維藥鳶尾根提取物抑制變異鏈球菌生物膜的初步研究

馬 玉 田春鴻 孫麗婷 田 莉 劉 盟

1.新疆烏魯木齊市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆烏魯木齊市米東區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 831400；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011; 4.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011

維藥鳶尾根提取物抑制變異鏈球菌生物膜的初步研究

馬 玉1田春鴻2孫麗婷1田 莉3*劉 盟4

1.新疆烏魯木齊市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆烏魯木齊市米東區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 831400；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011; 4.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011

目的：研究維藥鳶尾根不同極性提取部位對變異鏈球菌生長及生物膜形成的影響，為其防治齲齒的活性部位提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用系統(tǒng)溶劑法分離維藥鳶尾根不同極性提取物，微孔板法培養(yǎng)變異鏈球菌BF模型，兩倍稀釋法研究維藥鳶尾根不同極性提取物對變異鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)和影響B(tài)F形成的最低抑菌濃度(SMIC)。結(jié)果：乙酸乙酯提取部位對抑制變異鏈球菌生長的MIC50為500μg/mL，氯仿、乙酸乙酯提取部位對變異鏈球菌BF形成的SMIC50分別約為125μg/mL和50μg/mL。結(jié)論：初步確定維藥鳶尾根氯仿、乙酸乙酯提取部位為抑制變異鏈球菌BF形成的活性部位。

維藥鳶尾根；提取物；變異鏈球菌；生物膜

鳶尾根為鳶尾科植物喜堿鳶尾(Irishalophilapall.)的干燥根莖，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)》(維吾爾藥分冊)，其性干熱，具有成熟和清除異常體液，促進(jìn)機(jī)體自然隨和的功效，用于治療咽喉腫痛、牙痛、瘡癰、濕疹等癥[1]。文獻(xiàn)報(bào)道和前期實(shí)驗(yàn)表明，喜堿鳶尾根中含有黃酮類、內(nèi)酯香豆素、糖和苷類，酚類鞣質(zhì)、有機(jī)酸等成分，對其抗氧化活性成分的分離鑒定和揮發(fā)性成分的檢測有相關(guān)報(bào)道[2-3]。

變異鏈球菌是齲病者口腔中分離出的主要致齲菌，其通過牙齒表面黏附和聚集形成生物被膜，即牙菌斑生物膜(Biofilm，BF)，進(jìn)而產(chǎn)酸耐酸致齲，抑制其BF形成能有效防治齲病，成為近年防齲研究的熱點(diǎn)[4]。鑒于鳶尾根的臨床適應(yīng)癥和維吾爾民間用其治療牙痛、癤瘡癰疽、口瘡等癥，本文研究其不同極性提取部位對變異鏈球菌的生長及其BF形成的影響，篩選其防治齲病的活性部位，為其防治齲病制劑開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Spectra-MAX 190酶標(biāo)儀(美國Molecu1ar Devices公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；DNP-9162型恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏設(shè)備公司)；3110型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BT-25S型分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；96孔微量培養(yǎng)板(美國Corning公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)。

1.2 供試菌種和試劑 變異鏈球菌(ATCC 700610，中國藥品生物制品檢定所)；腦心浸液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Broth，BHI，美國BD公司)；去氧膽酸鈉(SD，Sigma-Aldrich)；其它試劑均為分析純。

1.3 藥品 鳶尾根購于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)烏莉婭·沙衣提教授鑒定為喜堿鳶尾(Irishalophilapall.)的干燥根莖。

2 方法

2.1 鳶尾根不同極性部位提取物的制備 稱取鳶尾根粗粉500g，加入75%乙醇3000mL熱回流提取3次，2h/次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，烘干，得稠浸膏66.9g。所得浸膏再依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取，各萃取液經(jīng)減壓濃縮，烘干，得到4個(gè)不同極性部位提取物，4℃保存。

2.2 抑菌試驗(yàn)

2.2.1 菌種復(fù)蘇與培養(yǎng) 在-80℃保存的變異鏈球菌接種于BHI培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%、 CO2培養(yǎng)箱孵育20h后，比濁法判斷菌種已復(fù)蘇。用接種針挑取少量標(biāo)準(zhǔn)菌種，劃線接種于滅菌的瓊脂固體培養(yǎng)基中，37℃ 、5% 、CO2培養(yǎng)箱中孵育24h[5]。

2.2.2 菌懸液的制備 用無菌接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)的變異鏈球菌置BHI培養(yǎng)基中，加入40%葡萄糖，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中活化孵育24h，使變異鏈球菌處于指數(shù)生長期，充分震搖后，經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁芊ㄕ{(diào)整菌液濃度為109CFU/mL。

2.2.3 樣品制備 分別精密稱定鳶尾根不同極性提取物適量，以二甲基亞砜分別制成約2mg/mL實(shí)驗(yàn)樣品溶液，阿莫西林制成250μg/mL溶液，均以0.22μm濾器過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 對變異鏈球菌生長的影響 采用2倍稀釋法測定鳶尾根不同極性提取物對變異鏈球菌生長的影響，并確定最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)[6]。用BHI培養(yǎng)液50倍稀釋變異鏈球菌懸液，用此懸液將“2.2.3”鳶尾根不同極性提取物實(shí)驗(yàn)樣品溶液進(jìn)行連續(xù)對倍稀釋，使含藥終濃度分別為1000、500、250、125、62.5μg/mL。同時(shí)，設(shè)25%二甲基亞砜-甲醇作為空白溶劑對照，含菌溶液作為陰性對照，阿莫西林作為陽性對照，平行3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育18h，酶標(biāo)儀在600nm波長處測定光密度值(OD值)，計(jì)算抑制率。計(jì)算公式為：抑制率(%)=[(OD空白溶劑- OD樣品)/(OD空白溶劑OD陰性對照)]×100%，并確定最低抑菌濃度(MIC值)[7]。

2.2.5 對變異鏈球菌BF形成的影響 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的變異鏈球菌接種于96孔板，以未加樣品含菌溶液作為陰性對照，50μg/mL阿莫西林溶液作為陽性對照，實(shí)驗(yàn)樣品組分別加入含1000、500、250、125、62.5μg/mL鳶尾根不同極性提取物的BHI培養(yǎng)液。平行3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h，去除培養(yǎng)基及懸浮細(xì)菌，蒸餾水沖洗3遍，每孔加200μL 1%結(jié)晶紫溶液染色15min，雙蒸水沖洗數(shù)遍至透明，用2% SD洗脫生物膜，酶標(biāo)儀在600 nm波長處測定OD值，計(jì)算抑制BF形成的抑制率。計(jì)算公式為：抑制率(%)=(OD陰性對照-OD樣品/ OD陰性對照)×100%，并確定抑制BF形成的最低抑菌濃度(Sessile Minimal Inhibitory Concentration，SMIC)[8]。

3 結(jié)果

3.1 不同極性鳶尾根提取物對變異鏈球菌的抑菌率 測定樣品的OD值計(jì)算抑制率，鳶尾根的乙酸乙酯提取物對變異鏈球菌的生長有抑制作用，依據(jù)MIC的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定乙酸乙酯提取物抑制變異鏈球菌生長的MIC50為500μg/mL，陽性組抑制率為(100±0.89)%。結(jié)果見表1。

表1 鳶尾根不同極性提取物對變異鏈球菌生長的抑制率 (%，n=3)

3.2 對變異鏈球菌BF形成的影響 測定測定樣品的OD值計(jì)算抑制BF形成的抑制率，鳶尾根的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物對變異鏈球菌BF形成均有一定的抑制作用。初步確定氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取部位對變異鏈球菌BF形成的SMIC50分別約為125μg/mL、 500μg/mL和500μg/mL。見表2。

表2 鳶尾根不同極性提取物對變異鏈球菌BF形成的抑制率 (%，n=3)

注：與陰性對照組相比，＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。

維藥鳶尾根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物對變異鏈球菌BF形成均有抑制作用，且呈劑量依賴性，各組抑制率與陰性對照組(0μg·mL-1)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中石油醚萃取物與氯仿、乙酸乙酯萃取物相比較弱(P<0.001)，與乙酸乙酯萃取物相比，載體表面活菌數(shù)多但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 維藥鳶尾根氯仿萃取物1000μg·mL-1時(shí)抑制變異鏈球菌BF形成活性明顯，陽性組抑制率為(84.13±1.74)%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 以上結(jié)果表明維藥鳶尾根不同極性萃取部位均有一定的體外抑制變異鏈球菌BF的形成。

4 討論

細(xì)菌BF是不同于浮游菌的另一種細(xì)菌存在形式，由細(xì)胞外保護(hù)性基質(zhì)和包裹其中的細(xì)菌群落組成，比浮游菌的代謝活性和對抗菌劑的敏感性均低，使其難以被消滅。變異鏈球菌及其在牙體表面黏附聚集形成的BF是致齲的主要因素，抑制其形成BF是防齲研究的關(guān)鍵[9]。目前臨床主要使用氯己定、季胺類化合物、金屬納米顆粒及抗菌肽等變異鏈球菌抗菌劑，并不能有效清除細(xì)菌BF，易產(chǎn)生耐藥性;同時(shí)，還存在引起味覺改變、菌群失調(diào)、細(xì)胞毒性及易被唾液蛋白酶降解等問題[10]。由于中藥毒副作用小，提取物成分復(fù)雜，不易產(chǎn)生耐藥作用。因此，從植物提取物中篩選抑制細(xì)菌BF形成的活性成分，對解決細(xì)菌耐藥性及臨床上與BF形成相關(guān)的頑固性、難治性感染等問題具有重要意義[11]。

喜堿鳶尾是鹽生草本植物，喜生于草甸草原、山坡荒地及潮濕鹽堿地，在新疆天山北麓一帶廣為分布，其抗旱、耐寒和抗蟲害特性，具有可改良鹽堿地、保持水土的生態(tài)價(jià)值[12]。對喜堿鳶尾根藥用價(jià)值的研究可促進(jìn)該植物的合理開發(fā)利用，但對喜堿鳶尾藥效活性成分的系統(tǒng)研究較少。鳶尾根系維吾爾醫(yī)的傳統(tǒng)藥材，臨床用其治療牙痛、咽喉腫痛、瘡癰等癥，尚未見對鳶尾根抑制致齲菌的相關(guān)研究。筆者研究維藥鳶尾根不同極性提取部位對變異鏈球菌生長及其BF形成的影響，篩選其抑菌活性部位，為其防治齲齒藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果表明，鳶尾根不同極性提取物所含化學(xué)成分的類別和含量不同，使其抑菌活性存在差異。鳶尾根乙酸乙酯提取物可抑制變異鏈球菌生長，氯仿、乙酸乙酯提取物可抑制其BF形成，并具有劑量依賴性，可確定氯仿、乙酸乙酯提取物為抑制變異鏈球菌的有效部位。對鳶尾根抗菌有效部位的藥效成分、抗菌種類、抑菌機(jī)理、富集與質(zhì)量控制方法等確定，需進(jìn)一步探索。

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Study on the Inhibitory Effect of Extracts from Uyghur Medicine Iris halophila pall.Root on Biofilm Formation of Stretopcoccus Mutans in Vitro

MA YU1TIAN Chunhong2SUN Liting1TIAN Li3*LIU Meng4

1. Department of Clinical Laboratory, The Fourth People’ Hospital of Urumqi, Urumqi 830002,China;2.Chinese Medical Hospital of Midong District in Urumqi, Urumqi 831400, China;3. College of TCM, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China;4. Affiliated Tumor Hospital，Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China

Objective To study the inhibitory effect of the different solvent extracts from Uyghur medicineIrishalophilapall. root on the development of Stretopcoccus mutans and formation of biofilm(BF). It will provide the experiment basis for prevention and treatment dental caries. Methods The different polarity extracts of Uyghur medicineIrishalophilapall. root were obtained by system solvent separation method. Microwell plate method was used to cultivate Stretopcoccus mutans BF model. The minimum inhibitory concentration(MIC) and the SMIC against BF of the different solvent extracts were investigated by double dilution method. Results The MIC50of ethyl acetate extract was 500μg/mL.The SMIC50of the chloroform extract and ethyl acetate extract were 125μg/mL and 500μg/mL respectively. Conclusion The chloroform extract and ethyl acetate extract showed obvious activity against Stretopcoccus mutans BF, which are worth further studying.

Uyghur MedicineIrishalophilapall. Root; Extract; Stretopcoccus Mutans; Biofilm

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(XJEDU2009S62)，新疆醫(yī)科大學(xué)“天山英才工程”專項(xiàng)基金項(xiàng)目(Y0382002)。

馬玉(1981-)，女，漢族，學(xué)士，研究方向微生物檢驗(yàn)。E-mail:67848101@qq.com

田莉(1975- )，女，漢族，博士，教授，研究方向中藥民族藥。E-mail: tianli109@126.com

R284.2

A

1007-8517(2017)15-0039-04

2017-06-07 編輯：梁志慶)