內(nèi)生真菌β-D-葡萄糖醛酸苷酶固定化及其性質(zhì)研究

閆宜江，肖依文，汪涯，吳文婷，常軍，何巧璇，朱篤,2

1 (江西科技師范大學 生命科學學院，江西省生物加工過程重點實驗室，江西 南昌， 330013) 2 (江西師范大學 生命科學學院， 江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌， 330022) 3 (中國成達工程有限公司，四川 成都， 610041)

研究報告

內(nèi)生真菌β-D-葡萄糖醛酸苷酶固定化及其性質(zhì)研究

閆宜江1，肖依文1，汪涯1，吳文婷1，常軍1，何巧璇3，朱篤1,2

1 (江西科技師范大學 生命科學學院，江西省生物加工過程重點實驗室，江西 南昌， 330013) 2 (江西師范大學 生命科學學院， 江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌， 330022) 3 (中國成達工程有限公司，四川 成都， 610041)

以海藻酸鈉為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，對內(nèi)生真菌ChaetomiumglobosumS108的高選擇性β-D-葡萄糖醛酸苷酶的固定化及部分特性進行了研究。結(jié)果表明：β-D-葡萄糖醛酸苷酶的最佳固定化條件為海藻酸鈉1.5%、戊二醛1.5%、添加酶量3 500 U、CaCl2濃度2%，交聯(lián)時間30 min。β-D-葡萄糖醛酸苷酶固定化后，其最適溫度提高5 ℃，最佳pH值由6.0～6.8拓展為5.2～7.6，熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性明顯改善；米氏常數(shù)(Km)明顯增大，而最大反應初速度(Vmax)明顯減小。固定化酶重復操作15 次，其相對酶活仍保持71%。

海藻酸鈉; β-D-葡萄糖醛酸苷酶; 甘草酸; 固定化; 內(nèi)生真菌

甘草酸(glycyrrhizin，GL)是傳統(tǒng)中藥材甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)的主要藥效成分[1-2]，具有抑菌、消炎、抗病毒、抑制腫瘤等活性[3]。由于GL的甜度是蔗糖的80～100倍，也被廣泛應用于食品甜味添加劑[4]。單葡萄糖醛酸甘草次酸(glycyrrhetic acid mono-β-D-glucuronide，GAMG)是甘草酸末端水解1個葡萄糖醛酸后的產(chǎn)物(圖1)。

圖1 甘草酸及其衍生物轉(zhuǎn)化Fig.1 Transformation of glycyrrhizin into its derivatives

與GL相比，GAMG更易進入人體血液循環(huán)，具有更好的生物活性和更低的副作用[5]。此外，GAMG較之GL甜度更高，為蔗糖的1 000倍[6]，因此具有更為廣闊的應用前景?，F(xiàn)有研究表明，采用化學法水解合成GAMG較為困難，這是由于轉(zhuǎn)化過程中GL所含的2分子葡萄糖醛酸極易無選擇性地水解生成甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)[7-9]。酶由于其反應條件溫和且選擇性高，可專一性地催化轉(zhuǎn)化GL生成GAMG而成為一條最為有效的途徑[5,9]?；诖耍Y選高效率、高選擇性的β-D-葡萄糖醛酸苷酶成為高效合成GAMG的關鍵。

植物內(nèi)生菌是存活于植物體內(nèi)而不引起宿主植物發(fā)生病害的一類微生物[10]。植物內(nèi)生真菌生物多樣性豐富，成為一種亟待開發(fā)的微生物資源寶庫。內(nèi)生真菌在適應植物內(nèi)生特殊生境過程中，通過合成淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、漆酶、纖維素酶、果膠酶等水解酶，以保證其侵入植物組織并維持其生存。由于植物內(nèi)生真菌含有豐富的酶系，使其成為亟待開發(fā)的生物催化劑資源寶庫[10]。因此，我們推測植物內(nèi)生真菌可作為高效和高選擇性酶的篩選對象。為了驗證此設想，以可專一性轉(zhuǎn)化GL為GAMG的β-D-葡萄糖醛酸苷酶為篩選對象，利用前期建立的東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌資源庫，開展了具專一性轉(zhuǎn)化能力的內(nèi)生真菌篩選。研究發(fā)現(xiàn)，我們的篩選結(jié)果與設想完全一致，從東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌中篩選到產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶真菌的概率遠大于土壤。東鄉(xiāng)野生稻內(nèi)生真菌ChaetomiumglobosumS108 是其中篩選到的1株具高效轉(zhuǎn)化能力的真菌，從該菌中分離到的β-D-葡萄糖醛酸苷酶粗酶，能高選擇性地水解GL生成GAMG，且沒有副產(chǎn)物生成[11]。

迄今，人們已開展了產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶微生物的篩選，分別從人體腸道和土壤中篩選到Eubacteriumsp.[12]、CryptococcusmagnusMg-27[13]、Aspergillusterreus[14]和PenicilliumpurpurogenumLi-3[15]等微生物，可轉(zhuǎn)化GL生成GAMG。有關β-D-葡萄糖醛酸苷酶的固定化研究也有少量報道，如李春[16-18]等先后采用甲殼素、膨潤土和海藻酸鈉作為載體，李林[19]以仿生氧化硅凝膠為載體，開展了β-D-葡萄糖醛酸苷酶的固定化研究，β-D-葡萄糖醛酸苷酶經(jīng)固定后穩(wěn)定性獲得顯著提高。為了簡化酶在反應體系中的分離工藝，提高酶的可重復性，提高酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，本文開展了C.globosumS108的β-D-葡萄糖醛酸苷酶固定化研究，并對其酶學性質(zhì)和動力學參數(shù)進行比較分析。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

內(nèi)生真菌C.globosumS108由本實驗室從東鄉(xiāng)野生稻中分離獲得，保藏于江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室。GL(≥99%)、GA(≥99%)、D-葡萄糖醛酸均購自阿拉丁試劑公司。GAMG(≥98%)由本實驗室自行分離制備，并進行了光譜學鑒定。海藻酸鈉、戊二醛、氯化鈣、甲醇、醋酸及其他實驗室常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

超高效液相色譜儀UPLC，美國Waters公司；RCT Basic磁力攪拌器，德國IKA公司；恒溫振蕩水浴鍋，蘇州威爾公司；Sorvall Evolution RC離心機，德國Thermo Fisher公司；AKTA purifier UPC10蛋白純化儀，美國GE公司；Lamda365紫外分光光度計，日本愛朗公司。

1.3實驗方法

1.3.1 粗酶液的制備

用接種環(huán)挑取1環(huán)斜面菌種，在無菌條件下接入PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)5 d后，加入過濾滅菌后的GL進行產(chǎn)酶誘導，4 d后離心去除菌體并收集發(fā)酵液。在發(fā)酵液中逐級加入25%、55%、75%(NH4)2SO4進行分級沉淀，取75%(NH4)2SO4處理后的液體，15 000 r/min離心，收集沉淀。沉淀用0.02 mol/L的pH 6.0的醋酸-醋酸銨緩沖液溶解后經(jīng)過G-25葡聚糖柱脫鹽，脫鹽蛋白再以0.02 mol/L的 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液過DEAE-纖維素 DE-52陰離子交換層析，除去部分雜蛋白將蛋白溶液進行初步純化，超濾離心進行濃縮，獲得較純的β-D-葡萄糖醛酸苷酶粗酶，用0.02 mol/L的pH 6.0的醋酸-醋酸銨緩沖液溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 固定化酶凝膠顆粒的制備

預先配制4%的海藻酸鈉溶液，冷卻至室溫，稀釋至不同濃度備用。選擇1 mL不同濃度的海藻酸鈉溶液，與200 μL酶液混合均勻后，加入體積分數(shù)2%的戊二醛，攪拌均勻，室溫下靜置30 min。再用1 mL注射器(12號針頭)吸取0.5 mL均勻的滴入到含有2% CaCl2溶液的燒杯中。搖晃10 min充分凝結(jié)，取出凝膠珠，用0.02 mol/L的pH 6.0的醋酸-醋酸銨緩沖液沖洗3次后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 GL及GAMG的UPLC測定

GL和GAMG分析采用UPLC方法測定，色譜條件為：C18色譜柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)，流動相為V(甲醇)∶V(酸水)(0.5%醋酸)=8∶2，進樣量10 μL，流速1 mL/min，254 nm檢測吸收峰。

1.3.4 酶活力檢測

采用UPLC檢測產(chǎn)物生成量來定義酶活力。取100 μL酶液或相應固定化酶與900 μL的2 mg/mL甘草酸反應30 min后，沸水浴5 min滅活，采用超高效液相色譜檢測產(chǎn)物變化來檢測β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性。

1個酶活單位(U)定義：在測定條件下，每分鐘生成1 mmol的GAMG的量[20]。

(1)

(2)

相對酶活：在檢測影響酶活條件時，將未經(jīng)處理或者酶活最高的酶活作為100%，其他酶活與其的比值即為相對酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 海藻酸鈉濃度對酶活的影響

為了減少酶活損失，盡可能多地固定β-D-葡萄糖醛酸苷酶，就需要加大海藻酸鈉的濃度。但海藻酸鈉濃度過高又會阻礙底物擴散，影響酶與底物間的有效接觸，最終影響酶活和轉(zhuǎn)化效率，因此必需考察合適的海藻酸鈉濃度[21]。由圖2可知，隨著海藻酸鈉濃度的增大，蛋白回收率變化不明顯，但酶活回收率明顯呈現(xiàn)先增大后減小趨勢。當海藻酸鈉濃度為1.5%時，固定化β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力最高，且凝膠珠易成型，顆粒圓潤，彈性和機械強度適中。

圖2 海藻酸鈉對固定化β-D-葡萄糖醛酸苷酶的蛋白和酶活回收率影響Fig.2 Effect of sodium alginate on protein recoveryt and enzymatic activity recovery of immobilized enzyme

2.1.2 戊二醛體積分數(shù)及交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響

戊二醛作為交聯(lián)劑，通過共價結(jié)合能夠使酶分子之間、酶與載體之間交聯(lián)結(jié)合，增加酶的固定量，增強凝膠顆粒的穩(wěn)定性，但這也會在一定程度上破壞酶的結(jié)構(gòu)[22]。不同體積分數(shù)的戊二醛交聯(lián)結(jié)果表明，適量地添加戊二醛有利于提高固定化酶的酶活，當戊二醛的體積分數(shù)為1.5%時，固定化酶的酶活最高，但戊二醛體積分數(shù)進一步提高，酶活開始下降(圖3A)。戊二醛和酶的交聯(lián)時間對酶活亦有明顯影響，過度交聯(lián)會破壞酶的結(jié)構(gòu)，使酶失活[22]。

圖3 戊二醛體積分數(shù)(A)及交聯(lián)時間(B)對β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活力影響Fig.3 Effect of the glutaraldehyde volume fraction (A) and crosslinking time (B) on the activity of immobilized enzyme

由圖3B可知，隨著交聯(lián)時間的延長，固定化酶的酶活呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，交聯(lián)時間為30 min時酶活達到最大，通過SPSS軟件顯著性檢測結(jié)果顯示，交聯(lián)時間為30 min時酶活與交聯(lián)時間10 min和20 min相比，存在顯著性差異。

2.1.3 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響

CaCl2與海藻酸鈉在液滴外面形成緊密膜，從而加速海藻酸鈉凝膠凝固，使顆粒具有一定機械強度，并且使海藻酸鈉在凝膠內(nèi)部形成多孔結(jié)構(gòu)。在CaCl2濃度較低時，凝膠交聯(lián)度不夠，酶易流失，且固定化珠子的機械強度較低。但CaCl2濃度過高時，固定化珠子形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于緊密，凝膠顆粒彈性減弱，從而影響底物分子的擴散及與酶的有效接觸，降低酶的活力[22]。當CaCl2濃度在1.5%時，固定化酶的酶活最高，而且機械強度和彈性適中(圖4)。

圖4 CaCl2濃度對固定化β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活力影響Fig.4 Effect of the concentration of CaCl2 on the activity of immobilized enzyme

2.1.4 酶添加量對固定化酶活的影響

固定化酶的活力取決于加入游離酶的量。一般而言，適量提高游離酶的量有利于提升固定化酶的活力，但過量地添加游離酶相應會使酶的固定化效率降低，造成不必要的資源浪費。由圖5可知，當加入的β-D-葡萄糖醛酸苷酶小于 3 500 U時，隨著游離酶添加量的增加，固定化酶的酶活力逐漸增大，但當酶量達到3 500 U以后，固定化酶的活力增加幅度明顯減緩。為了避免造成酶的浪費，可以選擇每1 mL海藻酸鈉固定酶量在3 500 U以下。

圖5 添加酶量對固定化酶活的影響Fig.5 Effect of the enzyme load on the activity of immobilized enzyme

2.2游離酶與固定化酶的酶學性質(zhì)

2.2.1 游離酶與固定化酶催化反應進程

對游離酶和固定化酶催化GL合成GAMG的反應歷程進行比較。結(jié)果表明：游離酶在180 min時反應達到平衡，而固定化酶需要270 min反應才基本達到平衡。游離酶在反應的前60 min內(nèi)，其反應速率基本保持恒定；而固定化酶在反應的前40 min內(nèi)，其反應速率基本恒定。所以，后續(xù)研究游離酶和固定化酶最大反應速率時，我們分別選取反應時間為50 min和30 min(圖6)。通過固定化酶與游離酶反應速率的比較，初步可以看出游離酶要快于固定化酶，這表明酶的固定化對其活力造成一定影響。

圖6 酶催化生成GAMG的反應進程Fig.6 Catalytic reaction process of β-D-Glucuronidase

2.2.2 酶的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性

將酶促反應的溫度分別設定為30～80 ℃，在pH 6.0條件下測定其酶活，以確定游離酶和固定化酶的最適反應溫度。由圖7A可知，隨著溫度的升高，無論是游離酶還是固定化酶，其酶活均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，酶活下降的原因在于酶蛋白受熱變性的影響超過升溫加快反應速率的影響。游離酶的最適溫度為45～50 ℃，而固定化酶最適溫度為45～55oC，固定化酶較之游離酶的最適溫度提高了5 ℃。

取適量的固定化酶和游離酶，分別在4～80 ℃溫度下保存5 h，然后在45 ℃、pH 6.0條件下測定其酶活，考察游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性。由圖7B可知，固定化能有效提升β-D-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性。游離酶在4～80 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，其活性不斷下降，特別當溫度超過50 ℃時酶活迅速下降；而固定化酶在4～45 ℃范圍內(nèi)，其活力較為穩(wěn)定。這表明β-D-葡萄糖醛酸苷酶經(jīng)固定化后，其熱穩(wěn)定性有了一定程度地提升。

圖7 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的最適溫度(A)及熱穩(wěn)定性(B)Fig.7 Optimal temperature(A) and thermostability(B) of β-D-Glucuronidase

2.2.3 酶的最適pH及pH穩(wěn)定性

在45 ℃的條件下，分別測定不同pH時游離酶和固定化酶的酶活，以確定其最適pH。由圖8A可知，游離酶的最適pH為6.0～6.8，而固定化酶適合的pH明顯變寬，在pH 5.2～7.6時相對活力基本保持在100%。

圖8 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的最適pH(A)及pH穩(wěn)定性(B)Fig.8 Optimal temperature(A) and pH stability(B) of β-D-Glucuronidase

將游離酶和固定化酶分別在pH 2～9的緩沖液中保存5 h后，在45 ℃、pH 6.0的最適條件下檢測酶活，以研究其pH穩(wěn)定性。由圖8B可知，游離酶在pH 4.0～6.8范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，而固定化酶的pH穩(wěn)定性明顯變寬，在pH 2.0～7.6范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，且在pH 4.0～6.8范圍內(nèi)酶活保持在90%以上。這表明，酶經(jīng)固定化后，其pH穩(wěn)定性明顯增強。

2.2.4 游離酶和固定化酶動力學

測定不同底物濃度下的反應初速率，分別以1/[s]為橫坐標，1/[v]為縱坐標作圖，得反應初速率與底物濃度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線。由圖9可知，β-D-葡萄糖醛酸苷酶固定化前后Km分別為0.134 mmol/L和0.312 mmol/L，Vmax由2.92 mmol/(min·L)變?yōu)?.37 mmol/(min·L)。較之于游離酶，固定化酶的Km值變大了，這表明固定化酶與底物的親和力相較游離酶要小，酶與底物結(jié)合的難度增加了，其原因可能是酶固定化后空間阻礙變大，增加了底物與酶的擴散阻力，使得底物與酶的親和力減弱[21]。

圖9 β-D-葡萄糖醛酸苷的Line Weaver-Burk圖Fig.9 Line Weaver-Burk plot for β-D-Glucuronidase

2.3固定化酶的操作穩(wěn)定性

酶固定化的目的在于提高酶的穩(wěn)定性，提高酶的重復利用性，節(jié)約生產(chǎn)成本，因此固定化酶重復性是重要的考察指標。取一定量的固定化酶顆粒，在同等條件下進行15次循環(huán)催化反應，并且確定第一次反應的相對酶活為100%。由圖10可知，在前3次循環(huán)中，固定化酶的催化反應活力基本不變，進行15次循環(huán)后酶的活力仍然能夠保持71%，而且固定化凝膠顆粒沒有破損，保持完整。這表明，通過本研究優(yōu)化工藝制備的固定化酶有較好的操作穩(wěn)定性，可為用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)應用。

圖10 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的操作穩(wěn)定性Fig.10 Operation stability of β-D-Glucuronidase

3 結(jié)論

本文以海藻酸鈉為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，開展內(nèi)生真菌C.globosumS108的高選擇性β-D-葡萄糖醛酸苷酶固定化研究。酶的最佳固定化條件為海藻酸鈉1.5%、戊二醛1.5%、添加酶量為3 500 U、CaCl2濃度2%，交聯(lián)30 min。雖然酶固定化后其Km變大、Vmax降低，但酶的最適反應溫度由45～50 ℃變?yōu)?0～55 ℃，提高了5 ℃；溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均明顯改善。固定化酶經(jīng)15次循環(huán)后其活力可維持71%，有較好的操作穩(wěn)定性，具備應用于大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。

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Immobilizationandpropertiesofahigh-selectivityβ-D-glucuronidasefromendophyticfungusChaetomiumglobosumS108

YAN Yi-jiang1, XIAO Yi-wen1, WANG Ya1, WU Wen-ting1, CHANG Jun1, HE Qiao-xuan3, ZHU Du1,2*

1(Key Lab of Bioprocess Engineering of Jiangxi Province, College of Life Sciences, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China) 2(Key Lab of Protection and Utilization of Subtropic Plant Resource of Jiangxi Provinces, College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China) 3(China Chengda Engineering Co., Ltd., Chengdu 610041, China)

A high-selectivity β-D-glucuronidase from Endophytic FungusChaetomiumglobosumS108 was immobilized into matrix with sodium alginate as embedding material and glutaraldehyde as crosslinking agent. The optimal immobilized conditions were achieved with 1.5% sodium alginate, 1.5% glutaraldehyde, 2% CaCl2and 3 500 U of enzyme load of per milliliter matrix for 30 min. In addition, some immobilized enzymology properties were studied. Compared with free enzyme, the optimum temperature and pH of immobilized enzyme were higher than those of free form, and temperature stability and pH stability of immobilized enzyme were enhanced obviously. After immobilization of β-D-glucuronidase, the Michaelis constant (Km) was increased, and the maximum reaction velocity (Vmax) was decreased respectively. Immobilized β-D-glucuronicdase enzyme activity still retained 71% of its initial activity after consecutive 15 cycles.

sodium alginate; β-D-glucuronicdase; glycyrrhizin; immobilization; Endophytic Fungu

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013962

碩士研究生(朱篤教授為通訊作者,E-mail:zhudu12@163.com)。

國家自然科學基金項目(31260137); “贛鄱英才555工程”領軍人才計劃項目; 江西科技師范大學自然科學科研計劃項目(2016XJZD001)資助

2017-02-03,

2017-04-05