 25

國(guó)家自然科學(xué)基金(81571392)；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才和溫州市551高層次人才創(chuàng)新技術(shù)項(xiàng)目。

R318

D

0258- 8021(2017) 03- 0380- 05

*通信作者(Corresponding author)，E- mail: pharmtds@163.com