廣山藥總DNA提取方法的比較

高慧新 包道健 田 慧

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200

廣山藥總DNA提取方法的比較

高慧新 包道健 田 慧*

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200

目的：建立一種穩(wěn)定高效獲得廣山藥總DNA基因組的提取方法，為同科屬及同類植物總DNA提取提供參考依據(jù)，便于應(yīng)用分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。方法：通過采用試劑盒法、改良CTAB法和SDS法對(duì)廣山藥的新鮮葉子、新鮮塊莖、干燥塊莖和新鮮嫩莖進(jìn)行DNA提取，在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法進(jìn)行純度檢測(cè)。結(jié)果：3種方法均可以從不同的提取部位中提取到基因組DNA，但通過天根新型植物DNA提取試劑盒提取到的DNA純度最高，CTAB法次之，SDS法最差。結(jié)論：利用市售總DNA提取試劑盒提取DNA，方法簡(jiǎn)便高效，所提DNA效果好。

廣山藥；DNA提?。辉噭┖?；CTAB；SDS

廣山藥來源于薯蕷科薯蕷屬植物褐苞薯蕷DioscoreapersimilisPrain et Burkill[1]，又名廣西淮山，野生于海拔100～1950m的山坡、路旁、山谷雜木或灌叢中。我國(guó)南方各地也均有栽培，主產(chǎn)于廣西桂平、玉林、靈山、陸川、平南等[2]。褐苞薯蕷以根莖入藥，中醫(yī)用其補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精；壯醫(yī)用其“調(diào)谷道”氣道水道，補(bǔ)肺腎[1]。褐苞薯蕷在廣西、福建、海南等地被作為藥用與食用的山藥習(xí)用品由來已久[3]。褐苞薯蕷是重要的藥用植物資源，近年來，其以產(chǎn)量大、適應(yīng)力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，占據(jù)了藥材和食品市場(chǎng)的重要部分，充分說明了對(duì)其研究的必要性。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是近年來應(yīng)用在中草藥研究中的新技術(shù)，為中草藥基因圖譜建立、遺傳多樣性評(píng)估、分子標(biāo)記輔助育種等研究提供了有價(jià)值的工具[4]。DNA提取是開展中藥材DNA分子標(biāo)記研究的首要環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)運(yùn)用新型試劑盒法、CTAB法、SDS法，旨在避免大量的溶劑制備、方法和操作步驟的精簡(jiǎn)及提高DNA質(zhì)量，尋找一種能夠得到相對(duì)高產(chǎn)量、高純度的褐苞薯蕷總DNA的方法，對(duì)類似形態(tài)植物DNA 提取具有十分重要的意義，為后續(xù)褐苞薯蕷分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 材料 廣山藥的新鮮葉子、新鮮根莖、新鮮嫩莖均采自廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫校區(qū)，切取部分新鮮塊莖55℃烘干獲得干燥根莖。所采實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧副教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬植物褐苞薯蕷Dioscorea persimilis Prain et Burkill。

1.2 試劑 新型植物總DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：Q5118)，CTAB(生產(chǎn)批號(hào)：0504A16)，10%SDS(索萊寶，生產(chǎn)批號(hào)：20170328)，瓊脂糖(西班牙，生產(chǎn)批號(hào)：111860)，GelRed核酸染料(美國(guó)，生產(chǎn)批號(hào)：15G0611),Marker D2000(天根生化科技(北京)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：Q5317)，6×DNA loading buffer(索萊寶，生產(chǎn)批號(hào)：20160310), 其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 Eppendorf移液槍(德國(guó))；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海恒一)；HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣)；BSA224S電子天平(北京賽多利斯)；XW-80A旋渦混合器(上海滬西)；UV-1780紫外分光光度計(jì)(日本島津)；BIO-RAD電泳儀；BIO-RAD(Gel Doc XR+)凝膠成像系統(tǒng)。

2 方法

2.1 總DNA的提取

2.1.1 新型試劑盒法 按照試劑盒的操作步驟對(duì)各個(gè)部位進(jìn)行總DNA的提取。

2.1.2 CTAB法 參照文獻(xiàn)[5-6]方法并進(jìn)行改良，具體操作步驟為：①取實(shí)驗(yàn)材料適量，除去表面污染，加液氮快速研磨至粉末狀；②將適量粉末轉(zhuǎn)移至65℃水浴預(yù)熱好的盛有800μLCTAB和12μLβ-巰基乙醇混合液的離心管中，旋渦混勻；③繼續(xù)在65℃水浴1.5h(期間顛倒混勻數(shù)次)；④從水浴中取出離心管，靜置冷卻至室溫，加入等體積的苯酚和氯仿，漩渦混勻，靜置5min,12000r/min離心15min；⑤吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24∶1)，漩渦混勻，靜置5min, 12000r/min離心15min;⑥重復(fù)操作⑤；⑦取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置1h；⑧10000r/mim離心15min，棄上清液；⑨用75%的乙醇洗滌沉淀2次，10000r/min離心5min，棄乙醇；⑩將沉淀在室溫環(huán)境下晾干(應(yīng)避免污染)，向離心管中加入200μL TE或ddH2O定容，-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.3 SDS法 參照文獻(xiàn)[7-8]并做適當(dāng)調(diào)整，具體操作步驟如下：①取實(shí)驗(yàn)材料適量，除去表面污染，加液氮快速研磨至粉末狀；②取適量粉末至65℃預(yù)熱好的盛有600μL CTAB提取緩沖液[100mMTris-HC1(pH8.0)50mM EDTA，0.5MNaC1，2%(w/v)PVP，用前加β-巰基乙醇至終濃度為2%]和1000μL 10%SDS的混合液中，旋渦混勻，繼續(xù)65℃水浴30min(期間顛倒混勻2～3次)；③將離心管從水浴中取出，靜置冷卻至室溫，12000r/min離心15min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；④向離心管中加入等體積的苯酚和氯仿，旋渦混勻，靜置5min，12000r/min離心15min，取上清液至新的離心管中；⑤向離心管中加入等體積的苯酚和氯仿∶異戊醇(24∶1)，旋渦混勻，靜置5min,12000r/min離心15min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中；⑥加入等體積的異丙醇，上下顛倒使其混勻，靜置待絮狀沉淀出現(xiàn)；⑦12000r/min離心5min，棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2次，10000r/min離心5min；⑧將沉淀置室溫晾干(應(yīng)注意避免污染)，加入200μL TE或ddH2O溶解沉淀，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總DNA純度的檢測(cè)2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 取所提取的DNA 7μL與適量6×DNA loading buffer混合，點(diǎn)樣于濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，100V電壓下電泳30min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄圖像。

2.2.2 紫外分光光度法檢測(cè) 將提取得到的模板DNA做20倍稀釋(模板DNA50μL稀釋至1mL)后，用UV1780紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定其在260 nm和280nm處的吸光度A260和A280，以A260/A280的比值檢測(cè)其純度和濃度。

3 結(jié)果

3.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜 新鮮葉子和嫩莖的DNA條帶均比較明亮，新鮮根莖和干燥根莖的條帶不明顯。新型試劑盒法所提DNA沒有拖尾現(xiàn)象，不存在雜質(zhì)。CTAB法和SDS法所提DNA條帶均存在嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，說明DNA發(fā)生了降解，這可能與兩種方法提取時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)；從圖中結(jié)果可以很明顯看出，CTAB法和SDS法存在蛋白質(zhì)和RNA雜質(zhì)，SDS法雜質(zhì)較CTAB法多。見圖1。

3.2 紫外分光光度法檢測(cè) 新型試劑盒法所提DNA的A260/A280的值均在1.8-2.0之間，說明DNA比較純；CTAB和SDS法所提DNA的A260/A280的值，有的大于2.0，有的小于1.8，說明DNA中有RNA和蛋白質(zhì)殘留，這與凝膠電泳的結(jié)果是一致的。從濃度相比，新型試劑盒法的濃度最高，CTAB和SDS法濃度偏低。見表1。

表1 3種方法提取DNA檢測(cè)結(jié)果

4 討論

植物藥材除了具有細(xì)胞壁外，還存在大量的多糖、脂質(zhì)、色素和酚類等物質(zhì)，因此在植物DNA的提取和純化時(shí)，解聚核蛋白、去除蛋白質(zhì)、酚類和多糖等物質(zhì)是很重要的一步，故用不同的方法提取植物DNA效果是不一樣的。實(shí)驗(yàn)中使用的CTAB法和SDS法都是比較傳統(tǒng)的提取DNA的方法，CTAB和SDS都是去污劑，都是通過裂解植物細(xì)胞，將蛋白質(zhì)沉淀于有機(jī)試劑中，而核酸溶解于水相，再利用有機(jī)試劑多次抽提，從而達(dá)到去除蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，得到較純DNA的目的。新型試劑盒法是分子生物學(xué)發(fā)展的必然產(chǎn)物，試劑盒中的吸附柱有特殊的吸附膜，可以吸附DNA，經(jīng)簡(jiǎn)單的洗滌去除雜質(zhì)就可獲得相對(duì)高純度的DNA。三種方法相比較，新型試劑盒法獲得的DNA純度和濃度高，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，提取時(shí)間短，避免了有機(jī)試劑的配置，降低了有機(jī)試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的安全隱患，符合高效穩(wěn)定獲取廣山藥DNA的要求。

查閱文獻(xiàn)[9-11]可知，廣山藥中富含淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖及礦物質(zhì)等生物活性物質(zhì)，是其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可知，CTAB法和SDS法提取的DNA中，都存在RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的殘留，這可能與離心速率、試劑配置等有關(guān)，可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，如加入Rnase酶、增加抽提次數(shù)等。

根據(jù)不同方法對(duì)廣山藥總DNA提取的檢測(cè)結(jié)果，比較得出相對(duì)適合廣山藥總DNA提取的方法，便于利用分子標(biāo)記方法對(duì)廣山藥進(jìn)行鑒定。采用新型植物DNA提取試劑盒法提取的DNA純度和濃度都比其他兩種方法好。但在提取時(shí)也應(yīng)注意：在漂洗吸附柱時(shí)，加入漂洗液后可靜置1 min 后再進(jìn)行離心，這樣可以提高DNA的質(zhì)量；實(shí)驗(yàn)中必須要保證吸附材料是徹底晾干的，這樣可以避免漂洗液中的乙醇影響后續(xù)的反應(yīng)(如PCR等)。

[1]廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第一卷)[M].南寧:廣西科技出版社,2008:43.

[2]鄧家剛，韋松基.廣西道地藥材[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:15.

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[4]任夢(mèng)云,陳彥君,張盾,等.ISSR標(biāo)記技術(shù)在藥用植物資源中的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2017,10(4):63-69.

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Comparison of Total DNA Extraction Methods ofDioscoreapersimilisPrain et Burkill

GAO Huixin BAO Daojian TIAN Hui*

Guangxi University of Chinese Traditional Medicine, Nanning 530200,China

Objective To establish a stable and efficient method for the extraction of total DNA genome ofDioscoreapersimilisPrain et Burkill,and to lay the foundation for the extraction of total DNA of similar Chinese medicine, which is convenient for the identification of molecular biology. Methods DNA was extracted from fresh leaves, fresh tubers, dried tubers and fresh stems by using the Kit, modified CTAB method and SDS method, and subjected to agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometry for purity detection. Results Three kinds of methods could extract genomic DNA from different extraction sites, but the DNA purity was the highest by the DNAsecure Plant Kit of TIANGEN,CTAB method followed, SDS method is the worst. Conclusion The method of extracting DNA from the DNAsecure Plant Kit is simple and efficient, and the effect of DNA is good.

Rhizoma Dioscorea;DNA Extraction; Kit; CTAB; SDS

廣西中醫(yī)藥大學(xué)2015年度中藥學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)課題(ZYX2015001)；壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心(桂教科研[2013]20號(hào))；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(桂科基字[2014]32號(hào))；廣西重點(diǎn)學(xué)科壯藥學(xué)(桂教科研[2013]16號(hào))；廣西八桂學(xué)者中藥創(chuàng)新理論與藥效研究(J13162)。

高慧新(1993-)，女，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴幤贩N鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail:2456658048@qq.com

田慧(1973-)，女，碩士研究生，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幤贩N鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail:377244732@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2017)16-0027-03

2017-06-14 編輯：程鵬飛)