正交試驗優(yōu)選復(fù)方三匙飲提取工藝

曾艷婷 于婷婷 李 兵 朱小勇,2*

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530200

正交試驗優(yōu)選復(fù)方三匙飲提取工藝

曾艷婷1于婷婷1李 兵1朱小勇1,2*

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530200

目的：優(yōu)化壯藥復(fù)方三匙飲的提取工藝條件。方法：以牛彌菜醇A的含量為指標(biāo)，通過不同液料比，不同提取時間、不同提取次數(shù)，采用L9(34)正交試驗，優(yōu)選最佳提取工藝條件。結(jié)果：優(yōu)選出的最佳提取工藝為采用14倍溶劑，水煎煮提取2次，每次40min。結(jié)論：優(yōu)化壯藥復(fù)方三匙飲的提取工藝穩(wěn)定可行，有效成分提取率較高，適合大生產(chǎn)需求，可為壯藥復(fù)方三匙飲制劑生產(chǎn)提供參考。

壯藥復(fù)方三匙飲；牛彌菜醇A；正交試驗

復(fù)方三匙飲由壯藥三角泡、匙羹藤、黃精組成，其中主藥為三角泡和匙羹藤，黃精作為幫藥。三角泡為無患子科倒地鈴Cardio-spermumhalicacabumL.的全草，壯名Rumsamgakbauq，壯醫(yī)認(rèn)為其有調(diào)谷道、水道，清濕熱毒之功效，民間多用于治療糖尿病、肺炎、黃疸、淋病、疔瘡等，單方常用于防治糖尿病[1]。匙羹藤為蘿藦科植物匙羹藤Gymnemasylvestre(Retz.)Schult.的根，壯醫(yī)認(rèn)為其具有調(diào)龍路火路，清熱毒，利濕毒之功效，是廣西壯族民間治療糖尿病的常用藥材，具有降血糖、降血脂、抗病毒等作用[2]。黃精為百合科植物多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的根莖，壯名Ginghsw，壯醫(yī)認(rèn)為祛風(fēng)毒，調(diào)谷道，補虛等功效，用于肺癆咳血，病后體弱，陰虛內(nèi)熱，發(fā)旺(風(fēng)濕骨痛)，啊肉甜(消渴)，高血壓等[3]。陳君等[4]對三角泡降血糖作用初步研究發(fā)現(xiàn)，其乙醇總提取物能明顯降低四氧嘧啶糖尿病小鼠及腎上腺素性糖尿病小鼠血糖值。盧汝梅等[5]對匙羹藤降血糖作用及其活性成分研究發(fā)現(xiàn)，其正丁醇部位分離得到降血糖活性成分牛彌菜醇A，得率高達(dá)4.2‰，進一步對其降血糖作用及其機制進行研究，結(jié)果表明牛彌菜醇A可降低四氧嘧啶性和腎上腺素性糖尿病小白鼠的血糖值，降低率可達(dá)41.6%[6]。李友元等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃精中重要組成部分黃精多糖能夠明顯降低實驗性糖尿病鼠血糖和血清糖化血紅蛋白濃度，并明顯升高血漿胰島素及C肽水平，表明黃精多糖具有調(diào)節(jié)糖代謝和治療實驗性糖尿病的作用。

復(fù)方三匙飲源于壯醫(yī)民間治療糖尿病的驗方，藥理實驗表明方中各單味藥提取物均具有良好的降血糖作用。但目前尚未有學(xué)者對此方的提取工藝進行研究，本課題采用正交設(shè)計試驗法，優(yōu)化壯藥復(fù)方三匙飲的提取工藝條件，為其制劑開發(fā)和質(zhì)量控制提供指導(dǎo)。

1 儀器與材料

1.1 材料 牛彌菜醇A對照品(自制，經(jīng)UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR鑒定并確定結(jié)構(gòu)，采用HPLC面積歸一化法測定其純度，大于98.0%)。匙羹藤、三角泡、黃精均購于廣西玉林中藥港，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院韋松基教授鑒別為正品，甲醇(分析純，批號：20150108，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，批號：138322，賽默飛世爾科技中國有限公司)，乙腈(色譜純，批號：112189，賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BSA24S分析天平(德國賽多利斯)；KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗器江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；CD-UPH-II-20L實驗超純水器(成都超純科技有限公司)；TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL sugar-D糖分析柱(250mm×4.6mm)；流動相：乙腈-水(90：10)；檢測波長：207nm；流速:1.0mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：25℃。

2.2 對照品溶液的制備 取自制對照品牛彌菜醇A 50mg，精密稱定，加入甲醇定容至25mL，得2.0mg/mL對照品溶液，分別精密吸取1mL、3mL，分別定容至10mL，得0.2mg/mL，0.6mg/mL對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 將復(fù)方三匙飲粉碎，過2號篩，取粗粉1g，精密稱定，精密加入14mL水浸泡1h，水煎煮提取30min，放冷，補重，過濾，藥渣中精密加入14mL水，同法操作，合并兩次水提液，3000r離心15min。將對照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀，按“2.1 色譜條件”下進樣，其色譜圖見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 按“2.1”項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液(濃度為0.6mg/mL)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL 注入液相色譜儀進行測定，以對照品進樣量(μL)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=506.653275x-9.7277527(r=0.9999)，表明對照品進樣量在0.60～3.6μg范圍與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實驗 精密吸取2mg/mL對照品溶液1.0mL，加甲醇定容至10mL，得0.2mg/mL，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果RSD值為0.097%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實驗 按照2.3供試品制備方法，制備復(fù)方藥材供試液6份，按“3.1”項下色譜條件分別進樣，結(jié)果RSD值為2.39% ，表明測定方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 按照2.3供試品制備方法，制備復(fù)方藥材供試液，分別放置0、3、6、12、18、24h后按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，結(jié)果RSD值為2.27% ，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收實驗 取已知含量的復(fù)方藥材粗粉6份，各0.5g，精密稱定，分別加入牛彌菜醇A對照品適量，按“2.3 供試品溶液的制備”方法下制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，計算牛彌菜醇A的含量，結(jié)果見表1，平均加樣回收率為100.5%，RSD為2.66%。

表1 加樣回收統(tǒng)計表(n=6)

2.5 正交試驗考察

2.5.1 正交試驗設(shè)計 選取正交試驗設(shè)計優(yōu)化的方法，結(jié)合生產(chǎn)實際中的操作和成本問題及該復(fù)方藥的特性，采用水提工藝，確定用溶劑倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，每個因素選取3個水平，采用正交試驗優(yōu)選壯藥復(fù)方三匙飲藥材提取的最佳工藝參數(shù)。見表2。

表2 因素水平表

2.5.2 正交試驗結(jié)果 取復(fù)方三匙飲粗粉9份，每份1g，精密稱定，置250mL具塞錐形瓶中，按正交試驗表進行實驗，平行做3次。見表3、4。

表3 正交實驗表

表4 方差分析表

正交試驗結(jié)果分析，根據(jù)直觀分析和方差分析顯示，各因素對提取工藝影響的主次關(guān)系為：溶劑倍數(shù)(A)>提取次數(shù)(C)>提取時間(B)。最佳提取工藝條件應(yīng)為A3B3C3，方差分析表A、B、C因素均無顯著影響，所以從節(jié)能、節(jié)時上考慮因素B、C選擇2水平，即最佳提取工藝應(yīng)為A3B2C2。

2.5.3 提取工藝驗證 分別取壯藥復(fù)方三匙飲藥材粗粉3份，各1g，按照最佳提取工藝提取，按“3.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果牛彌菜醇A平均得率為3.38mg/g，RSD%為1.20%。試驗結(jié)果表明本實驗最佳提取工藝可行。見表5

表5 提取工藝驗證實驗結(jié)果

4 討論

牛彌菜醇A為降血糖活性成分，實驗選用牛彌菜醇A作為含量測定指標(biāo)，與該方治療糖尿病相一致。牛彌菜醇A最大吸收波長為207nm，實驗選擇207nm作為檢測波長，低波長檢測對流動相本身即產(chǎn)生吸收，進而導(dǎo)致基線不易穩(wěn)定，平衡較為困難，甲醇紫外吸收截止波長為205nm，乙腈紫外吸收截止波長為190nm，故本實驗以乙腈-水作為流動相。

筆者采用反相高效液相色譜法測定復(fù)方中牛彌菜醇A含量，分別考察了乙腈-水(95:5)、乙腈-水(90:10)、乙腈-水(85:15)為流動相對供試品的分離效果，圖2中峰a代表組分為牛彌菜醇A，其中乙腈-水(90:10)及乙腈-水(85:15)分離效果較好，與其他組分峰分離度>1.5，而乙腈-水(90:10)保留時間更為適宜，故以此作為流動相進行定量分析。

實驗采用水煎煮法提取復(fù)方，與臨床實際提取相符。由于水對藥材植物細(xì)胞穿透力較強，故對生物堿鹽、有機酸鹽、萜類、皂苷、黃酮、多糖等物質(zhì)提取效率較高，結(jié)合復(fù)方中各單味藥所含化學(xué)成分，三角泡中黃酮類化合物含量較高，匙羹藤中含有大量三萜、皂苷類物質(zhì)，黃精中富含多糖，保留時間2.5～5之間多為三萜、皂苷、黃酮、多糖等成分。實驗采用水煎煮發(fā)進行提取，所提成分多為大極性物質(zhì)，而采用反相高效液相色譜法進行測定時極性大的物質(zhì)先出峰，另一方面復(fù)方中含有較多三萜類成分，萜類物質(zhì)以及多數(shù)化合物在低波長下均有吸收，故保留時間2.5～5之間峰形雜亂。

壯藥復(fù)方三匙飲的L9(34)正交試驗表明，其最佳提取條件為A3B2C2，即采用藥材重量14倍的溶劑，煎煮40min兩次，按此條件進行驗證，結(jié)果總有效成分平均提出量為3.38mg/g(RSD為1.20%)，表明新工藝提取效果良好，工藝條件穩(wěn)定可行，有效成分提取率較高，簡便經(jīng)濟，適用于生產(chǎn)。

[1]廣西科學(xué)院. 廣西植物志[M]. 南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1991.

[2]Porchezhian E，Dobriyal RM. An overview on the advances of Gymnema sylvestre:chemistry，pharmacology and patents[J]. Pharmazie, 2003, 58(1):5.

[3]廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局編.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第一卷)[M].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社， 2008 .

[4]陳君, 韋建華, 苗偉生, 等. 倒地鈴急性毒性及降血糖作用的初步研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2011,23(5): 1083-1085.

[5]盧汝梅. 匙羹藤莖化學(xué)成分和降血糖作用的研究[D]. 成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2005.

[6]韋建華，丘琴，甄漢深，等. 匙羹藤有效成分牛彌菜醇A 急性毒性及降糖作用研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2011,22(3):554-556.

[7]李友元，鄧洪波，張萍，等. 黃精多糖對糖尿病模型小鼠糖代謝的影響[J].中國臨床康復(fù)，2005,9(27):90-591.

Orthogonal Optimization of Extracted Technology of Compound San Chiyin

ZENG Yanting1YU Tingting1LI Bing1ZHU Xiaoyong1,2*

1.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530200,China;2.Key Laboratory Common Technology of Traditional Medicine Preparation,Nanning 530200,China

Objective To optimize the extraction technique conditions of the Compound San Chiyin.Methods Select the best extraction technique by using L9(34) orthogonal test in different liquid-solid ratio,different extraction time and different extraction times, with the content of conduritol A as the index.Results The optimum extraction process was as follows 14 times amount of water, 40 minutes every time, 2 times of extraction. Conclusion The extraction technique of optimizing the compound was stable and feasible,the extraction rate of active ingredient is fairly high, it’s suitable and referable for large production needs.

the Compound San Chiyin;Conduritol A;Orthogonal Test

廣西高校壯醫(yī)方藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室(桂教科研(2014)6號zyfy201403)；廣西高校科技創(chuàng)新能力提升工程專項項目(70-ZJGX201402002)。

曾艷婷(1992-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向為中藥化學(xué)成分與質(zhì)量。 E-mail: 785126544@qq.com

朱小勇(1969-)，男，漢族，碩士，高級工程師，研究方向為中藥提取及制劑工藝。E-mail：251279306@qq.com

R284

A

1007-8517(2017)15-0042-03

2017-06-07 編輯：梁志慶)