環(huán)狀RNA CircHIPK3通過(guò)miR-379調(diào)控IGF1表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299與NCI-H2170的細(xì)胞增殖

田芳 王云 肖哲 朱學(xué)軍

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發(fā)病人數(shù)約占肺癌的85%[1,2]。雖然對(duì)NSCLC的相關(guān)治療已經(jīng)取得了一定程度的進(jìn)展，但是肺癌的5年生存率依然低于15%[3,4]。因此，研究其分子機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)肺癌治療至關(guān)重要。

環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）是一類(lèi)廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的非編碼RNA，主要參與生物體內(nèi)基因調(diào)控[5-7]。CircRNA大部分來(lái)源于基因的外顯子區(qū)域，也有少部分由內(nèi)含子剪接形成[8,9]。與長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）及microRNA（miRNA）不同之處在于，它們不具備5’端和3’端結(jié)構(gòu)，而是由共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成[10]。CircRNA廣泛地參與到人類(lèi)的生理和病理調(diào)控的過(guò)程中。環(huán)狀RNA可以通過(guò)：①作為miRNA“海綿體”（miRNA sponge）；②與蛋白結(jié)合互作；③和翻譯成多肽等多種的方式發(fā)揮功能，在腫瘤研究中，環(huán)狀RNA作為miRNA“海綿體”調(diào)控下游靶基因的機(jī)制已經(jīng)被廣泛報(bào)道[11-13]。目前發(fā)現(xiàn)多個(gè)環(huán)狀RNA自身包含至少一個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，因此，其可以作為RNA的“海綿體”吸附miRNA，從而通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNAs（competing endogenous RNA, ceRNAs）的機(jī)制調(diào)控被miRNA抑制的下游靶基因的表達(dá)[11]。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNAs理論在2010年由Pandolfi等提出，研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA、假基因RNA和環(huán)狀RNA與編碼蛋白的mRNA包含共同的可以被miRNA結(jié)合的位點(diǎn)，通過(guò)誘餌或“海綿”吸附的機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合miRNA，導(dǎo)致這些不同類(lèi)型的RNA之間形成相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)胞的各個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮重要的功能[14]。在現(xiàn)有研究[15]報(bào)道中，環(huán)狀RNA ciRS-7和circFOXO3等都可以通過(guò)ceRNA的機(jī)制調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。環(huán)狀RNA HIPK3（circular RNA HIPK3, circHIPK3）在肝、腦、肺中高表達(dá)，其主要起源于基因HIPK3的第二個(gè)外顯子。HIPK3起源的環(huán)狀RNA有3種剪接體，分別為circHIPK3、circHIPK3.1和circHIPK3.2。但是只有circHIPK3豐度較高，并且在細(xì)胞中具有顯著的功能。研究發(fā)現(xiàn)circHIPK3可以結(jié)合多個(gè)miRNA，包括miR-124和miR-379等。在肝癌中，circHIPK3可以作為“海綿體”吸附miR-124，通過(guò)ceRNA機(jī)制上調(diào)miR-124下游靶基因IL6R和DXL2，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[16]。但NSCLC中環(huán)狀RNA HIPK3的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制尚未明晰。

此外，miR-379是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的一類(lèi)miRNA。在NSCLC中，miR-379可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑的殺傷能力[17]。研究表明在血管平滑肌細(xì)胞中，miR-379可以通過(guò)調(diào)控類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor, IGF1）從而達(dá)到抑制了細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。IGF1在前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[18]。本研究中，主要報(bào)道了circHIPK3在NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299和NCI-H2170中的功能，并初步提出circHIPK3可以通過(guò)miR-379/IGF1促進(jìn)NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299和NCI-H2170細(xì)胞增殖的機(jī)制，希望能為NSCLC治療提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 NCI-H1299和NCI-H2170細(xì)胞株（購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)）；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自北京全式金有限責(zé)任公司）；RPMI-1640、高糖DMEM、胰酶（購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司）；熒光定量Real-Time PCR試劑盒、點(diǎn)突變?cè)噭┖校ㄙ?gòu)自南京諾唯贊公司）；RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipo2000、DMSO、DEPC水（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司）；引物（購(gòu)于上海生物工程公司），IGF1多克隆兔抗（購(gòu)于美國(guó)Abcam公司）；山羊抗兔β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自南京碧云天公司）；PVDF膜（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（購(gòu)自美國(guó)PS公司)；核質(zhì)分離試劑盒（購(gòu)于美國(guó)Ambion公司）；miR-379 mimics、miR-379 mimics control、miR-379 inhibitor和miR-379 inhibitor control（購(gòu)自廣州銳博公司）；CCK-8試劑（購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所）；ModulusTM單管型多功能檢測(cè)儀（購(gòu)自美國(guó)Promega公司）；IGF1 ELISA檢測(cè)試劑盒（購(gòu)于美國(guó)Life公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NCI-H1299和NCI-H2170細(xì)胞系的培養(yǎng)液成份為10%胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)液含青霉素/鏈霉素100 U/mL。細(xì)胞培養(yǎng)于37oC、含5%CO2培養(yǎng)箱中，0.25%的胰酶常規(guī)消化，選擇生長(zhǎng)較好的對(duì)數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 環(huán)狀RNA過(guò)表達(dá)載體pLCDH-circRNA購(gòu)廣州自吉賽生物公司，序列circHIPK3（hsa_circ_0000284）來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)cirBase。用Fast pfu擴(kuò)增circHIPK3序列，克隆構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLCDH-circHIPK3。circHIPK3序列片段插入熒光素酶報(bào)告基因下游，構(gòu)建包含circHIPK3的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-circHIPK3。采用點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔僣ircHIPK3與miR-379結(jié)合位點(diǎn)。pLCDH-circHIPK3慢病毒轉(zhuǎn)染法感染細(xì)胞，48 h后以1 μg/mL濃度的嘌呤霉素篩選細(xì)胞株，鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。干擾siRNA購(gòu)自銳博生物公司。除過(guò)表達(dá)外，其余質(zhì)粒和siRNA通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)入NCI-H1299或NCI-H2170細(xì)胞中，通過(guò)GFP熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，所有質(zhì)粒都通過(guò)測(cè)序鑒定。

1.2.3 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)及RNase R消化線性RNA實(shí)驗(yàn) 將NCI-H1299和NCI-H2170細(xì)胞分別以2×105個(gè)/孔鋪入6孔板各3個(gè)孔，當(dāng)細(xì)胞處于80%融合度時(shí)用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，2,000 g離心2 min，根據(jù)核質(zhì)分離試劑盒步驟，分別回收胞質(zhì)和胞核RNA，nano 2000測(cè)定含量，儲(chǔ)存待用。將RNA分為RNase消化組和非消化組兩組，準(zhǔn)備10×Reaction Buffer配制10 μL總反應(yīng)體系，用于消化線性RNA，每1 μg RNA用1 U（1個(gè)單位）的RNase消化，37oC 10 min。隨后用苯酚/氯仿、乙醇沉淀法提取消化產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)circHIPK3在核質(zhì)中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RNA表達(dá)水平 抽提樣品RNA，經(jīng)濃度和純度測(cè)定后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA樣品，以β-actin為內(nèi)參。將SYBR Green預(yù)混液、模板、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反應(yīng)溶液，置于Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95oC 2 min預(yù)變性，然后按95oC 1 min，60oC 1 min，72oC 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72oC 7 min延伸。結(jié)果通過(guò)2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) NCI-H1299和NCI-H2170細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)CCK-8試劑盒完成。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和處理（過(guò)表達(dá)和敲低）組，采用96孔板中，每個(gè)孔鋪大約1×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)5 d。加入CCK-8后，37oC孵育2 h，檢測(cè)OD450的值。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和NCI-H2170 circHIPK3沉默組，對(duì)照組和NCI-H1299 circHIPK3過(guò)表達(dá)組，每組按每孔接種約5×102個(gè)細(xì)胞于6孔板中，37oC培養(yǎng)兩周后，用結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3個(gè)孔。

1.2.7 雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 實(shí)驗(yàn)分為6組：pGL-3空質(zhì)粒組、pGL-3-circHIPK3組、circHIPK3突變組、circHIPK3 siRNA組、miR-379 inhibitor組及miR-379 inhibitor control組。每組中都轉(zhuǎn)染海腎螢光素酶內(nèi)參質(zhì)粒和miR-379 mimics。轉(zhuǎn)染24 h后吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)試劑盒要求加入適量裂解液充分裂解細(xì)胞。10,000 g離心5 min后，取裂解液上清100 μL用于測(cè)定。以海腎螢光素酶為內(nèi)參，用螢火蟲(chóng)螢光素酶測(cè)定得到的RLU值除以海腎螢光素酶測(cè)定得到的RLU值。根據(jù)得到的比值來(lái)比較不同樣品目的報(bào)告基因的激活程度。

1.2.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的蛋白上樣緩沖液，100oC沸水浴加熱3 min-5 min，以充分變性蛋白。經(jīng)過(guò)跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗及顯影液孵育后，于Bio-Rad公司化學(xué)發(fā)光成像儀顯影成像。

表 1 PCR引物序列Tab 1 The PCR primers sequence

1.2.9 IGF1 ELISA檢測(cè) 將NCI-H1299細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染miR-379 mimics control和過(guò)表達(dá)miR-379 mimics、miR-379 inhibitor control及miR-379 inhibitor兩組，以1 mL培養(yǎng)基重懸2×105個(gè)細(xì)胞為一孔，加入24孔板，每組做3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，采用無(wú)菌管收集上清于3,000 g離心20 min。根據(jù)試劑盒說(shuō)明，用純化的IGF1抗體4oC包被96孔酶標(biāo)板，并放置過(guò)夜。第2天封閉過(guò)后，往包被單抗的微孔中依次加入100 μL不同倍比稀釋度的細(xì)胞上清，并加入用細(xì)胞培養(yǎng)基梯度稀釋的對(duì)照樣品，37oC孵育2 h。PBST洗滌5次，加入100 μL稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37oC孵育1 h。PBST再次洗滌，顯色劑顯色20 min后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人IGF1濃度，結(jié)果以差異倍數(shù)顯示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)通過(guò)Graphad Prism軟件作圖和統(tǒng)計(jì)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。實(shí)驗(yàn)均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定circHIPK3在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá) 首先分別以細(xì)胞NCI-H1299的基因組DNA（gDNA）和cDNA作為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增circHIPK3包含成環(huán)位點(diǎn)（back spliced junction）的片段， 結(jié)果表明模板為cDNA組的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)約100 bp的目的條帶，并且基因組DNA不能非特性擴(kuò)增circHIPK3（圖1A）。Sanger測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了成環(huán)位點(diǎn)序列（圖1B）。利用RNase R消化細(xì)胞NCI-H1299的RNA，qRTPCR結(jié)果顯示RNase R處理前后，circHIPK3表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但是線性mHIPK3表達(dá)水平卻顯著降低（圖1C，P＜0.01）。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)證明circHIPK3主要存在于NCI-H1299和NCI-H2170的細(xì)胞質(zhì)（圖1D）。

2.2 過(guò)量表達(dá)circHIPK3促進(jìn)NCI-H1299細(xì)胞的增殖 我們首先在NSCLC細(xì)胞系H1299、H827、H1975、H2170、H520、H1650中均檢測(cè)到circHIPK3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NCI-H2170表達(dá)量最高，NCI-H1299表達(dá)量最低（圖2A）。在NCI-H1299細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circHIPK3，circHIPK3表達(dá)水平顯著上調(diào)，mHIPK3無(wú)明顯變化（圖2B-圖2C）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組circHIPK3穩(wěn)定表達(dá)株的OD450明顯高于對(duì)照組（圖2D， P＜0.01），且其在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中的克隆數(shù)目多于對(duì)照組（圖2E-圖2F，P＜0.01）。

2.3 沉默circHIPK3抑制NCI-H2170細(xì)胞系的增殖 我們訂購(gòu)了三條siRNA干擾circHIPK3的表達(dá)，其中si-circHIPK3-2有明顯的干擾抑制效果（圖3A）。干擾circHIPK3實(shí)驗(yàn)組的OD450顯著低于對(duì)照組（圖3B，P＜0.01）?？寺⌒纬蓴?shù)目也明顯低于對(duì)照組（圖3C-圖3D，P＜0.01）。

2.4 circHIPK3作為“海綿體”吸附miR-379 我們將circHIPK3的序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3 promoter-luc單位的下游，與miR-379 mimics及內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入293T和NCI-H1299細(xì)胞中后，相對(duì)于載體對(duì)照組（EV），實(shí)驗(yàn)組circHIPK3的熒光強(qiáng)度顯著降低。突變circHIPK3與miR-379的結(jié)合位點(diǎn)，將突變質(zhì)粒Luc-circHIPK3 mutant（mut-circ）與miR-379 mimics共轉(zhuǎn)入293T和NCI-H1299中，熒光信號(hào)沒(méi)有發(fā)生明顯改變。此外，將si-circHIPK3（si-circ）、miR-inhibitor（miR-in）、Inhibitor control（IC）與miR-379 mimics共轉(zhuǎn)入293T和NCI-H1299中，熒光強(qiáng)度也沒(méi)有顯著降低（圖4A-圖4B）。以上數(shù)據(jù)表明circHIPK3可以與miR-379結(jié)合，作為“海綿體”吸附miR-379。此外，我們同樣驗(yàn)證了miR-379與IGF1 3’UTR的結(jié)合，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-379可以與IGF1 3’UTR直接結(jié)合（圖4C-圖4D）。

2.5 circHIPK3通過(guò)circHIPK3/miR-379促進(jìn)細(xì)胞增殖 在NCI-H1299中轉(zhuǎn)入miR-379 mimics后，IGF1表達(dá)水平降低，轉(zhuǎn)入miR-379 inhibitor發(fā)現(xiàn)IGF1表達(dá)水平上調(diào)（圖5A-圖5B，圖5E，P＜0.05）。在NCI-H2170中干擾抑制circHIPK3，發(fā)現(xiàn)IGF1表達(dá)量明顯下調(diào)（圖5C，圖5E，P＜0.05）。在過(guò)表達(dá)circHIPK3的NCI-H1299的細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-379 mimics后，能部分下調(diào)IGF1的表達(dá)水平，同時(shí)能部分回復(fù)對(duì)細(xì)胞增殖的影響（圖5D，圖5F，P＜0.05）。因此，在NCI-H1299和NCI-H2170中，circHIPK3通過(guò)miR-379調(diào)控IGF1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。

3 討論

越來(lái)越多的研究顯示環(huán)狀RNA在疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用。但是，目前只有CDR1as和circFOXO3研究的較為透徹。circHIPK3是另一個(gè)嶄露頭角的環(huán)狀RNA，受到人們?cè)絹?lái)越多的重視。在正常細(xì)胞內(nèi)，其表達(dá)豐度與其線性RNA相當(dāng)，甚至更高。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，circHIPK3可以促進(jìn)肝癌的增殖[16]。在本文中，我們主要報(bào)道了針對(duì)circHIPK3在NCI-H1299和NCI-H2170中的功能與初步的機(jī)制研究結(jié)果。過(guò)量表達(dá)的circHIPK3同樣可以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖，此外，我們的研究更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細(xì)胞系中，circHIPK3的促進(jìn)增殖能力可以通過(guò)circHIPK3/miR-379發(fā)揮，目前研究發(fā)現(xiàn) circHIPK3可以與多種miRNA結(jié)合，起到miRNA“海綿體”的作用。在肝癌中，circHIPK3可以吸附miR-124，從而調(diào)節(jié)miR-124的靶基因IL6R和DLX2，促進(jìn)細(xì)胞增殖[16]。但是在NSCLC中，circHIPK3同樣可以通過(guò)吸附miR-379。文獻(xiàn)[18]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，miRNA-379能夠抑制IGF1的表達(dá)水平，我們猜測(cè)在NSCLC細(xì)胞系circHIPK3可能通過(guò)吸附miRNA-379促進(jìn)IGF1的表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖。Western blot和ELISA證實(shí)，過(guò)量表達(dá)miRNA-379，IGF1的蛋白水平下調(diào)。干擾抑制miRNA-379可以上調(diào)IGF1的蛋白表達(dá)水平。過(guò)量表達(dá)circHIPK3可以促進(jìn)IGF1的表達(dá)，但是干擾抑制circHIPK3卻可以抑制IGF1的蛋白水平。雙熒光光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，miR-379分別可以和circHIPK3及IGF1 mRNA直接結(jié)合。在穩(wěn)轉(zhuǎn)circHIPK3的NCI-H1299細(xì)胞系轉(zhuǎn)入miR-379可以挽救circHIPK3過(guò)量表達(dá)的表型。至此，我們提出circHIPK3在NSCLC細(xì)胞系H1299和H2170中促進(jìn)增殖的機(jī)制是通過(guò)circHIPK3/miRNA-379實(shí)現(xiàn)的。

圖1 CircHIPK3在NSCLC細(xì)胞系中的鑒定。A：分別以基因組DNA和cDNA為模板，PCR擴(kuò)增circHIPK3成環(huán)位點(diǎn)附近100 bp序列，白色矩形框表示目的條帶區(qū)域；B：circHIPK3成環(huán)示意圖及測(cè)序結(jié)果，紅色箭頭表示divergent primers，豎短黑線示意成環(huán)位點(diǎn)；C：RNase R消化后的mHIPK3和circHIPK3的豐度檢測(cè)；D：circHIPK3在細(xì)胞核中與細(xì)胞質(zhì)中的含量比較。**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 1 Identification of circHIPK3 in NSCLC cell lines. A: CircHIPK3 sequence about 100 bp around back splied junction was analyzed by PCR, and the white rectangle indicated DNA bands; B: Schematic diagram of circular point. Red arrows represented divergent primers, and vertical short black line indicated circular point; C: The levels of circHIPK3 and mHIPK3 were analyzed after RNase R digestion; D: Expression of circHIPK3 in both nuclear and cytoplasmic fractions were measured by qRT-PCR. **: compared with the control, P＜0.01.

在細(xì)胞系中，我們發(fā)現(xiàn)circHIPK3在NCI-H2170高表達(dá)，在NCI-H1299低表達(dá)。所以，我們選擇在NCI-H1299中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circHIPK3，在NCI-H2170中干擾抑制circHIPK3。值得注意的是，環(huán)狀RNA過(guò)表達(dá)的關(guān)鍵步驟在于成環(huán)，我們選用商業(yè)化的質(zhì)粒去過(guò)表達(dá)circHIPK3，利用Real-time PCR的方法檢驗(yàn)circHIPK3的表達(dá)量，希望能確定過(guò)表達(dá)的真實(shí)性。因?yàn)槟壳跋嚓P(guān)體外成環(huán)技術(shù)并不成熟，成環(huán)過(guò)程中會(huì)形成小部分錯(cuò)誤成環(huán)的RNA，雖然本研究并沒(méi)有檢驗(yàn)錯(cuò)誤成環(huán)的影響，但是通過(guò)干擾circHIPK3發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的表型與過(guò)表達(dá)相反，證實(shí)細(xì)胞增殖的變化確實(shí)由circHIPK3的表達(dá)量變化引起。為了進(jìn)一步研究circHIPK3調(diào)控NSCLC增殖的分子機(jī)制，本研究利用雙熒光酶活性實(shí)驗(yàn)證明了circHIPK3和miR-379是直接結(jié)合，通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，miR-379可以直接結(jié)合靶基因IGF1的mRNA，抑制IGF1表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞增殖[18]。我們過(guò)表達(dá)miR-379后，IGF1的表達(dá)水平明顯下調(diào)，說(shuō)明miR-379在NSCLC細(xì)胞中同樣可以結(jié)合IGF1的mRNA，抑制IGF1表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)circHIPK3發(fā)現(xiàn)IGF1表達(dá)量上調(diào)，反之亦然，這就更加確定circHIPK3是可以調(diào)控IGF1的上游RNA。雖然文獻(xiàn)報(bào)道，IGF1是一種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)控因子，但是關(guān)于IGF1與細(xì)胞增殖的關(guān)系，本文主要參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)上并未做深入探討，這也是本文的不足之處[19-21]。此外，本研究并未進(jìn)一步證實(shí)circHIPK3的調(diào)控關(guān)系是否能在更多種的細(xì)胞系中重復(fù)，這一點(diǎn)也是今后研究的重要內(nèi)容。

圖2 過(guò)量表達(dá)circHIPK3促進(jìn)NCI-H1299細(xì)胞增殖。A：circHIPK3在6株NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)量；B：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照空質(zhì)粒pLDCH和circHIPK后，NCI-H1299細(xì)胞表達(dá)載體攜帶的綠色熒光蛋白標(biāo)記；C：過(guò)表達(dá)circHIPK后，細(xì)胞中circHIPK3及mHIPK3表達(dá)水平檢測(cè)；D：CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；E：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；F：克隆形成數(shù)目統(tǒng)計(jì)；**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 2 Overexpression of circHIPK3 promoted NCI-H1299 cells proliferation. A: The expression level of circHIPK3 in 6 kinds of NSCLC cell lines; B:The green fluorescent protein (GFP) indicated the successful and stable establishment of pLDCH/p-circHIPK3 NCI-H1299 cell line; C: Detection of circHIPK3 and mHIPK3 expression levels in NCI-H1299; D: The cell growth rate was measured by CCK-8 assay; E: Cell proliferation was assessed by colony formation assay; F: Statistics analysis of colony formation assay; **: compared with the control, P＜0.01.

圖3 沉默circHIPK3抑制NCI-H2170細(xì)胞系的增殖。A：cirHIPK3 siRNA敲降效果檢測(cè)；B：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circHIPK3沉默后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；C：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circHIPK3沉默后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；D：克隆形成數(shù)目統(tǒng)計(jì)；**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 3 Silencing circHIPK3 inhibited NCI-H2170 cell proliferation. A: The knockdown efficiency of cirHIPK3 siRNAs; B: Cell proliferation was evaluated by CCK-8 assay; C: Cell proliferation was detected by colony formation assay; D: Statistics of colony formation assay; **：compared with the control, P＜0.01.

圖4 CircHIPK3作為“海綿體”吸附miR-379。A：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-379分別和載體對(duì)照組EV、circHIPK3過(guò)表達(dá)組（circ）、circHIPK3敲低組（si-circ）、突變質(zhì)粒Luc-circHIPK3組（mut-circ）、miR-inhibitor組（miR-in）及Inhibitor control組（IC）共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中的熒光素酶的相對(duì)熒光強(qiáng)度；B：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-379分別和EV、circ、si-circ、mut-circ、miR-in及IC共轉(zhuǎn)入NCI-H1299細(xì)胞中的熒光素酶的相對(duì)熒光強(qiáng)度；C：轉(zhuǎn)入miR-379 mimics和IGF1 3’UTR后，293T細(xì)胞中熒光素酶的相對(duì)熒光強(qiáng)度檢測(cè)；D：轉(zhuǎn)入miR-379 mimics和IGF1 3’UTR后，NCI-H1299細(xì)胞中的熒光素酶相對(duì)熒光強(qiáng)度。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05。**：與對(duì)照組相比，P＜0.01。Fig 4 CircHIPK3 could sequester miR-379. A: Luciferase relative activity of miR-379 in EV, circ, si-circ, mut-circ, miR-in and IC treated 293T cells; B:Luciferase relative activity of miR-379 in EV, circ, si-circ, mut-circ, miR-in and IC treated NCI-H1299 cells; C: Luciferase relative activity of miR-379 with IGF1 3’UTR in 293T cells; D: Luciferase relative activity of miR-379 with IGF1 3’UTR in NCI-H1299 cells. *: compared with the control, P＜0.05.**: compared with the control, P＜0.01.

圖5 CircHIPK3通過(guò)circHIPK3/ miR-379通路促進(jìn)細(xì)胞增殖。A：轉(zhuǎn)入miR-379 mimics后，Western blot檢測(cè)NCI-H1299細(xì)胞內(nèi)IGF1的表達(dá)水平；B：轉(zhuǎn)入miR-379 inhibitor后，Western blot檢測(cè)NCI-H1299細(xì)胞內(nèi)IGF1的表達(dá)水平；C：敲低circHIPK3后，Western blot檢測(cè)NCI-H2170細(xì)胞內(nèi)IGF1的表達(dá)水平；D：分別轉(zhuǎn)染：對(duì)照pLCDH、p-circHIPK3、p-circHIPK3+miR-379 mimics共同處理組質(zhì)粒后，Western blot檢測(cè)NCI-H1299細(xì)胞內(nèi)IGF1的表達(dá)水平；E：細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清IGF1的量；F：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空載質(zhì)粒pLCDH、p-circHIPK3、p-circHIPK3+miR-379 mimics共同處理組三個(gè)組別對(duì)細(xì)胞增殖的影響。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05。Fig 5 CircHIPK3 promoted NSCLC cell proliferation through circHIPK3/miR-379 pathway. A: The effects of miR-379 mimics on the expression levels of IGF1 in NCI-H1299; B: The effects of miR-379 inhibitor on the expression levels of IGF1 in NCI-H1299; C: The effects of si-circHIPK3 on the expression levels of IGF1 in NCI-H2170; D: The effects of the pLCDH, p-circHIPK3, the group of circHIPK3 combined with miR-379 mimics on the expression levels of IGF1 in H1299; E: Detection of the expression levels of IGF1 by ELISA after culturing for 72 h; F: The cell growth effects of circHIPK3 and the group of circHIPK3 combined with miR-379 mimics on NCI-H1299. *: compared with the control, P＜0.05.

綜上所述，本研究表明circHIPK3能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖，circHIPK3通過(guò)miR-379調(diào)控IGF1表達(dá)是促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖的機(jī)制。在后續(xù)的研究中，我們將更加深入地探討機(jī)制，為NSCLC的治療提供新的思路。