甲狀腺癌復(fù)發(fā)與BRAF基因突變的關(guān)系研究

宋傳偉

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.16.019

[摘要] 目的 探討B(tài)RAF基因突變與甲狀腺癌復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。方法 方便選擇2014年4月—2015年4月期間該院收治的復(fù)發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌患者22例（復(fù)發(fā)組）的復(fù)發(fā)灶和原發(fā)灶標(biāo)本為研究對象，再選擇同期收治的無復(fù)發(fā)生存的甲狀腺癌患者21例為對照組，分別對兩組的BRAF基因進(jìn)行測序，對T1799A位點(diǎn)的V600E突變情況進(jìn)行觀察。結(jié)果 復(fù)發(fā)組中復(fù)發(fā)病灶與原發(fā)病灶BRAF基因T1799A位點(diǎn)V600E突變率分別為50.00%（11/22）、60.00%（12/20），其中1例患者的復(fù)發(fā)灶BRAF基因?yàn)橐吧停l(fā)灶為突變型；同時(shí)，對照組的BRAF基因1799A位點(diǎn)V600E突變率為22.73%（5/22）；兩組的BRAF突變率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 甲狀腺癌復(fù)發(fā)與BRAF基因突變有關(guān)，BRAF基因突變患者術(shù)后更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，并且原發(fā)灶基因表型與復(fù)發(fā)灶不一致。

[關(guān)鍵詞] BRAF基因突變；復(fù)發(fā)；甲狀腺癌

[中圖分類號] R736 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）06（a）-0019-03

Research on Correlation between the Recurrence of Thyroid Cancer and BRAF Gene Mutation

SONG Chuan-wei

Department of Breast and Thyroid Surgery， Heze Municiple Hospital， Heze， Shandong Province， 274000 China

[Abstract] Objective To discuss the correlation between the recurrence of thyroid cancer and BRAF gene mutation. Methods The recurrence lesions and primary lesions specimens of 22 cases with papillary thyroid carcinoma admitted and treated in our hospital from April 2014 to April 2015 were selected and 21 cases of patients with thyroid carcinoma without recurrence admitted and treated in our hospital at the same period were selected as the control group， and the BRAF gene was sequenced， and V600E mutation at T1799A was observed. Results The V600E mutation rate at T1799A locus of recurrent lesions and primary lesions BRAF in the recurrence group was respectively 50.00%（11/22）and 60.00%（12/20）， and the recurrent lesion of BRAF gene of 1 case was wild type， but the primary lesion was mutation， at the same time， the V600E mutation rate at 1799A locus in the control group was 22.73%（5/22）， and the difference in the BRAF mutation rate between the two groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The recurrence of thyroid cancer is related to the BRAF gene mutation， and the patients with BRAF gene mutation are easy to reoccur， and the gene phenotypes of primary lesions are not consistent with recurrent lesions.

[Key words] BRAF gene mutation； Recurrence； Thyroid cancer

甲狀腺癌是比較常見的一種甲狀腺惡性腫瘤，在全身惡性腫瘤中占有較高的比例，約為1%～3%左右，并且在頭頸部腫瘤中具有較高的發(fā)病率，居于首位，常見癥狀有吞咽困難、聲音嘶啞以及腫塊等，不僅危害患者健康，還嚴(yán)重影響患者的正常生活和工作。當(dāng)前臨床上在治療甲狀腺癌時(shí)，有多種多樣的方法，包括放射性核素治療、內(nèi)分泌治療以及手術(shù)治療等，大多數(shù)甲狀腺癌患者可以獲得較好的預(yù)后，但是少數(shù)患者術(shù)后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)，并且預(yù)后較差。BRAF因子作為Ras-Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，長約190kb，位于人染色體7q34，通過絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶發(fā)揮作用，該酶通過ERK、MEK以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞表面的RAS蛋白和受體相連接，啟動(dòng)多種因子，對細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件進(jìn)行調(diào)控，包括細(xì)胞凋亡、分化以及生長等，有研究發(fā)現(xiàn)[1]，BRAF在甲狀腺癌的高、中、低分化中具有較高的陽性表達(dá)率，并且腫瘤分化程度與其表達(dá)呈正比關(guān)系，可以作為判斷患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。因此，該文研究了2014年4月—2015年4月期間該院收治的復(fù)發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌患者22例與BRAF基因突變之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選擇該院收治的復(fù)發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌患者22例（復(fù)發(fā)組）為研究對象，年齡22～80歲，平均（50.3±18.5）歲，其中15例為女性、7例為男性；再選擇同期收治的21例無復(fù)發(fā)生存的甲狀腺癌患者為對照組，其中8例為男性、13例為女性，年齡23～76歲，平均（50.1±18.6）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合甲狀腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)；③患者自愿參與，且簽署同意書；④無重大內(nèi)科疾病史、頭頸部腫瘤病史以及術(shù)前治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重精神異?；蛞庾R障礙者；②不愿意參與研究者；③哺乳期或妊娠期婦女；④臨床資料不完善者。兩組的性別比、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 檢測BRAF基因T1799A位點(diǎn)突變

將上述蠟塊送至上海生物醫(yī)藥公司進(jìn)行純化處理后，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，然后直接測序，并且對比分析BRAF基因組DNA正常序列與所得結(jié)果，判斷是否存在點(diǎn)突變。

1.2.1 提取DNA 按照常規(guī)方法，碾碎上述所取蠟塊標(biāo)本，對DNA進(jìn)行提取，并且在-20°C條件下保存提取的DNA以備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段 ①引物設(shè)計(jì)。選擇上海生物醫(yī)藥公司合成的引物，引物序列如下：反向引物為5-GGCCAAAAAT-TTAATCAGTGGA-3，正向引物為5TCATAATGCTTGC-TCTGATAGGA-3，目標(biāo)片段擴(kuò)增后長度為224 bp。②PCR反應(yīng)體系。通常情況下，PCR反應(yīng)條件為：59.1°C退火30 s，94°C預(yù)變性3 min，72°C延伸30 s，94°C變性30 s，連續(xù)35個(gè)循環(huán)，然后在72°C中進(jìn)行8min延伸后結(jié)束。PCR反應(yīng)體系：17.8μl雙蒸水，2.5 μL擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）×10，正向引物和反向引物各0.5 μL（20 μmol/L），1.5 μlDNA模板，0.2 μL（5 U/μL）Tap DNA聚合酶，2.0 μL（10 mmol/L）dNTP，總體積為25 μL。

1.2.3 電泳檢測PCR產(chǎn)物 為了確定PCR產(chǎn)物中存在目標(biāo)DNA片段，在1.0 μL DNA加樣緩沖液中加入5 μLPCR產(chǎn)物中均勻混合后加樣，然后選擇1.0 μL DNA標(biāo)記物作為分子對照，在6%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行AgNO3染色并行電泳。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 在電泳檢測中，確定為PCR產(chǎn)物后，將其送至上海生物醫(yī)藥公司進(jìn)行純化并測序，對比分析BRAF基因組DNA正常序列與所得結(jié)果，判斷是否存在點(diǎn)突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 15.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

復(fù)發(fā)組中復(fù)發(fā)病灶與原發(fā)病灶BRAF基因T1799A位點(diǎn)V600E突變率分別為50.00%（11/22）、60.00%（12/20），其中1例患者的復(fù)發(fā)灶BRAF基因?yàn)橐吧?，而原發(fā)灶為突變型；同時(shí)，對照組的BRAF基因1799A位點(diǎn)V600E突變率為22.73%（5/22）；兩組的BRAF突變率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.273，P<0.05）。

3 討論

近年來，甲狀腺癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，不僅影響患者的正常生活，已經(jīng)成為危害社會公眾健康的一種重要疾病。通常情況下，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在臨床上又被稱之為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，是MAPK信號傳導(dǎo)通路的一個(gè)下游蛋白激酶，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極其重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，MAPK通路串聯(lián)激酶的激活與70%甲狀腺癌有關(guān)，并且濾泡狀腺癌、甲狀腺腺瘤與RAS基因突變有關(guān)，而甲狀腺乳頭狀癌（PTC）與BRAF基因突變和染色體重組致癌基因融合有關(guān)，并且散發(fā)性成年人PTC具有較高的BRAF基因突變率，尤其是BRAF T1799A突變熱點(diǎn)[2]。一般來說，在甲狀腺單發(fā)結(jié)節(jié)患者中，惡性結(jié)節(jié)所占比例較低，約為5%～8%左右，所以大部分甲狀腺結(jié)節(jié)不需要行手術(shù)治療，當(dāng)前在鑒別診斷甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)時(shí)，甲狀腺FNA細(xì)胞學(xué)檢查作為一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)，但是在應(yīng)用的過程中，容易受到諸多因素如采集細(xì)胞數(shù)等影響，約30%結(jié)節(jié)無法準(zhǔn)確診斷，只有行手術(shù)切除活檢才可以確診。因?yàn)锽RAF基因突變作為PTC比較常見的一個(gè)分子遺傳學(xué)改變，即使是微小的PTC也能檢出，而良性病變組織和正常甲狀腺組織中不存在這一基因突變，所以對BRAF基因突變進(jìn)行檢測，有助于鑒別和診斷甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)。臨床研究資料表明，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和發(fā)展作為多步驟、多基因的一個(gè)過程，在RET/PTC-RAS-RAF-MARK途徑中，基因突變占有較高的比例，約為80%左右，其中BRAF具有較高的基因突變率，為44%，并且有文獻(xiàn)報(bào)道，BRAF突變型甲狀腺乳頭狀癌具有較強(qiáng)的組織侵襲力，容易對甲狀腺周圍組織產(chǎn)生浸潤，臨床分期晚，預(yù)后差[3]。在該次研究中，復(fù)發(fā)組中復(fù)發(fā)病灶與原發(fā)病灶BRAF基因T1799A位點(diǎn)V600E突變率分別為50.00%（11/22）、60.00%（12/20），明顯高于對照組的BRAF基因1799A位點(diǎn)V600E突變率為22.73%（5/22），陳小麗等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)，健康對照組的BRAR基因1799位點(diǎn)V600E突變率為24.00%（6/25），明顯低于觀察組的65.00%（16/25），這一結(jié)果與該次研究報(bào)道相符，說明BRAF基因突變是導(dǎo)致甲狀腺癌復(fù)發(fā)的一個(gè)重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，BRAF基因突變是誘發(fā)MAPK信號通路異常激活的一個(gè)重要因素，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的BRAF基因突變類型已經(jīng)超過40種，其中T1799A位點(diǎn)的V600E變異比較常見，但是腫瘤的惡性行為是否與BRAF突變有關(guān)，臨床上還存在著一定的爭議。近年來，Riescoeizaguirre等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，碘代謝基因的低表達(dá)與BRAF基因突變有關(guān)，說明部分分化型甲狀腺癌放療中的“碘抗拒”與BRAF有關(guān)。同時(shí)，通過將MAPK信號通路激活，BRAF基因V600E點(diǎn)突變的致癌作用較強(qiáng)，能夠誘發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、惡變細(xì)胞包膜浸潤等[6]。而Knauf等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，BRAF基因V600E突變的甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)后更容易殘留癌組織，并且具有較高的風(fēng)險(xiǎn)，與該次研究報(bào)道一致。此外，原發(fā)灶與復(fù)發(fā)腫瘤作為單細(xì)胞克隆，其分子表型應(yīng)該相同，但是在研究中發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶的受體表型容易發(fā)生變異，還需要更深入研究[8-11]。

綜上所述，BRAF基因突變與甲狀腺癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并且BRAF基因突變患者術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高]，臨床上應(yīng)該重視基因分型診斷，有助于判斷患者預(yù)后。

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（收稿日期：2017-03-09）