大豆7S蛋白-糖體系晚期糖基化終產(chǎn)物形成因素

劉貴梅，章鼎敏，李 普，盧永翎，鄭鐵松，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

大豆7S蛋白-糖體系晚期糖基化終產(chǎn)物形成因素

劉貴梅，章鼎敏，李 普，盧永翎，鄭鐵松，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

目的：在大豆蛋白糖基化改性過(guò)程中會(huì)引發(fā)非酶糖基化反應(yīng)，形成有害的晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），為提高食品安全性，模擬糖基化加工條件，構(gòu)建大豆7S蛋白-糖體系模型，考察影響該體系A(chǔ)GEs形成的因素并進(jìn)行有效調(diào)控。方法：采用熒光光譜法（λex/λem＝340 nm/465 nm）檢測(cè)糖種類(lèi)、還原糖質(zhì)量濃度、pH值、反應(yīng)溫度、抑制劑種類(lèi)及其濃度對(duì)AGEs形成的影響，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳表征有害產(chǎn)物的形成及抑制效果。結(jié)果：糖種類(lèi)為果糖、蛋白質(zhì)與葡萄糖質(zhì)量濃度配比1∶4、pH 9.2、反應(yīng)溫度121 ℃條件下產(chǎn)生熒光性AGEs的作用效果最強(qiáng)，4 種黃酮類(lèi)化合物槲皮素、染料木素、蘆丁和木犀草素對(duì)熒光性AGEs的形成均可達(dá)到較好的抑制效果，且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：糖的種類(lèi)與抑制劑種類(lèi)對(duì)AGEs的形成有一定影響；降低還原糖質(zhì)量濃度、降低pH值和降低反應(yīng)溫度，添加0.1 mmol/L大豆源染料木素可有效抑制大豆加工過(guò)程中有害產(chǎn)物AGEs的形成。

大豆7S蛋白-糖體系；糖基化；熒光性晚期糖基化終產(chǎn)物；熒光光譜；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

蛋白糖基化反應(yīng)是碳水化合物以共價(jià)鍵形式與蛋白質(zhì)分子中的α-或ε-氨基相連接的非酶促反應(yīng)[1]，通過(guò)糖基化作用導(dǎo)致食品的褐變，對(duì)于食品的顏色、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等產(chǎn)生了重要的影響。糖與蛋白質(zhì)分子中的氨基反應(yīng)生成席夫堿（Schiff base），席夫堿經(jīng)過(guò)分子重排后生成較為穩(wěn)定的Amadori中間產(chǎn)物，再通過(guò)脫水、氧化、縮合等一系列反應(yīng)，最終形成不可逆的晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），同時(shí)席夫堿以及Amadori中間產(chǎn)物等可以通過(guò)自身的氧化作用生成酮醛類(lèi)化合物，然后生成AGEs[2]。研究表明，攝入過(guò)多的外源性AGEs[3-4]或體內(nèi)較多內(nèi)源性AGEs的積累[5]，會(huì)引發(fā)阿茨海默癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、腎臟疾病等病癥，加快人體衰老的進(jìn)程[6-10]。

大豆是一種豐富的植物蛋白資源，被廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、面制品、方便食品、冷凍食品等幾十類(lèi)產(chǎn)品中。運(yùn)用超速離心沉降法對(duì)大豆蛋白進(jìn)行分離，可分為2S、7S、11S和15S[11]，其中7S蛋白含量約為37%[12]。大豆7S蛋白是由α、α’和β這3 種亞基通過(guò)疏水相互作用結(jié)合而成的三聚體糖蛋白，分子質(zhì)量約為180～210 kD[13]。與其他蛋白相比，大豆7S蛋白分子中的二硫鍵和—SH較少，因此凝膠硬度低，但其賴(lài)氨酸含量稍高，疏水性氨基酸較多，表面活性強(qiáng)，故乳化性、起泡性較好[14-15]。

黃酮類(lèi)化合物是廣泛存在于自然界，基本母核為2-苯基色原酮類(lèi)化合物，其種類(lèi)數(shù)量繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。研究證明黃酮類(lèi)化合物如槲皮素、蘆丁、染料木素、葛根素、兒茶素、花青素等對(duì)非酶糖基化反應(yīng)具有抑制作用[16-20]。目前，在大豆蛋白改性中常用的糖有果糖[21]、木糖[22]、葡萄糖[23]、乳糖[24]、蔗糖[21]等。但是考慮到價(jià)格因素通常選擇葡萄糖作為美拉德反應(yīng)的底物。通過(guò)對(duì)大豆蛋白的糖基化改性可以明顯改變大豆7S球蛋白的溶解性[25]、穩(wěn)定性[26]、乳化性[27]、凝膠性[28]等蛋白功能性，并廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。而在針對(duì)大豆蛋白高溫加工及糖基化改性過(guò)程中產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)AGEs，對(duì)安全性構(gòu)成極大隱患。目前，針對(duì)大豆蛋白高溫加工及糖基化改性過(guò)程中，有害產(chǎn)物AGEs的形成過(guò)程、含量的監(jiān)控及其抑制方法，國(guó)內(nèi)外尚鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建大豆7S蛋白-糖基化模型，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)AGEs的含量，考察糖種類(lèi)、蛋白質(zhì)與還原糖的質(zhì)量濃度配比、pH值、反應(yīng)溫度、抑制劑種類(lèi)以及添加量對(duì)AGEs形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)文獻(xiàn)[29]的方法對(duì)低溫脫脂大豆粕分離提純制備得大豆7S蛋白。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖（均為分析純） 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；槲皮素、染料木素、蘆丁、木犀草素（均為色譜級(jí)） 南京廣潤(rùn)生物試劑有限公司；丙烯酰胺、N-N甲叉雙丙烯酰胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、過(guò)硫酸銨、三羥基氨基甲烷、溴酚藍(lán)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)、無(wú)水乙醇 南京化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇、冰醋酸 南京賽吉科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；XW-80A微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、HH-S數(shù)顯恒溫油浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；KQ-300B超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C數(shù)字式pH計(jì) 上海三信儀表廠(chǎng)；F200多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；GL-22M超高速離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYCZ-24D型夾芯式垂直電泳槽 北京市六一儀器廠(chǎng)；JY600C型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖種類(lèi)對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

用濃度為0.2 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶解大豆7S蛋白、葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖，在10 mL樣品管中加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液，2 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的各種糖溶液和2 mL PBS，使得7S蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原糖的終質(zhì)量濃度為4 mg/mL?；靹?，置于100 ℃沸水浴中反應(yīng)0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷凍貯藏備用。解凍后15 000 r/min冷凍離心30 min，取300 μL上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定λex/λem＝340 nm/465 nm處相對(duì)熒光值，以相對(duì)熒光值表征AGEs含量（下同）。以PBS代替糖溶液作為對(duì)照，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 蛋白質(zhì)與糖的質(zhì)量濃度配比對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

用濃度為0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL樣品管中加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液，分別加入2 mL質(zhì)量濃度為6、12、18、24 mg/mL葡萄糖，再加入2 mL PBS溶液，使得7S蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原糖的終質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8 mg/mL?；靹颍糜?00 ℃沸水浴中反應(yīng)0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷凍貯藏備用。解凍后15 000 r/min冷凍離心30 min，取300 μL上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定λex/λem＝340 nm/465 nm處相對(duì)熒光值。以PBS代替糖溶液作為對(duì)照，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。1.3.3 pH值對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

分別用濃度為0.2 mol/L、pH值為6.5、7.2、9.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL樣品管中加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的葡萄糖溶液，再加入2 mL PBS，使得7S蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原糖的終質(zhì)量濃度為4 mg/mL。混勻，置于100 ℃沸水浴中反應(yīng)0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷凍貯藏備用。解凍后15 000 r/min冷凍離心30 min，取300 μL上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定λex/λem＝340 nm/465 nm處相對(duì)熒光值。以PBS代替糖溶液作為對(duì)照，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 反應(yīng)溫度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

用濃度為0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL樣品管中加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的葡萄糖溶液，再加入2 mL PBS，使得7S蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原糖的終質(zhì)量濃度為4 mg/mL。混勻，分別置于60 ℃恒溫水浴、100 ℃沸水浴、121 ℃恒溫油浴中反應(yīng)0、5、15、30、45、60、90、120 min后，迅速置于-80 ℃冷凍貯藏備用。解凍后15 000 r/min冷凍離心30 min，取300 μL上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定λex/λem＝340 nm/465 nm處相對(duì)熒光值。以PBS代替糖溶液作為對(duì)照，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 抑制劑種類(lèi)與濃度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

用濃度為0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在10 mL樣品管中加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的葡萄糖溶液，再分別加入2 mL濃度為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mmol/mL的槲皮素（或木犀草素、蘆丁、染料木素）溶液作為樣品組，使得大豆7S蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原糖的終質(zhì)量濃度為4 mg/mL。以PBS代替抑制劑作為空白組。將反應(yīng)物于100 ℃沸水浴中反應(yīng)120 min后，迅速置于-80 ℃冷凍貯藏備用。解凍后15 000 r/min冷凍離心30 min，取300 μL上清液用酶標(biāo)儀測(cè)定λex/λem＝340 nm/465 nm處相對(duì)熒光值，按照下式計(jì)算AGEs抑制率。

式中：Rfu樣品組為抑制劑樣品組相對(duì)熒光值；Rfu空白組為空白組相對(duì)熒光值。

1.3.6 SDS-PAGE分析7S-大豆蛋白糖基化

1.3.6.1 樣品制備

用濃度為0.2 mol/L、pH 7.2的PBS溶解大豆7S蛋白和葡萄糖。在4 個(gè)10 mL樣品管中加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的葡萄糖溶液，再加入2 mL PBS，使得7S蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原糖的終質(zhì)量濃度為4 mg/mL。混勻，置于100 ℃沸水浴中反應(yīng)0、15、30、60 min后，迅速置于-80 ℃冷凍貯藏備用。在3 個(gè)10 mL樣品管中加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的大豆7S蛋白溶液和2 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的葡萄糖溶液，再分別加入2 mL濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/mL的染料木素溶液，使得7S蛋白的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原糖的終質(zhì)量濃度為4 mg/mL。混勻，置于100 ℃沸水浴中反應(yīng)60 min后，迅速置于-80 ℃冷凍貯藏備用。將7 個(gè)樣品解凍后15 000 r/min冷凍離心10 min，取沉淀加入1 mL樣品緩沖液混勻，沸水浴加熱5 min，取出后冷卻至室溫備用。

1.3.6.2 SDS-PAGE分析

制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣量為10 μL，接通電源進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），濃縮膠中電流設(shè)置為10 mA，進(jìn)入分離膠后設(shè)置電流為20 mA。電泳結(jié)束后小心取下凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色2 h，取出凝膠清洗后浸入脫色液，置于搖床進(jìn)行振蕩脫色，每2 h更換一次脫色液，直至脫色液無(wú)明顯顏色為止。取出凝膠，置于凝膠成像儀中進(jìn)行拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖的種類(lèi)對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

圖1 糖的種類(lèi)對(duì)大豆7S蛋白-糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig. 1 Effect of sugar type on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

由圖1可知，4 種糖均與大豆7S蛋白反應(yīng)生成了AGEs，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AGEs的生成量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。同時(shí)這4 種糖與大豆7S蛋白反應(yīng)后，AGEs的生成量之間有顯著的差異，在同一時(shí)間點(diǎn)，果糖產(chǎn)生的AGEs含量最多，其余依次為葡萄糖、乳糖、蔗糖。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，果糖產(chǎn)生的AGEs含量約為蔗糖的2 倍。其中，果糖和葡萄糖是單糖，而乳糖和蔗糖為二糖，分子質(zhì)量較大，對(duì)其與蛋白質(zhì)氨基發(fā)生的羰氨反應(yīng)造成了一定的空間位阻[30]，糖分子質(zhì)量的增加可以推遲美拉德反應(yīng)進(jìn)入高級(jí)階段，并且對(duì)其有明顯的抑制作用[31]。另外，果糖、葡萄糖、乳糖為還原性糖，而蔗糖為非還原性糖，大豆蛋白糖基化產(chǎn)生AGEs的還原性糖活性高于非還原性糖。這與Bunn等[32]研究表明酮糖比醛糖具有更高的反應(yīng)活性相一致。Jing等[33]發(fā)現(xiàn)核糖與酪蛋白的反應(yīng)速率大于葡萄糖和果糖與酪蛋白的反應(yīng)速率，即五碳糖比六碳糖更易和蛋白產(chǎn)生AGEs，且單糖比雙糖也更易反應(yīng)。

2.2 糖質(zhì)量濃度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

圖2 糖質(zhì)量濃度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig. 2 Effect of sugar concentration on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

由圖2可知，隨著大豆7S蛋白-糖體系中糖比例的增加，糖基化產(chǎn)生的AGEs含量也在不斷上升，糖質(zhì)量濃度與AGEs生成量呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與還原糖質(zhì)量濃度配比為1∶2、1∶3、1∶4時(shí)，這3 個(gè)比例的AGEs生成量之間差別不是很大，但顯著高于1∶1的生成量。這是由于蛋白質(zhì)的含量一定時(shí)，隨著糖質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)物分子間碰撞的幾率也大大提高，從而有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，但當(dāng)糖質(zhì)量濃度增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)與糖分子間的空間位阻導(dǎo)致分子間碰撞的幾率減小，糖基化反應(yīng)減弱[34]。

2.3 pH值對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

由圖3可知，隨著反應(yīng)體系pH值（6.5、7.2、9.2）的增加，大豆7S蛋白與還原糖產(chǎn)生的AGEs含量增加。當(dāng)pH值為6.5與7.2時(shí)，AGEs的生成量差別不大，但當(dāng)pH值達(dá)到9.2時(shí)，AGEs生成的量明顯增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，pH 9.2條件下AGEs生成量約為pH 6.5和pH 7.2的2 倍，且反應(yīng)時(shí)間從30 min開(kāi)始呈劇烈上升趨勢(shì)，120 min時(shí)的生成量約為30 min時(shí)的2.2 倍，說(shuō)明堿性環(huán)境更有利于促進(jìn)糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，這是由于N-葡萄糖胺在偏酸性環(huán)境中易被水解[35]，因此糖基化改性條件應(yīng)盡量控制在中性偏酸環(huán)境。

圖3 pH值對(duì)大豆7S蛋白-糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig. 3 Effect of pH on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig. 4 Effect of temperature on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

由圖4可知，反應(yīng)溫度（60、100、121 ℃）對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs的形成具有顯著性影響，隨著反應(yīng)溫度的升高，大豆蛋白糖基化產(chǎn)生的AGEs含量明顯增加。在60 ℃時(shí)，AGEs的生成量較低，且在0～15 min增加后便趨于平穩(wěn)。當(dāng)溫度升高到100 ℃時(shí)，AGEs含量在從15 min開(kāi)始呈劇烈增加趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，100 ℃條件下產(chǎn)生的AGEs含量達(dá)到60 ℃的2.1 倍。當(dāng)溫度升高到121 ℃時(shí)，AGEs含量繼續(xù)顯著增加，120 min時(shí)，121 ℃條件下產(chǎn)生的AGEs含量達(dá)到60 ℃的2.9 倍。

2.5 抑制劑種類(lèi)與濃度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的影響

由圖5可知，黃酮類(lèi)化合物對(duì)大豆蛋白糖基化產(chǎn)生的AGEs均有一定的抑制效果，當(dāng)添加量達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)，4種黃酮類(lèi)化合物的抑制率均高于60%，且隨著抑制劑濃度（0.05～5.00 mmol/L）的增加，抑制率均明顯升高，說(shuō)明抑制劑的濃度與抑制率存在顯著的量效關(guān)系。在各濃度條件下，染料木素的抑制效果最好，其次為槲皮素、蘆丁、木犀草素。其中染料木素和槲皮素的抑制效果較為接近，抑制率均明顯高于蘆丁和木犀草素，當(dāng)添加濃度為0.10 mmol/L時(shí)，染料木素與槲皮素的抑制率均已高達(dá)60%以上，即可達(dá)到較好的抑制效果。當(dāng)濃度繼續(xù)增大到5.00 mmol/L時(shí)，染料木素與槲皮素的抑制率可達(dá)到80%以上，鑒于染料木素是大豆源提取而得，因此，在大豆加工和改性過(guò)程中，外添加染料木素濃度達(dá)到0.10 mmol/L以上，即可以有效抑制有害產(chǎn)物AGEs的形成。這與Kong Yanghui等[36]用染料木素來(lái)抑制β-乳球蛋白羰基化生成AGEs，其抑制效果在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。Jung等[37]通過(guò)熒光檢測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)染料木素可以阻斷AGEs-RAGE的交聯(lián)，并且隨著染料木素劑量的增加，其阻斷程度也呈線(xiàn)性增加。目前，國(guó)內(nèi)外研究抑制AGEs生成的機(jī)制主要有以下幾種：一是通過(guò)添加抑制劑來(lái)阻斷還原糖和蛋白質(zhì)的接觸。二是通過(guò)隔絕或者去除中間產(chǎn)物來(lái)減弱其糖基化進(jìn)程；三是采用AGEs斷裂劑斷裂已經(jīng)生成的AGEs交聯(lián)產(chǎn)物[38]。

圖5 抑制劑種類(lèi)和濃度對(duì)大豆7S蛋白-糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig. 5 Effects of inhibitor type and concentration on the formation of AGEs in soybean 7S globulin-sugar system

2.6 SDS-PAGE表征大豆7S糖基化過(guò)程及染料木素抑制效果

圖6 大豆7S蛋白糖基化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig. 6 SDS-PAGE of soybean 7S globulin glycosylation products

SDS-PAGE分析100 ℃、pH 7.2、蛋白質(zhì)與葡萄糖質(zhì)量濃度比例為1∶2條件下大豆7S蛋白糖基化產(chǎn)物隨反應(yīng)時(shí)間和抑制劑添加量的變化，結(jié)果如圖6所示。大豆7S蛋白與葡萄糖反應(yīng)一定時(shí)間后在分離膠與濃縮膠界面有新的條帶產(chǎn)生（泳道2～4），表明大豆7S蛋白糖基化產(chǎn)生了大分子質(zhì)量的聚集物，且由于分子質(zhì)量太大而難以進(jìn)入濃縮膠中。當(dāng)糖基化反應(yīng)時(shí)間從15 min增加到60 min時(shí)，濃縮膠與分離膠界面間新條帶的顏色進(jìn)一步加深，分子質(zhì)量42.7～97.4 kD區(qū)域間大豆7S蛋白條帶顏色變淺，說(shuō)明隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖基化反應(yīng)程度加深，從而促使更多糖基化產(chǎn)物的生成。

在大豆7S蛋白-葡萄糖模型中加入一定量的染料木素，濃縮膠與分離膠界面間新條帶的顏色明顯變淺幾乎消失（泳道5～7），表明糖基化引起交聯(lián)的高分子質(zhì)量蛋白含量顯著減少，染料木素對(duì)大豆7S蛋白糖基化產(chǎn)物有明顯的抑制效果。染料木素的添加濃度為0.1 mmol/L時(shí)高分子質(zhì)量蛋白條帶已經(jīng)消失，增加至1.0 mmol/L時(shí)變化不明顯，表明0.1mmol/L染料木素可有效抑制大豆7S交聯(lián)大分子的形成，而2.5節(jié)結(jié)果表明，染料木素濃度的增加對(duì)體系A(chǔ)GEs生成量的抑制依然存在明顯增大效果。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)大豆7S蛋白-糖體系中AGEs形成的考察，表明大豆7S蛋白在糖基化改性過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熒光性AGEs，并且糖的種類(lèi)和質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度、pH值、抑制劑的種類(lèi)和濃度會(huì)對(duì)AGEs的產(chǎn)生具有重要的影響。各種糖的反應(yīng)活性依次為果糖＞葡萄糖＞乳糖＞蔗糖。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間一定時(shí)，蛋白質(zhì)與糖的質(zhì)量濃度配比（1∶1、1∶2、1∶3和1∶4）越高，反應(yīng)溫度（60、100、121 ℃）越高，AGEs的生成量越多。反應(yīng)條件在pH 9.2時(shí)產(chǎn)生的AGEs明顯高于pH 6.5和pH 7.2。此外黃酮類(lèi)化合物對(duì)大豆蛋白糖基化有一定的抑制效果，其中在相同濃度條件下染料木素的抑制效果最好，槲皮素的抑制率與染料木素較為接近，且隨著抑制劑濃度的增加，抑制率在不斷提高。

因此，在大豆蛋白加工和糖基化改性過(guò)程中可以通過(guò)采用非還原性糖或分子質(zhì)量較大的糖，降低蛋白質(zhì)與糖的質(zhì)量濃度配比（1∶1左右）和反應(yīng)溫度（100 ℃以?xún)?nèi)），建立中性偏酸的環(huán)境（pH 6.5～7.2）以及添加染料木素或槲皮素等黃酮類(lèi)抑制劑，從而抑制糖基化反應(yīng)中AGEs的形成，提高大豆蛋白加工及為大豆食品生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。本研究中食源性黃酮抑制劑的添加可為改善食品安全，降低有害AGEs的產(chǎn)生提供新的思路。

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Elucidation of Factors Affecting the Formation of Fluorescent AGEs in Soybean 7S Globulin-Sugar System

LIU Guimei, ZHANG Dingmin, LI Pu, LU Yongling, ZHENG Tiesong, Lü Lishuang*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Purpose: Non-enzymatic glycation reaction can be induced during the glycosylation modif i cation of soybean 7S protein, which can give rise to the production of harmful advanced glycation end products (AGEs). In order to improve the safety of foods, soybean 7S protein-sugar system was established to fi nd out the factors affecting the formation of AGEs and effectively control the glycosylation reaction under simulated food processing conditions. Methods: The inf l uencing factors including sugar type, sugar concentration, pH, temperature, inhibitor type and inhibitor concentration were detected by fl uorescence spectrometry (λex/λem= 340 nm/465 nm). The formation and inhibition of harmful products were characterized by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Results: The use of fructose as a sugar, a ratio between sugar and protein concentrations of 1:4, a pH value of 9.2, and a reaction temperature of 121 ℃ were the best conditions for the formation of fl uorescent AGEs. The fl avonoids quercetin, genistein, rutin and luteolin could effectively and dose-dependently inhibit the formation of fl uorescent AGEs. Conclusion: The types of sugar and inhibitor have a certain effect on the formation of fl uorescent AGEs. We can inhibit the formation of fl uorescent AGEs by reducing the ratio between sugar and protein concentrations, pH and reaction temperature as well as increasing the concentration of the inhibitor.

soybean 7S globulin-sugar system; glycosylation; fl uorescent advanced glycation end products; fl uorescence spectrometry; sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

10.7506/spkx1002-6630-201715004

TS201.2

A

1002-6630（2017）15-0020-06

劉貴梅, 章鼎敏, 李普, 等. 大豆7S蛋白-糖體系晚期糖基化終產(chǎn)物形成因素[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(15): 20-25.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715004. http://www.spkx.net.cn

LIU Guimei, ZHANG Dingmin, LI Pu, et al. Elucidation of factors affecting the formation of fl uorescent AGEs in soybean 7S globulin-sugar system[J]. Food Science, 2017, 38(15): 20-25. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715004. http://www.spkx.net.cn

2016-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571783）

劉貴梅（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：sunshine6324@126.com

*通信作者：呂麗爽（1969—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)、功能性食品的分離及活性。E-mail：lishuanglv@126.com