UPLC-DAD/ESI-TOF-MS鑒定黑脈羊肚菌多酚化合物

石 芳，廖 霞，盧可可，鄭少杰，肖星凝，吳素蕊，明 建,3,*

UPLC-DAD/ESI-TOF-MS鑒定黑脈羊肚菌多酚化合物

石 芳1，廖 霞1，盧可可1，鄭少杰1，肖星凝1，吳素蕊2，明 建1,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

以黑脈羊肚菌為原料，分離提取羊肚菌多酚（游離酚和結(jié)合酚），對提取物中酚類物質(zhì)的含量及抗氧化活性進行研究，并采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器/電噴霧飛行時間質(zhì)譜對黑脈羊肚菌游離酚和結(jié)合酚的組分進行鑒定。結(jié)果表明，黑脈羊肚菌多酚主要為游離酚，且游離酚的DPPH自由基清除率、還原力及氧自由基吸收能力都顯著強于結(jié)合酚（P＜0.05），而兩者清除ABTS+·能力相當。從黑脈羊肚菌多酚中鑒定出15 種組分，分別是沒食子酸、焦性沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、綠原酸、葒草素、蘆丁、金絲桃苷、白藜蘆醇、木犀草素、槲皮素、肉桂酸、阿魏酸，游離酚提取物有15 種組分，結(jié)合酚提取物有14 種組分。

黑脈羊肚菌；多酚；超高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜；抗氧化活性

黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps Peck）是常見的羊肚菌種，在我國主要分布在新疆、甘肅、西藏、云南、四川、青海、內(nèi)蒙古、山西等地，其富含蛋白質(zhì)、維生素及多種必需氨基酸，并含有鉀、鈉、鈣、鎂、鋅、鐵等多種常量和微量元素，具有較高的營養(yǎng)及藥用價值。過去人們普遍認為羊肚菌的保健功能主要是由于活性多糖的作用，但近些年研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的多酚也具有抗氧化、抗腫瘤等活性，已有研究表明黑脈羊肚菌體內(nèi)多酚含量豐富，且具有較強的抗氧化能力，如2,2’-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-amino-di (3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6) ammonium salt，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除能力，使β-胡蘿卜素褪色等。

目前對羊肚菌多酚的研究仍集中在多酚提取、含量測定及簡單的化學(xué)抗氧化活性測定，由于多酚類物質(zhì)種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致其抗氧化活性不同，因此鑒定黑脈羊肚菌中的酚類物質(zhì)的組分對后續(xù)探討其抗氧化構(gòu)效關(guān)系尤為重要。當高效液相色譜法無法達到理想效果時，就需要首先分離出單體物質(zhì)，再進一步用質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進行分析，液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜是近年來發(fā)展并逐漸完善起來的一種軟電離質(zhì)譜，因其特異性高、靈敏度高，并能與多級質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)特點，可直接用于多酚類化合物的分析[1-3]。本實驗采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器/電噴霧飛行時間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-diode array detector/ electrospray ionization-time of fight-mass spectrometry，UPLC-DAD/ESI-TOF-MS）對黑脈羊肚菌中的多酚類化合物進行組分鑒定，以期為黑脈羊肚菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑脈羊肚菌由中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所提供。樣品采摘后12 h內(nèi)速凍，于-20 ℃凍藏，實驗前取出冷凍羊肚菌于50 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，中藥粉碎機粉碎，過80 目篩后密封備用。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜純） 天津四友精細化學(xué)品有限公司；沒食子酸、焦性沒食子酸、對羥基苯甲酸、水楊酸、綠原酸、阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、兒茶素、槲皮素、蘆丁、白藜蘆醇、葒草素、木犀草素、山柰酚、金絲桃苷、桑色素、香草醛（均為色譜純）美國Sigma公司；丙酮、乙酸乙酯（均為分析純）成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ3200DE數(shù)控超聲波振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DW-FL270型超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；LC-30AD超高效液相色譜儀 日本島津公司；Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 黑脈羊肚菌多酚提取

1.3.1.1 游離酚提取

參考Okarter等[4]的方法，并根據(jù)實驗室條件稍作修改。準確稱取1.00 g樣品于100 mL離心管中，加入80%預(yù)凍丙酮溶液，冰浴均質(zhì)后，于3 500×g離心10 min，取上清液。殘渣重復(fù)提取2 次，合并上清液，抽濾后于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用超純水定容至25 mL。過0.45 μm有機濾膜后于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 結(jié)合酚提取

參考Nuutila等[5]的方法，并根據(jù)實驗室條件稍作修改。收集1.3.1.1節(jié)游離酚提取后的殘渣，加入2 mol/L NaOH溶液，避光攪拌消化1.5 h，再用濃鹽酸調(diào)至pH 2左右。加入正己烷20 mL，攪拌10 min后離心，除去脂肪層，重復(fù)去脂2 次。加入20 mL乙酸乙酯并充分攪拌提取10 min，3 500×g離心后取上清液，重復(fù)提取5 次，合并上清液，抽濾后于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用超純水定容至10 mL。過0.45 μm有機濾膜后保存于-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多酚含量測定

參考Chu等[6]的方法，以沒食子酸為標準品，得到標準曲線方程為y=0.003 4x+0.067 7（R2=0.991 7），其中y為沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL），x為吸光度，根據(jù)該方程計算樣品中多酚的含量，結(jié)果以每克羊肚菌樣品中含沒食子酸當量干質(zhì)量（mg GAE/g）表示。

1.3.3 多酚成分的鑒定

1.3.3.1 標準品溶液的制備

準確稱取標準品沒食子酸、焦性沒食子酸、對羥基苯甲酸、水楊酸、綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、咖啡酸、肉桂酸、兒茶素、槲皮素、蘆丁、白藜蘆醇、葒草素、木犀草素、山柰酚、金絲桃苷、桑色素、香草醛各1 mg，分別以色譜甲醇定容至10 mL容量瓶，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，于-40 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.3.2 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS分析條件

色譜條件：Phenomenex KinetexTMC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A為0.1%甲酸，B為100%乙腈；梯度洗脫：0～1 min，10% B，1～8 min，10%～85% B，8～13 min，85% B，13～13.1 min，85～10% B，13.1～15 min，10% B；流速0.35 mL/min；進樣量3 μL；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源負離子模式；TOF-MS掃描方式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 000；霧化電壓4 500 V；輔助加熱溫度600 ℃；去簇電壓-80 V；碰撞能量-30 eV；擴展碰撞能量15 eV。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除率測定

參考Cheung等[7]的方法，取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取液和5 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液加入10 mL試管中，以抗壞血酸為對照，混合均勻后在室溫條件下避光反應(yīng)50 min，于波長520 nm處測定吸光度。以水做試劑空白，測定空白樣吸光度Aj。按公式（1）計算樣品的DPPH自由基清除率：

式中：Ai為不同質(zhì)量濃度樣品提取液的吸光度；Aj為水空白試劑的吸光度。

1.3.4.2 還原力的測定

參考Ardestani等[8]的方法，取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取液、2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L pH 6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀溶液加入10 mL離心管中，混合均勻后50 ℃水浴20 min。取出冷卻后加入2.5 mL三氯乙酸溶液，3 500×g離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL氯化鐵溶液，混合均勻后于波長700 nm處測定吸光度。以水溶液做空白，抗壞血酸作為對照。

1.3.4.3 ABTS+·清除率的測定

參考Soong等[9]的方法，將5 mL的7 mmol/L ABTS溶液和88 μL的140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫避光條件下靜置過夜（12～16 h），形成ABTS儲備液。將生成的ABTS溶液用10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋，使其在室溫條件下測定波長734 nm處吸光度為0.70±0.02，得到ABTS工作液。將多酚提取液做相應(yīng)稀釋后，取3 mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取液和1 mL ABTS工作液于10 mL試管中，以抗壞血酸為對照，混合均勻后在30 ℃水浴反應(yīng)6 min，于波長734 nm處測定吸光度Ai。以水溶液做空白，測定空白樣吸光度Aj。按公式（2）計算樣品的ABTS+·清除率：

1.3.4.4 氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）的測定

參照Wolfe等[10]的方法，并根據(jù)本實驗室條件稍作修改。分別精確吸取20 μL磷酸緩沖液（空白液）、Trolox標準液（6.25 μmol/L）和不同質(zhì)量濃度的樣品液，一式3份點樣到96 孔酶標板。在37 ℃溫育10 min，設(shè)置酶標儀參數(shù)。加入200 μL 0.96 μmol/L的熒光工作液，在37 ℃溫育至少20 min并間歇搖動，等酶標板溫度達到37 ℃后，迅速加入20 μL新鮮配制的119 mmol/L ABAP工作液，于激發(fā)波長485 nm，入射波長520 nm條件下立即讀數(shù)，每4.5 min進行一次讀數(shù)，共檢測2.5 h。根據(jù)測定值計算ORAC值，按公式（3）計算熒光衰減曲線下的面積（AUC），按公式（4）計算ORAC值，最終的ORAC值以μmol TE/100 g計（干質(zhì)量）。

式中：f1為第1次熒光讀數(shù)值；fi為第i次熒光讀數(shù)值；CT為間隔測定時間/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Peakview 1.2和Analyst 1.6（ABSciex）統(tǒng)計分析，實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑脈羊肚菌多酚含量測定結(jié)果

表1 黑脈羊肚菌多酚含量Table 1 Polyphenols content of M. angusticepsPcek

由表1可知，游離酚含量為6.272 mg GAE/g，結(jié)合酚含量為0.618 mg GAE/g，游離酚含量約為結(jié)合酚10 倍，占總酚含量的91.03%，說明在黑脈羊肚菌中多酚主要以游離形式存在。

2.2 黑脈羊肚菌多酚的成分確定

黑脈羊肚菌游離酚提取物和結(jié)合酚提取物中主要的酚類物質(zhì)均能得到有效分離，基峰色譜圖見圖1。所鑒定的多酚組分的保留時間、紫外特征吸收波長、m/z和特征離子碎片等信息見表2。

圖1 游離酚（A）、結(jié)合酚（B）和混標（C）基峰色譜圖Fig. 1 Base peak chromatogram of free phenolic compounds (A), bound phenolic compounds (B) of M. angusticeps Pcek and mixture of phenolic standards (C)

峰1產(chǎn)生m/z 169的準分子離子峰，即[M-H]-為169，相對分子質(zhì)量為170。在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 125.025 0是m/z 169失去一分子CO2得到的[M-CO2-H]-，與Biesaga[11]和Jiménez-Sánchez[12]等報道的沒食子酸特征離子峰吻合，且峰1在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與沒食子酸標準品特征離子峰相同。因此，峰1確定為沒食子酸。

峰2產(chǎn)生m/z 125的準分子離子峰，即[M-H]-為125，相對分子質(zhì)量為126。m/z 125在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 107.014 1、95.014 2、79.019 8和69.019 4，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與焦性沒食子酸標準品特征離子峰相同。因此，峰2確定為焦性沒食子酸。

峰3產(chǎn)生m/z 153的準分子離子峰，即[M-H]-為153，相對分子質(zhì)量為154。在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 109.031 1，是m/z 153失去一分子CO2得到的[M-CO2-H]-，與Zhang Lu[13]和Iswaldi[14]等報道的原兒茶酸特征離子峰吻合，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與原兒茶酸標準品特征離子峰相同。因此，峰3確定為原兒茶酸。

峰4產(chǎn)生m/z 137的準分子離子峰，即[M-H]-為137，相對分子質(zhì)量為138。在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 93.035 3為m/z 137失去一分子CO2形成的，即[MCO2-H]-，與Khallouki[15]和Biesaga[11]等報道的對羥基苯甲酸特征離子峰吻合，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與對羥基苯甲酸標準品特征離子峰相同。因此，峰4確定為對羥基苯甲酸。

峰5產(chǎn)生m/z 289的準分子離子峰，即[M-H]-為289，相對分子質(zhì)量為290。m/z 289在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 245.083 2、221.083 4、203.072 2和179.035 7，與Khallouki[15]和Bastos[16]等報道的兒茶素特征離子峰基本吻合，m/z 245.083 1為分子離子峰失去一分子—CH2—CHOH—形成的，即[M-CH2-CHOH-H]-[17-18]，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與兒茶素標準品特征離子峰相同。因此，峰5確定為兒茶素。

峰6產(chǎn)生m/z 179的準分子離子峰，即[M-H]-為179，相對分子質(zhì)量為180。在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 135.045 9，是m/z 179失去一分子CO2得到的，即[M-CO2-H]-，與Zhang Lu[13]和Vallverdú-Queralt[19]等報道的咖啡酸特征離子峰吻合。因此，峰6確定為咖啡酸。

峰7產(chǎn)生m/z 353的準分子離子峰，即[M-H]-為353，相對分子質(zhì)量為354。m/z 353在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 191.056 8、179.035 1和161.024 6，與Gouveia等[20]報道的3-O-咖啡酰奎寧酸特征離子峰吻合。m/z 191.056 8是分子離子失去一分子咖啡酰基得到，即[M-H-C9H8O3]-，m/z 179.035 1為分子離子失去一分子奎寧?；玫剑碵M-H-C7H10O5]-，m/z 161.024 6為咖啡?；鵞21-22]，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與綠原酸標準品特征離子峰相同，而綠原酸本質(zhì)上為咖啡酸衍生物。因此，峰7確定為綠原酸。

峰8產(chǎn)生m/z 447的準分子離子峰，即[M-H]-為447，相對分子質(zhì)量為448。m/z 447在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 357.063 6、327.053 0和299.057 4，與Ibrahim等[23]報道的葒草素特征離子峰基本吻合，m/z 357.063 2、327.052 7為單C-糖基黃酮類物質(zhì)分子離子峰典型的C-糖基夸環(huán)斷裂模式產(chǎn)生的代表性離子碎片，當0,2位斷裂時形成[M-H-120]-，即m/z 327.052 7，當0,3位斷裂時形成[M-H-90]-，即m/z 357.063 2[23-24]，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與葒草素標準品特征離子峰相同。因此，峰8確定為葒草素。

峰9產(chǎn)生m/z 609的準分子離子峰，即[M-H]-為609，相對分子質(zhì)量為610。m/z 609在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 301.037 2和m/z 300.028 9，與Riffault等[21]報道的蘆丁特征離子峰吻合，m/z 301.037 2為分子離子峰失去一分子蕓香糖苷所得槲皮素分子離子峰，即[MC12H20O9-H]-，m/z 300.028 9為槲皮素分子離子峰去H所得[19]，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與蘆丁標準品特征離子峰相同。因此，峰9確定為蘆丁。

峰10產(chǎn)生m/z 463的準分子離子峰，即[M-H]-為463，相對分子質(zhì)量為464。m/z 463在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 301.036 9、300.029 3、271.026 0、255.031 3和151.004 6，與Riffault等[21]報道的金絲桃苷特征離子峰基本吻合，m/z 301.036 9為分子離子峰失去一分子己糖苷形成的槲皮素分子離子峰，即[M-C6H10O5-H]-，m/z 300.029 3為槲皮素分子離子峰去H所得，其余碎片均為槲皮素的特征碎片[25]，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與金絲桃苷標準品特征離子峰相同。因此，峰10確定為金絲桃苷。

峰11產(chǎn)生m/z 227的準分子離子峰，即[M-H]-為227，相對分子質(zhì)量為228。m/z 227在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 185.062 1和m/z 143.051 1，與Hollecker等[26]報道的順式和反式白藜蘆醇特征離子峰基本吻合，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與白藜蘆醇標準品特征離子峰相同。因此，峰11確定為白藜蘆醇。

峰12產(chǎn)生m/z 285的準分子離子峰，即[M-H]-為285，相對分子質(zhì)量為286。m/z 285在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 151.004 3、133.030 0和107.014 8等，與Biesaga等[11]報道的木犀草素特征離子峰基本吻合，分子離子峰的裂解規(guī)律可能和槲皮素的相似，即m/z 151.004 4和m/z 133.030 1可能為分子離子發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)裂解并在1 位和3 位鍵裂解后發(fā)生逆環(huán)化反應(yīng)形成的[27-28]，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與木犀草素標準品特征離子峰相同。因此，峰12確定為木犀草素。

峰13產(chǎn)生m/z 301的準分子離子峰，即[M-H]-為301，相對分子質(zhì)量為302。m/z 301在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 273.041 1、257.238 8、229.051 8、178.998 9、164.011 2和151.004 2等，與de Souza[25]和Biesaga[11]等報道的槲皮素特征離子峰基本吻合，m/z 273.041 1為分子離子峰失去一分子CO形成的，即[MCO-H]-，m/z 257.238 8為分子離子峰失去一分子CO2形成的，即[M-CO2-H]-，m/z 178.998 9和m/z 164.011 2為分子離子發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)裂解并在1位和2位鍵裂解后發(fā)生逆環(huán)化反應(yīng)形成的，m/z 151.004 2為m/z 178.998 9的離子失去一分子CO形成的[27-29]，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與槲皮素標準品特征離子峰相同。因此，峰13確定為槲皮素。

峰14產(chǎn)生m/z 147的準分子離子峰，即[M-H]-為147，相對分子質(zhì)量為148。m/z 147在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 119.050 0、103.056 2、77.040 4和61.988 4，與Ibrahim等[23]報道的肉桂酸特征離子峰有相同部分，根據(jù)Jiménez-Sánchez等[12]總結(jié)的在二級質(zhì)譜中一般損失的中性離子分子質(zhì)量和Pérez-Magari?o等[17]報道的一般酚酸失去低分子質(zhì)量離子的規(guī)律，m/z 119.050 0可能為分子離子峰失去一分子CO形成的，即[M-CO-H]-，m/z 103.056 2可能為分子離子峰失去一分子CO2形成的，即[M-CO2-H]-，m/z 77.040 4可能為分子離子峰失去一分子-CH＝CH-COO-，即[M-CH＝CH-COO-H]-，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與肉桂酸標準品特征離子峰相同。因此，峰14確定為肉桂酸。

峰15產(chǎn)生m/z 193的準分子離子峰，即[M-H]-為193，相對分子質(zhì)量為194。m/z 193在MS2中產(chǎn)生的主要碎片離子m/z 178.028 1、149.061 1和m/z 134.038 3、178.0281，為分子離子峰失去一分子-CH3形成的，即[M-CH3-H]-，m/z 149.061 1為分子離子峰失去一分子CO2形成的，即[M-CO2-H]-，m/z 134.038 3為分子離子峰失去一分子甲基和一分子CO2形成的，即[M-CH3-CO2-H]-，與Biesaga等[11]報道的阿魏酸特征離子峰基本吻合，且在MS及MS2中產(chǎn)生的碎片離子與阿魏酸標準品特征離子峰相同。因此，峰15確定為阿魏酸。

表2 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS鑒定羊肚菌多酚組分Table 2 Identification of the phenolic components of M. angusticeps Pcek by UPLC-DAD/ESI-TOF-MS

2.3 黑脈羊肚菌多酚的抗氧化測定結(jié)果

采用4 種化學(xué)抗氧化活性法測定黑脈羊肚菌多酚的抗氧化活性，以半數(shù)抑制率EC50值作為DPPH自由基、還原力和ABTS+·清除能力大小的評價指標[30]，如圖2所示。

圖2 黑脈羊肚菌多酚抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activities of polyphenols in M. angusticeps Pcek

由圖2可知，黑脈羊肚菌游離酚提取物和結(jié)合酚提取物清除DPPH自由基的EC50值分別為48.358 μg/mL和67.411 μg/mL，說明游離酚提取物清除DPPH自由基能力顯著強于結(jié)合酚提取物，且兩者均顯著弱于抗壞血酸（EC50值18.602 μg/mL）（P＜0.05）；清除ABTS+?EC50值分別為0.392 μg/mL和0.454 μg/mL，說明游離酚提取物與結(jié)合酚提取物清除ABTS+?能力相當，無顯著性差異（P＜0.05）；但兩者均顯著強于抗壞血酸（EC50值0.927 μg/mL）（P＜0.05）；還原力EC50值分別為64.543 μg/mL和91.871 μg/mL，說明游離酚提取物還原力顯著強于結(jié)合酚提取物，且兩者均顯著弱于抗壞血酸（EC50值58.194 μg/mL）（P＜0.05）；ORAC值分別為231.698 μmoL TE/g 和15.272 μmoL TE/g，說明游離酚提取物氧自由基吸收能力遠強于結(jié)合酚提取物。

3 結(jié) 論

本研究通過UPLC-DAD/ESI-TOF-MS技術(shù)鑒定出黑脈羊肚菌多酚提取物共有15 種組分，其中8種酚酸類、6 種黃酮類、1 種二苯乙烯類，分別是沒食子酸、焦性沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、綠原酸、葒草素、兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、木犀草素、槲皮素、白藜蘆醇。其中游離酚提取物中有15 種，結(jié)合酚提取物中有14 種，沒有槲皮素。

一些研究表明食用菌中多酚組分主要是酚酸類物質(zhì)，如雙孢蘑菇中主要為咖啡酸、原兒茶酸、兒茶素、沒食子酸、阿魏酸、楊梅素[31]；硫磺菌等7 種食用菌中主要為咖啡酸、綠原酸、對香豆酸、阿魏酸、沒食子酸、對羥基苯甲酸、楊梅素[32]，而本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑脈羊肚菌多酚提取物中除了常見的食用菌多酚組分外還含有一些黃酮類物質(zhì)。另外，基峰色譜圖中還有很多峰，根據(jù)紫外特征吸收峰、母離子碎片和二級質(zhì)譜碎片不能準確分析是何種物質(zhì)，因此，推斷黑脈羊肚菌多酚提取物中還含有其他較復(fù)雜的酚類物質(zhì)及衍生物，需要優(yōu)化質(zhì)譜條件或者用多級串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，以更全面分析黑脈羊肚菌多酚類物質(zhì)組成。

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Analysis of Phenolic Compounds in Morchella angusticeps Peck by Ultra Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector/Electrospray Ionization-Time of Fight-Mass Spectrometry

SHI Fang1, LIAO Xia1, LU Keke1, ZHENG Shaojie1, XIAO Xingning1, WU Surui2, MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Kunming 650223, China; 3. Chongqing Engineering Research Center for Special Food, Chongqing 400715, China)

Free and bound phenolics from Morchella angusticeps Peck were separately extracted and analyzed by ultra performance liquid chromatography-diode array detector/electrospray ionization-time of fight-mass spectrometry (UPLCDAD/ESI-TOF-MS). The antioxidant activities of the phenolic extracts were assessed. The results showed that phenolics were present mainly in the free form in Morchella angusticeps Peck. The DPPH (1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl) scavenging capacity, reducing power and oxygen radical absorption capacity (ORAC) value of free phenolics from Morchella angusticeps Peck were significantly higher than those of bound ones (P ＜ 0.05), but no significant difference in ABTS+· (2,2’-amino-di (3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6) ammonium salt) scavenging capacity existed between free and bound phenolics. A total of 15 polyphenols in Morchella angusticeps Peck, including gallic acid, pyrogallic acid, protocatechuic acid, p-hydroxybenzoic acid, catechin, caffeic acid, chlorogenic acid, orientin, rutin, hyperoside, resveratrol, luteolin, quercetin, cinnamic acid and ferulic acid, were identified. We identified 15 and 14 components in the free and bound phenolic extracts, respectively.

Morchella angusticeps Peck; polyphenol; UPLC-DAD/ESI-TOF-MS; antioxidant activities

10.7506/spkx1002-6630-201716018

TS201.2

A

1002-6630（2017）16-0115-07

石芳, 廖霞, 盧可可, 等. UPLC-DAD/ESI-TOF-MS鑒定黑脈羊肚菌多酚化合物[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 115-121. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716018. http://www.spkx.net.cn

2016-11-17

國家自然科學(xué)基金面上項目（31471576）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（XDJK2016E113；XDJK2015D035）；云南省科技廳科技創(chuàng)新人才計劃項目（2008OC008）；重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項目（cstc2014pt-gc8001）

石芳（1993—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：1107982769@qq.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：mingjian1972@163.com

SHI Fang, LIAO Xia, LU Keke, et al. Analysis of phenolic compounds in Morchella angusticeps Peck by ultra performance liquid chromatography-diode array detector/electrospray ionization-time of fight-mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(16): 115-121. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716018. http://www.spkx.net.cn