ATP適體接枝Fe3O4納米粒子的制備及化學(xué)發(fā)光酶檢測(cè)應(yīng)用

嚴(yán)喜鸞 陳馨 高文菊 魏婷婷 林月敏 艾凡榮

(1南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌330031)(2南昌大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，南昌330031)(3南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，南昌330031)

ATP適體接枝Fe3O4納米粒子的制備及化學(xué)發(fā)光酶檢測(cè)應(yīng)用

嚴(yán)喜鸞1陳馨1高文菊1魏婷婷1林月敏1艾凡榮＊,2,3

(1南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌330031)
(2南昌大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，南昌330031)
(3南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，南昌330031)

制備了油酸修飾的Fe3O4納米粒子，利用鹽酸多巴胺對(duì)其表面進(jìn)行氨基化改性，制得水分散性良好的Fe3O4納米粒子，用X射線衍射、透射電鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)和紫外-可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行表征。隨后，將氨基修飾的三磷酸腺苷(ATP)適體接枝到Fe3O4納米粒子上，結(jié)合熒光素酶化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行ATP的定量檢測(cè)，并應(yīng)用于市售酸奶中乳酸菌ATP含量的檢測(cè)，其靈敏度高、重現(xiàn)性好。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的Fe3O4納米粒子是一種分散性好、易分離的載體，其粒徑均一、穩(wěn)定、磁性強(qiáng)、與適體結(jié)合性能好，拓展了Fe3O4納米粒子在分析檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

Fe3O4；納米粒子；氨基功能化；適體；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

0 引言

化學(xué)發(fā)光是在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象，通過(guò)檢測(cè)其發(fā)光值可以測(cè)定反應(yīng)物、催化劑、增敏劑、抑制劑等物質(zhì)的含量[1]，化學(xué)發(fā)光分析法不需外來(lái)光源、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單[2]，在食品、環(huán)境和臨床檢測(cè)等方面有良好的應(yīng)用前景[3-6]。適體是通過(guò)指數(shù)級(jí)富集的配體進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponential enrichment，SELEX)獲得的寡核苷酸鏈，能以較高的親和力與配體結(jié)合，含有20～80個(gè)堿基[7]。近年來(lái)，SELEX技術(shù)發(fā)展迅速[8]，適體種類不斷增多，應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，不僅可用于血小板衍生因子[9]、多巴胺[10]、黃曲霉毒素[11]等小分子物質(zhì)的檢測(cè)，還可用于病毒[12]和細(xì)菌[13]等活性物質(zhì)的檢測(cè)。將適體固定在磁性納米粒子、金電極、膜材料、碳納米材料等支持物上[15-18]，可在復(fù)雜環(huán)境中特異性地識(shí)別出目標(biāo)物，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離[19]。其中磁性納米粒子中的Fe3O4納米粒子由于具有超順磁性、生物相容性好且不影響適體的性能，是一種良好的適體結(jié)合的載體[20-22]。

本文首先采用共沉淀法，制備了油酸修飾的Fe3O4納米粒子，采用鹽酸多巴胺對(duì)其表面進(jìn)行氨基化改性，獲得水溶性Fe3O4納米粒子。然后以戊二醛為交聯(lián)劑，將氨基修飾的ATP適體連接到氨基化的Fe3O4納米粒子上，并通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤(guanine，G)堿基與苯甲酰甲醛溶液發(fā)生瞬時(shí)衍生反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光[23]，定量檢測(cè)優(yōu)化Fe3O4納米粒子的量。采用自制Fe3O4納米粒子作為載體，先結(jié)合ATP適體，再加入不同濃度的ATP，利用熒光素酶進(jìn)行ATP的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，結(jié)果表明該方法可用于ATP的定量檢測(cè)。同時(shí)，由于酸奶中含有大量的乳酸菌，單個(gè)活菌體內(nèi)含有10-18mol的ATP[24]，而每毫升市售酸奶中乳酸菌的量可達(dá)2.65×1010個(gè)以上[25]，故將自制Fe3O4納米粒子應(yīng)用于市售酸奶中乳酸菌ATP的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，以此驗(yàn)證自制Fe3O4納米粒子的實(shí)際生物檢測(cè)應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)示意圖如圖1所示。

圖1 ATP適體接枝Fe3O4納米粒子的制備及化學(xué)發(fā)光示意圖Fig.1Preparation and chemiluminescence schematic presentation of ATP aptamer grafted Fe3O4nanoparticles

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

ATP熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司(USA)；苯扎氯銨購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸多巴胺購(gòu)于上海麥克林生化科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、苯甲酰甲醛、5-腺苷三磷酸二鈉鹽(ATP)；胞苷-5-三磷酸二鈉鹽(CTP)、鳥(niǎo)苷-5-三磷酸二鈉鹽(GTP)、尿苷-5-三磷酸三鈉鹽(UTP)均購(gòu)于上海愛(ài)紫特生物科技有限公司；ATP適體(核酸序列為5-AgAgAACCTgggggAgTATTgCggAggAAggTTTTTTT-3-NH2)由上海生工生物工程有限公司合成；市售酸奶購(gòu)于江西陽(yáng)光乳業(yè)股份有限公司；其他試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有的藥品都是分析純。

吡啶清洗液(pH 6.0，吡啶-鹽酸)；BA雜交液(pH 8.0，20 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷與0.5 mol·L-1氯化鈉)；WB洗滌液(pH 8.0，7 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷，0.17 mol·L-1氯化鈉，0.05%吐溫20)；AA適體反應(yīng)液(pH 8.3，20 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷，300 mmol·L-1氯化鈉，5 mmol·L-1氯化鎂)；四丁基氫氧化銨-磷酸緩沖液(pH 8.5，四丁基氫氧化銨-磷酸)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

集熱式恒溫磁力攪拌器(DF-101S，河南鞏義予華儀器設(shè)備有限公司)；分析天平(BSA124S，賽多利思科學(xué)儀器有限公司)；磁性分離器(CS15000，美國(guó)Invritroge公司)；移液器(德國(guó)Eppendorf公司10～1 000 μL)；BPCL微弱發(fā)光儀(BPCL-1-TGC，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所)；恒溫震蕩儀(HZ-9211KB，太倉(cāng)市科教器材廠)；超聲儀(SB-80，寧波新芝生物科技有限公司)；超純水機(jī)(UPHW-111-90T，四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Fe3O4納米粒子的制備

1.稅收規(guī)劃有助于提高企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力。在激烈的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中，在生產(chǎn)、營(yíng)銷和營(yíng)銷企業(yè)中，他知道并利用稅收規(guī)劃，他在競(jìng)爭(zhēng)中獲勝。

稱取0.860 g FeCl2·4H2O和2.350 g FeCl3· 6H2O，分別用20 mL超純水超聲溶解，加入250 mL三口燒瓶中，置于恒溫油浴鍋中，室溫?cái)嚢?～3 min；迅速加入3.75 mL NH3·H2O，攪拌均勻，緩慢地滴加0.3 mL油酸，升溫至80℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加入30 mL氯仿，然后加入100 mL NaCl溶液(1 mol·L-1)，靜置分層，棄上層溶液。用30 mL乙醇洗滌，磁鐵收集Fe3O4粒子并分散于氯仿溶液中，制得油酸改性的Fe3O4納米粒子，備用。

1.3.2 氨基化改性

取1 mL油酸改性的Fe3O4納米粒子，加入15 mg鹽酸多巴胺溶液中(先用20 mL超純水溶解，隨后加入100 μL濃度為1 mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)pH=4.0)，振蕩5 min；磁性分離去掉廢液，乙醇超聲分散，離心15 min(轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1)，棄上清液，加入10.0 mL超純水超聲分散，制得氨基化改性的Fe3O4納米粒子，4℃保存。

1.3.3 與ATP適體的連接

取不同量氨基改性的Fe3O4納米粒子(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μmol)，吡啶緩沖液清洗3次，磁性分離，加入200 μL戊二醛溶液，室溫振蕩(轉(zhuǎn)速為170 r·min-1，下同)3 h。分別加入10 pmol ATP適體，室溫振蕩1 h。WB清洗液洗滌3次，磁性分離，用10 μL四丁基磷酸鹽緩沖液將Fe3O4納米粒子轉(zhuǎn)移至一端開(kāi)口的圓柱形玻璃瓶，置于BPCL微弱發(fā)光儀中，加入90 μL苯甲酰甲醛溶液測(cè)量發(fā)光值，取自最高信號(hào)值起之后的10 s的積分值作為信號(hào)值。

1.3.4 ATP的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

取1.0 μmol氨基改性的Fe3O4納米粒子，吡啶緩沖液清洗3次，磁性分離，加入200 μL戊二醛溶液，室溫振蕩3 h。加入10 pmol ATP適體，室溫振蕩1 h。WB清洗液洗滌3次，加入200 μL 2%的BSA溶液，室溫振蕩1 h。WB清洗液洗滌3次，將Fe3O4納米粒子加入100 μL ATP(濃度為2、4、6、8、10、12 μmol·L-1)溶液中，室溫振蕩1 h。WB清洗液洗滌3次，磁性分離，用10 μL超純水將Fe3O4納米粒子轉(zhuǎn)移至一端開(kāi)口的圓柱形玻璃瓶，置于BPCL微弱發(fā)光儀中，加入90 μL熒光素酶緩沖液測(cè)量發(fā)光值，取自最高信號(hào)值起之后的10 s的積分值作為信號(hào)值。

1.3.5 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP的特異性及干擾性實(shí)驗(yàn)

1.3.6 酸奶中乳酸菌ATP含量的檢測(cè)

乳酸菌ATP的提取[24]：分別取100、300、600 μL酸奶用超純水稀釋至1 mL，12 000 r·min-1離心10 min，去上清液，加1%苯扎氯銨溶液1 mL懸浮沉淀，常溫反應(yīng)3 min，12 000 r·min-1離心10 min得上清液備用。

取1.0 μmol氨基改性的Fe3O4納米粒子，吡啶緩沖液清洗3次，磁性分離，加入200 μL戊二醛溶液，室溫振蕩3h。加入10 pmol ATP適體，室溫振蕩1 h。WB清洗液洗滌3次，加入200 μL 2%的BSA溶液，室溫振蕩1 h。WB清洗液洗滌3次，磁性分離，加入100 μL乳酸菌ATP提取物中，室溫振蕩1 h。WB清洗液洗滌3次，磁性分離，用10 μL超純水將Fe3O4納米粒子轉(zhuǎn)移至一端開(kāi)口的圓柱形玻璃瓶，置于BPCL微弱發(fā)光儀中，加入90 μL熒光素酶緩沖液測(cè)量發(fā)光值，取自最高信號(hào)值起之后的10 s的積分值作為信號(hào)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 多巴胺改性Fe3O4納米粒子的表征

圖2為制備得到的磁性粒子的X射線衍射圖，粒子物相為反尖晶石結(jié)構(gòu)的Fe3O4，峰形窄且尖銳，說(shuō)明結(jié)晶完整。圖a和b分別為鹽酸多巴胺溶液改性，氨基修飾前后的Fe3O4納米粒子的X射線衍射圖。從圖中可以明顯的看到氨基修飾前后衍射峰基本沒(méi)有變化，表明在改性中Fe3O4的晶體結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，但由親油性變成親水性。從圖上得到改性前后的磁性微粒的衍射峰都出現(xiàn)在2θ=30.430°，35.800°，43.480°，57.350°，62.920°處，與Fe3O4的立方晶面相對(duì)應(yīng)。圖中20～30之間有1個(gè)微弱的彌散峰，應(yīng)該是由于Fe3O4粒子表面存在的油酸及多巴胺所致。根據(jù)Scherrer公式：

圖2 Fe3O4納米粒子X(jué)RD圖Fig.2XRD patterns of the Fe3O4nanoparticles

其中K為Scherrer常數(shù)，取0.89，λ為X射線波長(zhǎng)，β為半高寬，θ為布拉格角，取晶面計(jì)算得D＝12 nm。

圖3為改性后的Fe3O4粒子的透射電鏡圖照片，顯示粒子分散性較好，為規(guī)則球形，粒徑約為12 nm，與XRD結(jié)果基本一致，其值小于Fe3O4的超順磁性臨界尺寸15 nm，具有超順磁性。由Fe3O4粒子高倍透射電鏡圖(圖3(B))所示，在Fe3O4納米粒子表面有一層明顯的多巴胺保護(hù)層，多巴胺上的氨基可用于后續(xù)適體的接枝。

圖3氨基改性后Fe3O4納米粒子透射電鏡照片F(xiàn)ig.3TEM images of the amino-modified Fe3O4nanoparticles

圖4 (A)中(a)、(b)分別為多巴胺改性前油酸修飾的Fe3O4納米粒子(OA-Fe3O4)和多巴胺改性后Fe3O4納米粒子(DPA-Fe3O4)在室溫下的磁滯回線。由圖中可知，樣品均具有良好的超順磁性；油酸修飾的Fe3O4納米粒子經(jīng)多巴胺改性后，飽和磁化強(qiáng)度(Ms)略有下降，這是由于改性后多巴胺取代油酸連接到Fe3O4磁性粒子上，因此在測(cè)試樣品質(zhì)量相同的情況下，磁性部分的減少導(dǎo)致Ms的降低。圖4(B)為改性前的Fe3O4納米粒子在磁鐵的作用下被吸附的圖像，在磁鐵的作用下，10 s內(nèi)粒子就被吸附靠近磁鐵，表明Fe3O4納米粒子的磁性良好。

圖4(A)Fe3O4納米粒子氨基改性前后磁滯回線;(B)氨基改性前Fe3O4納米粒子的磁響應(yīng)Fig.4(A)Hysteresis loop of Fe3O4nanoparticles before and after amino modification;(B)Magnetic responsiveness of Fe3O4nanoparticles

圖5 (A)為多巴胺改性前后的Fe3O4粒子紅外光譜分析圖，改性前后均保留了569 cm-1處Fe-O鍵的吸收峰；同時(shí)3 443 cm-1處的吸收峰變強(qiáng)，是改性后表面修飾的氨基所發(fā)生的伸縮振動(dòng)和表面-OH的特征吸收峰疊加而導(dǎo)致。改性前OA-Fe3O4納米粒子，2 918和2 848 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)油酸中的CH2鏈，1 665和1 520 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)油酸中羧基的延伸鏈，表明油酸可通過(guò)化學(xué)鍵連接到納米粒子表面；氨基改性后DPA-Fe3O4納米粒子的羧基和亞甲基的特征吸收峰都消失，且1 619 cm-1處N-H延伸鏈、1 490 cm-1處苯環(huán)C-C振動(dòng)鍵和1 260 cm-1處苯酚的C-O鍵的吸收峰出現(xiàn)，表明氨基改性成功。

圖5(B)為氨基改性前后的Fe3O4納米粒子紫外可見(jiàn)光譜圖，鹽酸多巴胺(DPA)標(biāo)準(zhǔn)液在220和280 nm處有吸收峰，鹽酸多巴胺改性的Fe3O4納米粒子(DPA-Fe3O4)在220 nm處出現(xiàn)吸收峰，而未改性的Fe3O4納米粒子無(wú)吸收峰出現(xiàn)，說(shuō)明多巴胺成功連接在Fe3O4上。

圖5 氨基改性前后Fe3O4納米粒子表征Fig.5Characterization of Fe3O4nanoparticles before and after amino-modification

2.2 改性后Fe3O4納米粒子接枝ATP適體

ATP適體上含有G堿基，與苯甲酰甲醛溶液反應(yīng)后產(chǎn)生瞬時(shí)發(fā)光，可由微弱發(fā)光儀檢測(cè)到。適體量增大，化學(xué)發(fā)光值也隨之增大。通過(guò)固定加入ATP適體量(10 pmol)，改變加入的Fe3O4納米粒子的量，來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中Fe3O4納米粒子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，隨著Fe3O4粒子量的增大，ATP適體連接到納米級(jí)Fe3O4粒子上，化學(xué)發(fā)光值先升高后下降，由于過(guò)量的Fe3O4納米粒子會(huì)導(dǎo)致發(fā)光的減弱，故加入1 μmol的Fe3O4納米粒子較為適宜。

圖6 加入不同量Fe3O4納米粒子的發(fā)光值Fig.6Changes of chemiluminescence intensity with different amounts of Fe3O4nanoparticle

2.3 ATP的定量檢測(cè)

ATP適體包裹ATP分子形成穩(wěn)定卷曲的三維結(jié)構(gòu)附著在Fe3O4納米粒子上，ATP與熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過(guò)檢測(cè)不同濃度(2、4、6、8、10、12 μmol·L-1)的ATP的發(fā)光值，繪制了ATP量與化學(xué)發(fā)光值關(guān)系。如圖7所示，R2=0.9963，在該范圍內(nèi)線性良好，可用于ATP的定量檢測(cè)，信噪比為3∶1，檢測(cè)限為0.68 μmol·L-1。

圖8為化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP的干擾性實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果。溶液為CTP、GTP、UTP時(shí)，化學(xué)發(fā)光值低，表明實(shí)驗(yàn)特異性好；溶液為ATP和CTP、GTP、UTP的混合物時(shí)，對(duì)化學(xué)發(fā)光值影響不大，表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠。

我們還進(jìn)行了酸奶中乳酸菌ATP的檢測(cè)。先提取出酸奶中乳酸菌的ATP，再利用Fe3O4納米粒子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，特異性捕獲ATP，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其發(fā)光值。由表1可知隨著酸奶量的增大，所含乳酸菌的量增多，則提取的ATP含量高，化學(xué)發(fā)光值增大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。根據(jù)圖7的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)ATP工作曲線計(jì)算,每毫升酸奶的乳酸菌中所含ATP的量為3.98×10-8mol，說(shuō)明制備的Fe3O4納米粒子可作為載體應(yīng)用于分析檢測(cè)領(lǐng)域。

圖7 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)ATP工作曲線圖Fig.7Curve of chemiluminescence detection for ATP

圖8 不同溶液中ATP發(fā)光值的測(cè)定Fig.8Comparison of ATP chemiluminescence intensity in different solutions

表1 不同量酸奶中乳酸菌ATP化學(xué)發(fā)光值的測(cè)定Table 1ATP chemiluminescence determination of lactic acid bacteria in different volumes of yogurt

3 結(jié)論

(1)采用共沉淀法制備了油酸修飾的納米Fe3O4粒子，并用鹽酸多巴胺對(duì)粒子進(jìn)行氨基化改性。

(2)成功地將ATP適體連接到氨基改性的Fe3O4納米粒子上，磁性分離出Fe3O4納米粒子，用化學(xué)發(fā)光法優(yōu)化了Fe3O4納米粒子的量。

(3)氨基改性的Fe3O4納米粒子，先結(jié)合ATP適體，再用于ATP的定量檢測(cè)，線性好，檢測(cè)范圍廣。

(4)氨基改性的Fe3O4納米粒子分散性好、穩(wěn)定性好，可作為一種良好的載體應(yīng)用于生物分離及分析檢測(cè)等領(lǐng)域。

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Nanoparticles Grafted by ATP Aptamer:Preparation and Application in Chemiluminescence Enzyme Analysis

YAN Xi-Luan1CHEN Xin1GAO Wen-Ju1WEI Ting-Ting1LIN Yue-Min1AI Fan-Rong＊,2,3
(1School of Resources,Environmental&Chemical Engineering，Nanchang University，Nanchang,330031,China)
(2School of Mechanic&Electronic Engineering，Nanchang University，Nanchang,330031,China)
(3Institute of Translational Medicine,Nanchang University,Nanchang,Nanchang,330031,China)

Oleic acid-modified Fe3O4nanoparticles was prepared and dopamine hydrochloride was chosen to amino-modify these nanoparticles.The Fe3O4nanoparticles have good water-dispersible,and were characterized by X-ray diffraction(XRD),transmission electron microscopy(TEM),Fourier transformed infrared(FTIR) spectroscopy,vibrating sample magnetometer and ultravioletvisible spectroscopy(UV-Vis)spectra.Then,aminomodified adenosine triphosphate(ATP)aptamer was grafted onto Fe3O4nanoparticles,and the amount of ATP was detected with luciferase chemiluminescence method.Meanwhile,the amount of ATP of lactic acid bacteria in commercially yogurt was tested,which had high sensitivity and good reproducibility.The results showed that these functionalized-Fe3O4nanoparticles could act as good dispersion,easy separation carrier,which indicated uniform particle size,good stability,strong magnetism and excellent binding ability with ATP aptamer.The development of Fe3O4nanoparticles largely expanded its application in the field of analysis.

Fe3O4;nanoparticles;aptamer;ATP;chemiluminescence detection

O614.81+1

A

1001-4861(2017)02-0340-07

10.11862/CJIC.2017.034

2016-08-31。收修改稿日期：2016-11-21。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81102289,51102131,31660491)和江西省自然科學(xué)基金(No.20132BAB205106,20142BAB216033)資助項(xiàng)目。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：afr3755875@126.com