安國(guó)地區(qū)荊芥資源的調(diào)查報(bào)告與分析

熊 蕊 郭鳳柳 趙彩娟 劉曉慧 趙同欣 王 娜 孫寶山 顏 紅

保定出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 保定 071051

資源調(diào)查

安國(guó)地區(qū)荊芥資源的調(diào)查報(bào)告與分析

熊 蕊 郭鳳柳 趙彩娟 劉曉慧*趙同欣 王 娜 孫寶山 顏 紅

保定出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 保定 071051

目的：調(diào)查安國(guó)地區(qū)荊芥的資源狀況，為荊芥資源的保護(hù)及可持續(xù)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。方法：采用查閱文獻(xiàn)資料、實(shí)地調(diào)查及鑒定等方法對(duì)安國(guó)地區(qū)荊芥的資源分布狀況進(jìn)行全面了解，提取樣品基因組DNA，對(duì)ITS2和psbA-trnH序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及雙向測(cè)序，所有序列用軟件 DNAStar拼接，采用MEG6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算其種內(nèi)和種間 K2P 遺傳距離，并構(gòu)建鄰接樹(shù)。結(jié)果：安國(guó)地區(qū)荊芥集中分布在海拔23～36m，經(jīng)度115°27′～115°16′，緯度38°32′～38°20′區(qū)域內(nèi)的山坡路旁或山谷、林緣，目前主要以人工栽培為主。裂葉荊芥ITS2 序列長(zhǎng)度為 497bp，與其混偽品種間K2P 最小距離為 0.060，psbA-trnH序列長(zhǎng)度為 452bp，與其混偽品種間K2P 最小距離為 0.064，種間距離均大于其種內(nèi)距離，鄰接樹(shù)顯示可以將裂葉荊芥與其混偽品完全分開(kāi)。結(jié)論：歸納概述了安國(guó)地區(qū)荊芥的地理分布、資源量、藥用價(jià)值，ITS2 序列和psbA-trnH序列可鑒別荊芥及其混偽品，為荊芥的種質(zhì)資源鑒定和可持續(xù)利用開(kāi)發(fā)提出了切實(shí)可行的建議和措施。

荊芥；ITS2序列；psbA-trnH序列；地理分布；DNA條形碼

荊芥為唇形科植物荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)的干燥地上部分[1]，是著名的八大祁藥之一，其性味辛，微溫，歸肺、肝經(jīng)。具有祛風(fēng)解表、消瘡、透疹及止血的功效。荊芥在我國(guó)分布廣泛，臨床上多應(yīng)用栽培品。 河北安國(guó)和浙江蕭山都是歷史悠久的荊芥栽培基地[2]。由于中藥材的產(chǎn)地、遺傳因子、生態(tài)因子和栽培措施等因素均會(huì)對(duì)中藥材的有效成分產(chǎn)生影響，從而造成不同來(lái)源中藥材之間的差異。荊芥作為中國(guó)一味栽培歷史悠久、藥用范圍廣泛的植物，由于長(zhǎng)期自種自繁和地區(qū)間的相互不科學(xué)引種，導(dǎo)致群體混雜、種質(zhì)退化，其不同品種、不同產(chǎn)地生產(chǎn)出的藥材質(zhì)量良莠不齊，嚴(yán)重影響了荊芥藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。

隨著中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化的進(jìn)程，國(guó)內(nèi)外對(duì)荊芥的研究逐漸廣泛和深入，這對(duì)荊芥的產(chǎn)量和品質(zhì)提出更高更嚴(yán)格的要求。荊芥屬植物分布廣泛、生態(tài)適應(yīng)幅度大，且多型性及自然雜交現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致該屬植物在形態(tài)和化學(xué)上產(chǎn)生了很多變異，傳統(tǒng)鑒定困難，因此在荊芥的生產(chǎn)中存在著品種混亂的現(xiàn)象，直接影響到荊芥臨床用藥的安全、療效。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于荊芥的研究主要集中在化學(xué)成分、炮制和藥理作用方面[3-5]，而關(guān)于其種質(zhì)資源方面的報(bào)道較少。

DNA 條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA序列對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的一種分子診斷新技術(shù)[6]，具有簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn)，適用于中藥材的真?zhèn)舞b定。目前已有蕓薔薇科、香科等多個(gè)藥用植物豐富的植物科屬開(kāi)展了DNA 條形碼研究并取得良好鑒定效果[7]。本文利用自身優(yōu)勢(shì)，建立了荊芥的DNA條形碼方法，以期為該類藥材的臨床安全用藥和可持續(xù)利用荊芥種質(zhì)資源保護(hù)提供分子鑒定依據(jù)和保障。

1 研究范圍和調(diào)查方法

1.1 調(diào)查方法 走訪安國(guó)地區(qū)的藥材公司、飲片加工企業(yè)、當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)部門、藥監(jiān)部門、當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)等，全面了解祁荊芥的當(dāng)前資源產(chǎn)量；通過(guò)整理文獻(xiàn)、查閱標(biāo)本館標(biāo)本，以及走訪安國(guó)市藥材市場(chǎng)的市場(chǎng)信息人員，明確了安國(guó)地區(qū)荊芥主要分布區(qū)域，確定了祁州藥市街道、西佛落鄉(xiāng)、西安國(guó)城鄉(xiāng)、石佛鎮(zhèn)、北段村鄉(xiāng)、明官店鄉(xiāng)為主要調(diào)查區(qū)域。

1.2 DNA條形碼技術(shù)鑒別 走訪當(dāng)?shù)夭⒉杉钋G芥樣品，在查閱大量國(guó)內(nèi)外植物DNA條形碼文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)植物DNA條形碼研究現(xiàn)狀，選取CBOL推薦的作為陸地植物DNA條形碼通用的兩個(gè)片段：核基因ITS和葉綠體基因psbA-trnH作為荊芥樣品的擴(kuò)增引物。ITS2序列擴(kuò)增正向引物ITS2F：5’- ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3’；反向引物ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。psbA-trnH序列擴(kuò)增正向引物psbAF：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’。通過(guò)PCR技術(shù)獲得祁荊芥ITS和psbA-trnH的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)凝膠回收純化試劑盒回收純化后送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列校對(duì)后，在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，通過(guò)分析ITS2 和psbA-trnH基因的堿基序列，建立祁荊芥的DNA條形碼技術(shù)。1.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 河北安國(guó)地區(qū)裂葉荊芥ITS序列和psbA-trnH序列經(jīng) BLAST 搜索，下載搜索到的裂葉荊芥，唇形科另外4個(gè)屬植物：藿香屬(Agastache)、青蘭屬(Dracocephalum)、扁柄草屬(Lallemantia)、荊芥屬(Nepeta) 以及土荊芥(Dysphania)、水荊芥(Elsholtzia ciliata)的ITS 和psbA-trnH全序列。以裂葉荊芥ITS和psbA-trnH序列為內(nèi)群，以唇形科另外 4 個(gè)屬植物的ITS和psbA-trnH序列為外群，使用 DNAStar軟件對(duì)裂葉荊芥序列進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果均用MEGA 6.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining) 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 種資資源 裂葉荊芥為一年生草本，高60～100cm，具有強(qiáng)烈香氣。莖直立，四棱形，基部棕紫色，上部多分枝，全株被灰白色短柔毛。花期7～9月，果期9～11 月(圖1、圖2)。常生長(zhǎng)于山坡路旁或山谷、林緣。通過(guò)我們的實(shí)地調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在安國(guó)地區(qū)的祁州藥市街道、西佛落鄉(xiāng)、西安國(guó)城鄉(xiāng)、石佛鎮(zhèn)、北段村鄉(xiāng)、明官店鄉(xiāng)等區(qū)域均有大量的荊芥栽培(表1和圖3)。

表1 荊芥分布狀況

2.3 DNA條形碼擴(kuò)增結(jié)果與分析

2.3.1 中藥材祁荊芥ITS和psbA-trnH序列的PCR電泳檢測(cè) 從荊芥ITS和psbA-trnH序列PCR電泳圖譜(圖4、圖5)可以看出PCR擴(kuò)增結(jié)果都比較理想，均獲得清晰規(guī)則的條帶，無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)，表明這兩對(duì)引物對(duì)荊芥樣品基因組 DNA 均有很好的擴(kuò)增效果。

由圖4和圖5可知，荊芥ITS2和psbA-trnH序列均可以用通用引物擴(kuò)增出來(lái)，說(shuō)明通用引物的通用性高，可用于荊芥中ITS2和psbA-trnH基因的擴(kuò)增。這與線粒體DNA在細(xì)胞中比細(xì)胞核DNA拷貝量大有關(guān)。

表2 祁荊芥及其混偽品的樣品信息

續(xù)表

表2 祁荊芥及其混偽品的樣品信息

2.3.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果及分析 將所得片段回收、克隆、測(cè)序、校對(duì)后，在NCBI中經(jīng)BLAST比對(duì)分析，結(jié)果表明，ITS2序列DNA片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Schizonepetatenuifolia基因(登錄號(hào)：JN802670.1)的基因序列的相似性大于100%，psbA-trnH序列DNA片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Schizonepetatenuifolia基因(登錄號(hào)：AB728566.1)的基因序列的相似性大于99%，證明所得片段均為目的片段(圖6和圖7)。

2.3.3 遺傳距離分析 從 GeneBank 中下載與裂葉荊芥同科不同屬的唇形科另外 4 個(gè)屬植物以及土荊芥和水荊芥的ITS和psbA-trnH基因序列。應(yīng)用DNAstar序列分析軟件進(jìn)行基因序列比較，結(jié)果表明(見(jiàn)圖8、9)：河北安國(guó)地區(qū)裂葉荊芥(Schizonepeta-ANGUO-HBANG008)與來(lái)自中國(guó)不同產(chǎn)地及不同國(guó)家的裂葉荊芥 ITS和psbA-trnH 序列一致性均較高，ITS序列一致性在97.9%～100%之間，而psbA-trnH序列一致性則在99.0%～100%。國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地的裂葉荊芥ITS 序列一致性為99.4%～100%之間，psbA-trnH序列一致性為99.0%～100%之間。中、日、韓 3國(guó)裂葉荊芥 ITS 序列一致性為 100. 0%，中國(guó)裂葉荊芥與美國(guó)裂葉荊芥 ITS 序列一致性為 99.0%。由于GenBank中未收錄日、韓、美3國(guó)的psbA-trnH序列，故未進(jìn)行相關(guān)的基因序列比對(duì)。

不同植物的ITS和psbA-trnH序列進(jìn)行對(duì)比分析，利用MEGA6.0 軟件計(jì)算出物種間和物種內(nèi)的遺傳距離，從而達(dá)到區(qū)分不同物種的目的。從圖8可以看出，7～13 號(hào)屬于同種植物，遺傳距離介于 0.000～0.018 之間，但是同屬不同種植物之間的遺傳距離為 0.060～0.101，最大的種內(nèi)距離小于最小的種間距離；從圖9可以看出，6～9 號(hào)屬于同種植物，遺傳距離為0.000，但是同屬不同種植物之間的遺傳距離為 0.064～0.081，最大的種內(nèi)距離也小于最小的種間距離。因此，利用遺傳距離可以將不同物種準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)。另外，隨著親緣關(guān)系的變遠(yuǎn)，裂葉荊芥與水荊芥、土荊芥的遺傳距離很遠(yuǎn)，可以準(zhǔn)確的將正偽品區(qū)分開(kāi)。

2.3.4 構(gòu)建 NJ 樹(shù)進(jìn)行物種鑒定 為了更直觀地反映鑒定結(jié)果，本研究采用MEGA 6.0 軟件的鄰接法 (Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，構(gòu)建了 NJ 系統(tǒng)聚類樹(shù)?；?ITS 序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)可以看出(見(jiàn)圖10)進(jìn)化樹(shù)以土荊芥和水荊芥為樹(shù)根，由樹(shù)根分出2 個(gè)分支。其中以河北安國(guó)地區(qū)裂葉荊芥為代表的中國(guó)裂葉荊芥與來(lái)自日、韓、美 4 國(guó)的裂葉荊芥以 99% 的置信度形成單系群，該單系群分為 2 個(gè)分支，中、日、韓 3 國(guó)的裂葉荊芥形成分支Ⅰ，美國(guó)的裂葉荊芥單獨(dú)形成分支Ⅱ。裂葉荊芥與唇形科中的藿香屬親緣性最近，而與荊芥屬的親緣性較遠(yuǎn)。基于psbA-trnH序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)可以看出(見(jiàn)圖11)：進(jìn)化樹(shù)以土荊芥和裂葉荊芥為樹(shù)根，由樹(shù)根分出2 個(gè)分支。其中裂葉荊芥不同來(lái)源樣本均聚在一起，表現(xiàn)出單系性，可與其它密切相關(guān)物種明顯區(qū)分開(kāi)。

3 討 論

中藥荊芥是傳統(tǒng)的辛溫解表藥物，全草和穗加工后具有祛風(fēng)解表、宣毒透疹、散瘀止血之功效，常用于治療感冒發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛及多種皮膚病。荊芥炒炭后專功止血，常在吐血、衄血、便血、崩漏、產(chǎn)后血暈等方面發(fā)揮作用，為中醫(yī)臨床常用中藥材[8]。荊芥所含化學(xué)成分種類較多，目前從荊芥中分離鑒定了揮發(fā)油類、萜類、甾類、黃酮類及酚酸類等化合物。其中揮發(fā)油類為荊芥屬植物的主要有效成分，此類研究報(bào)道也居多，研究表明其具有抗炎鎮(zhèn)痛、去痰平喘、抗癌抗氧化等作用[9-10]。一般說(shuō)來(lái)，荊芥各個(gè)部位的揮發(fā)油含量的順序?yàn)椋呵G芥穗>荊芥>荊芥梗>荊芥炭。Mi-Hee Chun 等[11]應(yīng)用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(SPME-GC/MS) 法分析出荊芥揮發(fā)油的主要成分為單萜酮類、單萜醇類和倍半萜。張麗等[12]對(duì)河北安國(guó)荊芥進(jìn)行指紋圖譜分析，建立了荊芥穗揮發(fā)油 HSGC 指紋圖譜。

因安國(guó)市部分地區(qū)的地形地勢(shì)、氣候、土壤條件適宜荊芥的生長(zhǎng)，本市轄區(qū)內(nèi)的廣大人民群眾，長(zhǎng)期以來(lái)利用荊芥來(lái)治療皮膚病、婦科病、流行性感冒等等極為普遍。現(xiàn)有荊芥研究多集中在化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面，有關(guān)種質(zhì)資源多樣性、不同種質(zhì)之間鑒定等方面研究尚屬空白。

DNA 條形碼是目前國(guó)際上最新物種鑒定技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建中藥材 DNA 條形碼技術(shù)鑒定體系，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材原植物、飲片、粉末以及細(xì)胞、組織等材料來(lái)源的準(zhǔn)確快速鑒定，該技術(shù)易于掌握，便于推廣，對(duì)緩解傳統(tǒng)鑒定人才缺乏、藥材鑒定困難、確保中藥材的安全有效均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究利用 ITS2 和psbA-trnH條形碼對(duì)裂葉荊芥、唇形科另外 4 個(gè)屬植物、土荊芥和水荊芥等中藥材進(jìn)行系統(tǒng)的比較鑒別，旨為該類藥材的質(zhì)量控制及臨床安全用藥提供分子鑒定依據(jù)和保障。

從遺傳距離可以看出，河北安國(guó)地區(qū)裂葉荊芥與來(lái)自中國(guó)不同產(chǎn)地及不同國(guó)家的裂葉荊芥 ITS和psbA-trnH 序列一致性均較高，ITS序列一致性達(dá)97.0%以上，psbA-trnH 序列一致性則達(dá)99.0%以上，雖然序列中有一些堿基的變異，但這種變異未超過(guò)一個(gè)種范圍內(nèi)的變異。不同地區(qū)同一物種之間的堿基序列變異少，遺傳距離小；而不同物種之間的堿基序列變異大，遺傳距離大，且最大的種內(nèi)距離小于最小的種間距離。裂葉荊芥、藿香屬、青蘭屬、扁柄草屬和荊芥屬屬于唇形科的不同屬，他們之間的遺傳距離較遠(yuǎn)；土荊芥為藜科植物，與裂葉荊芥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳距離也很遠(yuǎn)。說(shuō)明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，遺傳距離越大。因此，可以利用遺傳距離精確地將不同物種分開(kāi)。

植物的分布和系統(tǒng)發(fā)育一般與地理位置存在一定的關(guān)系[13]。從建立的系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹(shù)也可以看出，裂葉荊芥的聚類結(jié)果與實(shí)際地理位置相符。中、美、日、韓 4 國(guó)的裂葉荊芥根據(jù)地理位置分為2 個(gè)分支，說(shuō)明裂葉荊芥的種間變異主要受地理位置的影響。而且裂葉荊芥不同來(lái)源樣本均聚在一起，表現(xiàn)出單系性，可與其他密切相關(guān)物種明顯區(qū)分開(kāi)。鄰接樹(shù)和遺傳距離反映的結(jié)果一致，說(shuō)明ITS和psbA-trnH序列可作為裂葉荊芥的 DNA 條形碼。

4 資源保護(hù)和持續(xù)合理利用建議

荊芥應(yīng)用歷史悠久，原為野生，現(xiàn)臨床上所應(yīng)用的多為人工栽培，市場(chǎng)上主要流通的是河北安國(guó)、玉田等地的生產(chǎn)種質(zhì)。由于長(zhǎng)期自種自繁、不科學(xué)引種，導(dǎo)致群體混雜、種質(zhì)退化，影響了荊芥藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)[14]。近年來(lái)對(duì)荊芥的有關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分、炮制方法、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面，而對(duì)荊芥種質(zhì)資源的多樣性、不同種質(zhì)之間鑒定等方面研究較少[15]。對(duì)于植物中藥材的品種鑒定還停留在藥材性狀、顯微特征等傳統(tǒng)方法上，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、重復(fù)性差，準(zhǔn)確度低。另外，對(duì)于荊芥的藥理作用多見(jiàn)于抗炎除菌方面，化學(xué)成分的研究又多集中在揮發(fā)油類物質(zhì)，而對(duì)解熱止血和非揮發(fā)油成分等方面的研究較少。

在開(kāi)發(fā)利用的同時(shí)，對(duì)藥用植物資源的保護(hù)管理應(yīng)加大力度。首先應(yīng)多形式廣泛宣傳保護(hù)資源的重要意義，提高認(rèn)識(shí)[16]，加強(qiáng)對(duì)藥用植物的宣傳力度，樹(shù)立起可持續(xù)發(fā)展的思想觀念；其次采取有力措施，合理利用植物中藥資源，保證藥材的優(yōu)良種質(zhì)；再次隨著新的鑒定技術(shù)在中藥材鑒定方面的普及，今后應(yīng)該著力開(kāi)展除傳統(tǒng)方法以外的研究技術(shù)，比如通過(guò)指紋圖譜、分子生物學(xué)技術(shù)等現(xiàn)代鑒定手段對(duì)荊芥種質(zhì)進(jìn)行鑒定；最后應(yīng)加大其它主要有效成分的研究力度，為提高中藥材質(zhì)量，保證臨床用藥安全和有效提供保障[17]。

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Investigation Report onSchizonepetaetenuifoliaResources in Anguo Area

XIONGRui GUO Fengliu ZHAO Caijuan LIU Xiaohui*ZHAO Tongxin WANGNa SUN Baoshan YANHong

BaoDing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Bao ding 071051， China

Objective To investigate resources ofSchizonepetaetenuifoliain Herba，so as to provide reference for local resource protection and reasonable development and use. Methods To investigate the resources of theSchizonepetaetenuifoliain Herba Province, literature retrieval, on-the-spot investigation, visiting, gathering identification, specimen collection, classification and identification were carried out. The DNA was extracted from the samples、TS2 and psbA-trnH was amplified and sequenced. Sequence assembly was performed using the DNAStar. The genetic distances and vayiable sites of ITS and psbA-trnH region were analyzed using MEG6.0 after sequence alignmeng, and the phylogenetic tree was constructed by the neighbor joining method. Results TheSchizonepetaetenuifoliain Herba Province mainly were widely distributed, altitude 23～36m, longitude 115°27′～115°16′, latitude 38°32′～38°20′, within the area of hillside or valley, forest edge. At present, it is mainly by artificial cultivation. The sequence length of the ITS2 ofSchizonepetaetenuifoliawas 497bp, and the results showed that the minimum inter-specific divergence was 0.060; The sequence length of the psbA-trnH of Schizonepetae tenuifolia was 452 bp, and the results showed that the minimum inter-specific divergence was 0.064, which was larger than the maximum intra-specific divergence. The phylogenetic tree indicated thatSchizonepetatenuifoliacould be distinguished from its adulterants obviously. Conclusion Combined with the litersture, effective suggestions measures of theSchizonepetaetenuifoliain Herba Province. ITS2 and psbA-trnH indicated thatSchizonepetatenuifoliacould be distinguished from its adulterants obviously. Meanwhile, some suggestions and measures were put forward for protection and reasonable development of plant resources of Schizonepetae tenuifolia.

Schizonepetatenuifolia; ITS Sequence; PsbA-trnH Sequence ; Geographical Distribution; DNA Barcoding

河北出入境檢驗(yàn)檢疫局自主立項(xiàng)項(xiàng)目(HE2014K043)。

熊蕊 (1982-)，女，漢族，碩士研究生，中級(jí)獸醫(yī)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物檢疫和食品微生物學(xué)。E-mail: xiongrui1982126@126.com

劉曉慧(1980-)，女，漢族，博士研究生，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物檢疫和食品微生物學(xué)。E-mail: drlxh@163.com

R282.71

A

1007-8517(2017)16-0136-07

2017-06-07 編輯：陶希睿)