異牛肝菌素通過(guò)阻斷SM22α泛素化降解抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

呂 品，范素芳，宋 楠，王璐琪，孫 勇，趙俊霞,*，張 巖,,*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017；2. 河北省食品檢驗(yàn)研究院 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050071；3.北京食品科學(xué)研究院，中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

異牛肝菌素通過(guò)阻斷SM22α泛素化降解抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

呂 品1，范素芳2，宋 楠1，王璐琪1，孫 勇3，趙俊霞1,*，張 巖1,2,*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017；2. 河北省食品檢驗(yàn)研究院 河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050071；3.北京食品科學(xué)研究院，中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

從黃乳粘蓋牛肝菌（Suillus flavus）中分離得到的異牛肝菌素（iso-suillin）具有顯著的抗腫瘤活性，但其在心血管系統(tǒng)的功效尚不明確。本研究用不同濃度的異牛肝菌素預(yù)處理原代血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）24 h或48 h后，再采用血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-BB處理細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)VSMC增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布；Western blot分析檢測(cè)蛋白表達(dá)情況；免疫沉淀檢測(cè)平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha，SM22α）磷酸化和泛素化水平。結(jié)果顯示，異牛肝菌素顯著抑制PDGF-BB引發(fā)的VSMC增殖；上調(diào)分化標(biāo)志蛋白SM22α表達(dá)，下調(diào)增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)；抑制SM22α磷酸化及其泛素化降解，且該過(guò)程可能與其阻斷蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）δ的活性有關(guān)。通過(guò)以上結(jié)果推測(cè)，異牛肝菌素通過(guò)抑制PKCδ的活性，降低SM22α磷酸化水平，阻止SM22α泛素化降解，進(jìn)而抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮血管保護(hù)的功能。

異牛肝菌素；血管平滑肌細(xì)胞；表型轉(zhuǎn)化；平滑肌22α（SM22α）

引文格式：

呂品, 范素芳, 宋楠, 等. 異牛肝菌素通過(guò)阻斷SM22α泛素化降解抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(15): 208-214. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715034. http://www.spkx.net.cn

Lü Pin, FAN Sufang, SONG Nan, et al. Iso-suillin inhibits VSMC phenotypic modulation via repressing ubiquitinationmediated SM22α degradation[J]. Food Science, 2017, 38(15): 208-214. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201715034. http://www.spkx.net.cn

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等血管重構(gòu)性疾病共同的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。在血管損傷等因素刺激下，VSMC可從收縮（分化）表型轉(zhuǎn)化為合成（去分化）表型，喪失收縮功能并獲得增殖、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力，該過(guò)程是血管重構(gòu)的根本原因和血管損傷病變復(fù)雜性的重要因素[1-3]。因此，抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化對(duì)預(yù)防血管損傷性疾病具有重要的意義。

真菌可以產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，其中聚異戊二烯酚類化合物表現(xiàn)出了很高的生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗感染和消炎止痛等[4-6]。本課題組于2014年從一種食藥兼用的大型真菌-黃乳粘蓋牛肝菌的石油醚相中純化出一種代謝產(chǎn)物，相對(duì)分子質(zhì)量為440.29，化學(xué)名稱為3,6-二羥基-2-（2Z,6E,10E）-3,7,11,15-六甲基十六碳-2,6,10,14-四烯苯乙酯，與之前研究發(fā)現(xiàn)的牛肝菌素是同分異構(gòu)體，命名為異牛肝菌素（iso-suillin）（圖1）。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，異牛肝菌素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠有效抑制SMMC-7721、BGC、K562、A549等腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，與順鉑和5-氟尿嘧啶比較，異牛肝菌素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑瘤作用，且對(duì)正常人的淋巴細(xì)胞幾乎沒有毒性[7-9]。然而，異牛肝菌素在心血管系統(tǒng)中的作用尚不明確。

圖1 異牛肝菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of iso-suillin

肌動(dòng)蛋白（actin）相關(guān)蛋白平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha，SM22α），又稱轉(zhuǎn)凝（transgelin）蛋白，屬于calponin家族，主要表達(dá)于成體平滑肌組織。雖然SM22α缺失不影響生理?xiàng)l件下血管組織的正常發(fā)育和功能，但病理狀態(tài)下，它的功能是不可替代的。SM22α在損傷誘導(dǎo)的血管重塑性疾病中，如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[10-11]、血管新生內(nèi)膜[12-13]、血管鈣化[14-15]、主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤[16-17]等，表達(dá)急劇下調(diào)，且下調(diào)水平與血管損傷程度呈正相關(guān)，因此，SM22α表達(dá)降低已成為VSMC去分化的一種特異性標(biāo)志物[12,18-20]。本課題組前期的研究結(jié)果顯示，血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅱ和血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-BB等刺激因素可抑制VSMC分化標(biāo)志物SM22α、SM α-actin、calponin、caldesmon等表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化[12,21-22]。各種刺激因素引起的SM22α表達(dá)降低，除了與SM22α的表達(dá)受抑有關(guān)外，其泛素化降解加快也是一個(gè)重要因素[21,23]，但影響其泛素化水平的藥物研究較少。本研究觀察異牛肝菌素對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)以及與SM22α泛素化降解的關(guān)聯(lián)，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行初步探討，為該藥物在血管重塑性疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性SD大鼠（清潔級(jí)）由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

異牛肝菌素由本課題組提取，經(jīng)高效液相色譜法檢驗(yàn)純度為99.0%。

低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Gibco公司；PDGF-BB 美國(guó)R&D公司；MG132 美國(guó)Sigma公司；兔抗SM22α抗體 英國(guó)Abcam公司；ProteinA/G-瓊脂糖、小鼠抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、小鼠抗β-actin抗體、兔抗Ub抗體、小鼠抗p-Ser單克隆抗體美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）δ抗體、兔抗磷酸化（p）-PKCδ抗體 美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳槽、電泳儀、半干快速轉(zhuǎn)膜儀 美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 美國(guó)Life Technologies公司；CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 VSMC培養(yǎng)

選取80～100 g雄性SD大鼠（清潔級(jí)），用貼塊法分離培養(yǎng)胸腹主動(dòng)脈中膜VSMC，置于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至100%匯合后，用0.25 g/100 mL胰蛋白酶溶液消化傳代，取3～5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 VSMC增殖活性測(cè)定

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，將細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%匯合時(shí)，換用含體積分?jǐn)?shù)1% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（對(duì)照：0 μmol/L異牛肝菌素、0 μmol/L PDGF-BB），分別用0.0（單獨(dú)PDGF-BB處理為陰性對(duì)照）、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 μmol/L異牛肝菌素預(yù)處理細(xì)胞24 h 或48 h，然后給予PDGF-BB（20 ng/mL）刺激24 h。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

將細(xì)胞接種于細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%匯合時(shí)，換用含體積分?jǐn)?shù)1% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（對(duì)照組），用0（陰性對(duì)照組）、6、12、24 μmol/L異牛肝菌素預(yù)處理細(xì)胞24 h，然后給予PDGF-BB（20 ng/mL）刺激24 h。消化并收集細(xì)胞，生理鹽水洗滌3 次，70%乙醇固定。加入50 mg/L的碘化丙啶（propidium iodide，PI）DNA熒光染色，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.3.4 VSMC總蛋白提取與Western blot分析

按文獻(xiàn)[21]常規(guī)方法收集和裂解細(xì)胞，取上清液體，用改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量。取等量的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），半干法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 g/100 mL脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后以遠(yuǎn)紅外標(biāo)記的熒光二抗室溫封閉1 h，洗膜后Odyssey遠(yuǎn)紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3.5 免疫沉淀分析

取200 μg細(xì)胞總蛋白與相應(yīng)的抗體混合，4 ℃搖動(dòng)混合過(guò)夜后加入20 μL ProteinA/G-agarose，4 ℃搖動(dòng)混合2～4 h后，4 ℃、12 000 r/min離心1 min，洗滌后收集Protein A/G-抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行Western blot分析。按文獻(xiàn)[21]常規(guī)方法，用兔抗SM22α抗體檢測(cè)SM22α的磷酸化水平；用兔抗Ub抗體檢測(cè)SM22α的泛素化水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 異牛肝菌素對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化的影響

如圖2所示，與對(duì)照相比，PDGF-BB顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。不同濃度異牛肝菌素預(yù)處理VSMC 24 h后，與陰性對(duì)照相比，1.5 μmol/L和3.0 μmol/L異牛肝菌素對(duì)VSMC增殖無(wú)顯著影響（P＞0.05），而6～24 μmol/L異牛肝菌素可極顯著抑制細(xì)胞增殖活性（P＜0.01）；不同濃度異牛肝菌素預(yù)處理VSMC 48 h后，1.5～24 μmol/L均可顯著抑制細(xì)胞增殖活性（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。上述結(jié)果表明，異牛肝菌素以時(shí)間和濃度依賴性方式抑制VSMC增殖。

圖2 異牛肝菌素對(duì)VSMC增殖的影響（n=3）Fig. 2 Effect of iso-suillin on the proliferation of VSMCs (n = 3)

圖3 流式細(xì)胞檢測(cè)異牛肝菌素對(duì)VSMC細(xì)胞周期分布的影響（n=3）Fig. 3 Effect of iso-suillin on cell cycle distribution of VSMC (n = 3)

由圖3可知，PDGF-BB處理24 h后，與對(duì)照相比，VSMC S期細(xì)胞數(shù)目增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)目減少；與陰性對(duì)照相比，隨異牛肝菌素濃度升高，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，而S期細(xì)胞數(shù)目顯著減少。該結(jié)果表明，異牛肝菌素可能通過(guò)誘導(dǎo)VSMC G0/G1期阻滯從而抑制細(xì)胞增殖活性。

圖4 Western blot檢測(cè)牛肝菌素對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化的影響（n=3）Fig. 4 Effect of iso-suillin on VSMC phenotypic modulation (n=3)

從細(xì)胞計(jì)數(shù)中選取了一個(gè)濃度和一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（6 μmol/L異牛肝菌素預(yù)處理VSMC 24 h，PDGF-BB處理VSMC 24 h），Western blot分析結(jié)果如圖4所示，PDGF-BB處理VSMC 24 h顯著促進(jìn)增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)，抑制分化相關(guān)蛋白SM22α表達(dá)，標(biāo)志VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化；而6 μmol/L異牛肝菌素預(yù)處理VSMC 24 h后，PDGF-BB引發(fā)的PCNA表達(dá)上調(diào)和SM22α表達(dá)下調(diào)明顯受抑。提示，異牛肝菌素可抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化。

2.2 異牛肝菌素上調(diào)SM22α表達(dá)的作用機(jī)制

圖5 異牛肝菌素對(duì)SM22α泛素化的影響（n=3）Fig. 5 Effect of iso-suillin on ubiquitination of SM22α (n = 3)

為進(jìn)一步探究異牛肝菌素上調(diào)SM22α表達(dá)的可能機(jī)制，VSMC裂解液用抗SM22α抗體進(jìn)行免疫沉淀（IP）后，用抗泛素化（ubiquitination，Ub）的抗體檢測(cè)泛素化SM22α水平（IB）。由圖5可知，VSMC經(jīng)蛋白酶體抑制劑MG132（10 μmol/L）預(yù)處理2 h后，PDGF-BB處理VSMC 4 h，SM22α泛素化水平升高，而6 μmol/L異牛肝菌素預(yù)處理VSMC 24 h后，隨SM22α表達(dá)升高，PDGF-BB引發(fā)的SM22α泛素化水平顯著降低。上述結(jié)果表明，SM22α泛素化降解受到抑制可能是異牛肝菌素上調(diào)SM22α表達(dá)的機(jī)制之一。

2.3 異牛肝菌素抑制SM22α泛素化降解的作用機(jī)制

為明確異牛肝菌素抑制SM22α泛素化降解的上游機(jī)制，細(xì)胞裂解液用抗p-Ser抗體進(jìn)行免疫沉淀（IP），用抗SM22α的抗體檢測(cè)磷酸化SM22α水平（IB）。由圖6可知，PDGF-BB作用于VSMC 30 min，SM22α磷酸化水平明顯升高，而6 μmol/L異牛肝菌素預(yù)處理VSMC 24 h后，PDGF-BB引發(fā)的SM22α磷酸化水平顯著降低。

圖6 異牛肝菌素對(duì)SM22α磷酸化的影響（n=3）Fig. 6 Effect of iso-suillin on phosphorylation of SM22α (n = 3)

2.4 異牛肝菌素抑制SM22α磷酸化的作用機(jī)制

圖7 異牛肝菌素對(duì)PKCδ磷酸化的影響（n=3）Fig. 7 Effect of iso-suillin on phosphorylation of PKCδ (n = 3)

本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKCδ信號(hào)通路是SM22α磷酸化所必需的[21]。由圖7可知，PDGF-BB作用于VSMC 10 min，PKCδ磷酸化水平升高，而6 μmol/L異牛肝菌素預(yù)處理VSMC 24 h后，PDGF-BB誘導(dǎo)的PKCδ磷酸化水平明顯降低。表明，異牛肝菌素可能通過(guò)阻斷PKCδ活化抑制SM22α磷酸化。

3 討 論

VSMC表型轉(zhuǎn)化是動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管損傷性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究和開發(fā)抗細(xì)胞增殖和遷移的藥物，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要意義。異戊二烯基酚類化合物（prenylphenols）是一類相對(duì)分子質(zhì)量較低的有機(jī)化合物，主要從植物和真菌的代謝產(chǎn)物中分離提取或人工半合成。其基本結(jié)構(gòu)含有聚合異戊二烯分子和苯酚，具有多種潛在的生物活性和藥用價(jià)值，包括抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、減少炎癥損害、降血壓、降血脂、降低膽固醇含量、改善人體微循環(huán)、防止心腦血管疾病的發(fā)生、抗衰老、提高機(jī)體耐受力、增強(qiáng)免疫功能等效果。異牛肝菌素作為一種從黃乳粘蓋牛肝菌中提取的聚異戊二烯酚類化合物，能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-9]，但其在脈管系統(tǒng)中的功能尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，異牛肝菌素能夠明顯改變VSMC細(xì)胞周期分布，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖活性，降低增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)分化標(biāo)志蛋白SM22α表達(dá)，表明異牛肝菌素可抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化，提示異牛肝菌素對(duì)于血管重塑性疾病的治療有著巨大的潛力。

SM22α主要表達(dá)于收縮型VSMC，我們和國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室大量的研究表明，當(dāng)遭受損傷刺激或體外培養(yǎng)時(shí)，VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化而快速去分化，該過(guò)程的一個(gè)重要標(biāo)志就是SM22α表達(dá)急劇下調(diào)[12,24]。Feil等[10]證實(shí)，高脂飼喂的Sm22α基因敲除（Sm22α-/-型）小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積和VSMC增殖活性都大大高于野生型小鼠，該過(guò)程可能與SM22α影響了其他類型的細(xì)胞在血管病變部位的募集和增殖有關(guān)，表明在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程中SM22α可通過(guò)調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖活性影響動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生與發(fā)展。本課題組前期的研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)SM22α顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)級(jí)聯(lián)；而敲低SM22α后，該信號(hào)通路被激活。進(jìn)一步研究顯示，高水平的SM22α通過(guò)與Ras相互作用抑制Ras的募集和Raf-1的活化，進(jìn)而阻斷MAPK信號(hào)通路。體內(nèi)研究顯示，過(guò)表達(dá)SM22α通過(guò)阻斷MAPK信號(hào)通路削弱球囊損傷誘導(dǎo)的頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成[13]。與野生型相比，Sm22α-/-型小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫后軟骨形成標(biāo)志基因，包括Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、骨橋蛋白等，表達(dá)明顯升高，與VSMC分化標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)相一致，表明SM22α缺失可通過(guò)促進(jìn)VSMC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘發(fā)血管鈣化[14-15]。Sm22α基因敲除后，頸總動(dòng)脈炎性因子表達(dá)升高，并且通過(guò)促進(jìn)ROS生成激活NF-κB（nuclear factor，NF）-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致血管組織對(duì)炎性反應(yīng)異常敏感而喪失抗炎能力，這可能與SM22α缺失導(dǎo)致的細(xì)胞骨架重塑有關(guān)[25]；我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究揭示了SM22α下調(diào)激活NF-κB的可能機(jī)制，過(guò)表達(dá)SM22α通過(guò)與NF-κB的阻遏物（inhibitor of NF-κB，IκB）形成復(fù)合物，抑制IκB的磷酸化和降解，使IκB和NF-κB緊密結(jié)合阻止NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而阻斷NF-κB活化導(dǎo)致的血管炎癥反應(yīng)，抑制結(jié)扎誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成[11,26]。上述發(fā)現(xiàn)闡明了VSMC以SM22α依賴的方式保持其收縮表型的機(jī)制，揭示了SM22α調(diào)制VSMC表型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)功能。研究表明，生長(zhǎng)因子等刺激因素不僅誘導(dǎo)SM22α等分化標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)，而且還與它們的泛素化降解加快直接相關(guān)[27]。我們近年來(lái)的研究顯示，AngⅡ和PDGF-BB可誘導(dǎo)SM22α泛素化水平升高和降解加速[21,23]，但影響其泛素化水平的藥物研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，異牛肝菌素可顯著降低PDGF-BB誘導(dǎo)的SM22α泛素化水平升高，表明異牛肝菌素上調(diào)SM22α表達(dá)可能與其降低SM22α泛素化降解有關(guān)。

蛋白的翻譯后修飾作為高度靈活的開關(guān)，調(diào)控著蛋白的活性、表達(dá)及其亞細(xì)胞定位。磷酸化和泛素化修飾是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)重要的翻譯后修飾方式，磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要機(jī)制，而泛素化在蛋白質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用，二者存在交互應(yīng)答[28]。通常情況下，蛋白質(zhì)泛素化修飾有賴于其磷酸化。E3泛素連接酶比較容易識(shí)別磷酸化的蛋白質(zhì)，進(jìn)而對(duì)磷酸化的底物進(jìn)行泛素化標(biāo)記，啟動(dòng)蛋白質(zhì)經(jīng)由蛋白酶體途徑進(jìn)行降解；另外，蛋白質(zhì)的磷酸化還能直接調(diào)控各種泛素連接酶的活性，從而影響酶和底物的親和力，改變泛素連接酶的催化能力[29-30]。因此，蛋白質(zhì)磷酸化修飾是其泛素化降解的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本課題組前期的結(jié)果已證實(shí)，AngⅡ經(jīng)由PKCδ-SM22α磷酸化-SM22α泛素化軸加速SM22α降解[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異牛肝菌素預(yù)處理VSMC后，隨PKCδ的活性降低，PDGF-BB誘導(dǎo)的SM22α磷酸化水平亦明顯下降。推測(cè)，異牛肝菌素可能通過(guò)阻斷PKCδ信號(hào)通路，抑制SM22α磷酸化，以及由此導(dǎo)致的SM22α泛素化降解，進(jìn)而穩(wěn)定平滑肌細(xì)胞的收縮表型。

綜上所述，異牛肝菌素通過(guò)削弱PKCδ活性，降低SM22α磷酸化水平，進(jìn)而阻斷SM22α的泛素化降解，發(fā)揮抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化的功能，證實(shí)SM22α泛素化降解介導(dǎo)的VSMC表型轉(zhuǎn)化可能是異牛肝菌素發(fā)揮血管保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)。

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Iso-Suillin Inhibits VSMC Phenotypic Modulation via Repressing Ubiquitination-Mediated SM22α Degradation

Lü Pin1, FAN Sufang2, SONG Nan1, WANG Luqi1, SUN Yong3, ZHAO Junxia1,*, ZHANG Yan1,2,* (1. College of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China；
2. Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050071, China; 3. China Meat Research Center, Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China)

Iso-suillin, a phenolic compound isolated from Suillus flavus, has significant anti-tumor activity. However, the role of iso-suillin in cardiovascular system remains unclear. Herein, primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) were pretreated with iso-suillin for 24 or 48 h, and then stimulated by platelet-derived growth factor (PDGF)-BB. The cell proliferation was evaluated by cell counting. VSMC cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. In addition, Western blot was used to examine protein expression, and immuneprecipitation analysis was used to identify the phosphorylation and ubiquitination of smooth muscle 22 alpha (SM22α). The results showed that iso-suillin inhibited PDGF-BB-induced VSMC proliferation. Iso-suillin increased the expression of SM22α (a marker of cell differentiation), and reduced the level of PCNA. Furthermore, iso-suillin decreased the levels of phosphorylated and ubiquitinated SM22α upon PDGF-BB treatment, which may be associated with iso-suillin-decreased protein kinase C (PKC) δ activity. Collectively, these data demonstrated that iso-suillin prevented VSMC phenotype transformation through decreasing PKCδ-mediated SM22α degradation via the ubiquitin-proteasome pathway in VSMCs.

iso-suillin; vascular smooth muscle cells; phenotypic modulation; smooth muscle 22α (SM22α)

10.7506/spkx1002-6630-201715034

R285

A

1002-6630（2017）15-0208-07

2017-04-08

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFF0202300）；科技部質(zhì)檢行業(yè)公益專項(xiàng)（201510208-08）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81300225）；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2015206467）；河北省高等學(xué)校優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目（YQ2013018）

呂品（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檠苤厮苄约膊〉陌l(fā)病機(jī)制。E-mail：lvpinzy@163.com

*通信作者：趙俊霞（1966—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚晕镔|(zhì)與功能。E-mail：zhaojunxia@hebmu.edu.cn張巖（1979—），男，正高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：snowwinglv@126.com