硫化氫對(duì)高糖腹膜透析液誘導(dǎo)大鼠腹膜結(jié)構(gòu)和功能損傷的影響

盧 穎 高蘆燕 宋 鍇 王 峙 沈華英

硫化氫對(duì)高糖腹膜透析液誘導(dǎo)大鼠腹膜結(jié)構(gòu)和功能損傷的影響

盧 穎 高蘆燕 宋 鍇 王 峙 沈華英

目的：觀察硫化氫(H2S)對(duì)高糖腹膜透析液誘導(dǎo)大鼠腹膜結(jié)構(gòu)和功能損傷的影響。 方法：SD大鼠隨機(jī)分為四組(對(duì)照組、單獨(dú)H2S組、模型組及治療組)。第28天行腹膜平衡試驗(yàn)；取壁層腹膜組織觀察腹膜結(jié)構(gòu)變化，檢測(cè)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、膠原蛋白Ⅲ(Col-Ⅲ)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)情況。檢測(cè)大鼠腹膜間皮細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、α-SMA、E-鈣黏素(E-cadherin)和TGF-β1 mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組腹膜增厚伴血管增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，且間皮下α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，治療組腹膜形態(tài)明顯改善，α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表達(dá)顯著減少(P<0.05)。與對(duì)照組相比，模型組超濾量顯著減少，腹膜通透性顯著升高，治療組大鼠腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能顯著改善(P<0.05)。2.5%葡萄糖透析液刺激腹膜間皮細(xì)胞12h使肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)顯著增加、上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)顯著減少，同時(shí)MCP-1、IL-6、ICAM-1和TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)；透析液中加入100 μmol/L、300 μmol/L NaHS可顯著抑制上述炎癥因子及纖維化因子表達(dá)(P<0.01)。 結(jié)論：在腹膜透析液中加入外源性H2S可顯著改善腹膜結(jié)構(gòu)及功能損傷，并可部分逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而減少炎癥因子和纖維化因子合成。

腹膜透析 硫化氫 腹膜纖維化 腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

腹膜透析(PD)是終末期腎病患者主要替代治療方法之一。生物不相容的腹膜透析液(PDF)和反復(fù)發(fā)生的腹膜炎可引起腹膜纖維化，致使PD患者退出PD治療。因此，尋找有效的抗腹膜纖維化藥物是PD基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一。研究表明多種器官纖維化過程中伴有內(nèi)源性硫化氫(H2S)缺乏[1-3]。我們前期研究證實(shí)H2S可抑制腎間質(zhì)纖維化[1]，減輕高糖PDF所致的腹膜間皮細(xì)胞損傷[4]， 提示H2S可能具有抗腹膜纖維化作用。為此，本課題利用4.25%葡萄糖PDF聯(lián)合脂多糖(LPS)建立腹膜纖維化模型，使用H2S供體硫氫化鈉(NaHS)進(jìn)行干預(yù)，觀察H2S對(duì)大鼠腹膜結(jié)構(gòu)及功能的影響，并進(jìn)一步探討H2S對(duì)高糖PDF誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用，以期為防治腹膜纖維化提供新思路。

材料與方法

試劑 4.25%和2.5%葡萄糖PDF(美國(guó)Baxter)；LPS、NaHS(美國(guó)Sigma)；DMEM/F12培養(yǎng)液、0.25%胰酶、0.05%胰酶、胎牛血清、青鏈霉素(美國(guó)GIBCO)；小鼠抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體、兔抗膠原蛋白Ⅲ(Col-Ⅲ)抗體、小鼠抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)抗體(英國(guó)Abcam)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組織化學(xué)超敏試劑盒(美國(guó)VECTOR)。

動(dòng)物模型建立 20只雄性SD大鼠(200±10)g，隨機(jī)分為四組。對(duì)照組：0.9%生理鹽水20 ml/d腹腔注射；單獨(dú)H2S組：NaHS 56 μg/(kg·d)溶于0.9%生理鹽水，20 ml/d腹腔注射；模型組：4.25%葡萄糖PDF 20 ml/d腹腔注射，第1,3,5,7天予LPS 0.6 mg/kg加入PDF中腹腔注射；治療組：造模同時(shí)予NaHS 56 μg/(kg·d)加入PDF腹腔注射，持續(xù)28d。

腹膜功能檢測(cè) 給藥28d后，行腹膜平衡試驗(yàn)(PET)，計(jì)算超濾量(UV)、D2h肌酐/P2h肌酐、D2h葡萄糖/D0h葡萄糖。方法如下：2.5%葡萄糖PDF 20 ml腹腔注射，取0h透出液1 ml測(cè)葡萄糖濃度(D0h葡萄糖)，2h時(shí)置入靜脈導(dǎo)管放大鼠腹腔內(nèi)透析液，取1 ml測(cè)葡萄糖及肌酐濃度(D2h葡萄糖、D2h肌酐)。乙醚吸入麻醉大鼠，用無菌紗布吸干腹水稱重，減去干紗布重量，差額計(jì)入總超濾量。UV(ml)=導(dǎo)管排出量+(濕紗布重量-干紗布重量)-20。經(jīng)下腔靜脈取血2 ml測(cè)肌酐濃度(P2h肌酐)。

組織病理染色 壁層腹膜組織固定后石蠟包埋，5 μm切片，行HE和Masson染色，計(jì)算單位面積血管數(shù)及炎癥細(xì)胞數(shù)；腹膜厚度測(cè)量參照文獻(xiàn)[5]。

免疫組化 鏈霉親和素-生物素過氧化物酶復(fù)合法進(jìn)行免疫組化染色，一抗稀釋倍數(shù)(1∶ 100)。顯微鏡下隨機(jī)選8個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)α-SMA,TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)，利用MetaMorph 6.3 圖像分析軟件測(cè)量Col-Ⅲ面積。

原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和分組 SD大鼠麻醉后取大網(wǎng)膜；加入0.125%胰酶37℃震蕩孵育20 min；離心后棄上清，加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分組：空白組(細(xì)胞培養(yǎng)液)；2.5%葡萄糖PDF組[2.5%葡萄糖PDF：細(xì)胞培養(yǎng)液(V/V)=1∶ 1] ；單獨(dú)H2S組(細(xì)胞培養(yǎng)液含300 μmol/L NaHS)；低、高劑量H2S治療組[2.5%PDF：細(xì)胞培養(yǎng)液(V∶ V)=1∶ 1，分別加入NaHS 100 μmol/L、300 μmol/L]。

RT-PCR TRIzol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR引物由上海生工合成：MCP-1上游5′-GCAGGTGTCCCAAAGAAG-3′，下游5′-TCAAAGGTGCTGAAGTCC-3′；ICAM-1上游5′-TGGGTCATAATTGTTGGTG-3′，下游5′-CTGAGCCTTCTGTAACTTGTAT-3′；IL-6上游5′-CCTTCTTGGGACTGATGT-3′，下游5′-CTCTGGCTTTGTCTTTCT-3′；α-SMA上游5′-CTCTCCAGCCATCTTTCAT-3′，下游5′-TCATGATGCTGTTATAGGTGGT-3′；E- cadherin上游5′-ACCCGGGACAATGTGTATTACT-3′，下游5′-GCTGGCTCAAATCAAAGTCC-3′；TGF-β1上游5′-CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3′，下游5′-GCCTTAGTTTGGACACGATCTG-3′；β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，下游5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94℃ 30s，54～56℃ 30s，72℃ 30s；72℃延伸5 min,共35個(gè)循環(huán)。取10 μl PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。應(yīng)用凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以Graphpad Prism 5軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多均數(shù)之間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

大鼠腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能 與對(duì)照組相比，模型組腹膜超濾量顯著減少(P<0.05)，D2h肌酐/P2h肌酐顯著升高、D2h葡萄糖/D0h葡萄糖顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，治療組超濾量顯著增加，D2h肌酐/P2h肌酐下降、D2h葡萄糖/D0h葡萄糖升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 各組大鼠腹膜平衡試驗(yàn)(PET)結(jié)果及腹膜組織學(xué)檢測(cè)情況

D2h肌酐/P2h肌酐：2h透析液及血漿肌酐濃度比值；D2h葡萄糖/D0h葡萄糖：2h及0h透析液葡萄糖濃度比值；α-SMA：α平滑肌肌動(dòng)蛋白；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；Col-Ⅲ：膠原蛋白Ⅲ；a：與對(duì)照組比較，P<0.05；b：與模型組比較，P<0.05

圖1 大鼠壁層腹膜病理改變(HE，×200)對(duì)照組(A)和單獨(dú)H2S組(B)大鼠壁層腹膜表面光滑，可見一層扁平腹膜間皮細(xì)胞；模型組(C)腹膜間皮下基質(zhì)增厚、新生血管增多伴大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；治療組(D)腹膜間皮下基質(zhì)變薄，伴新生血管及炎癥細(xì)胞減少

大鼠壁層腹膜HE染色結(jié)果 對(duì)照組和單獨(dú)H2S組大鼠腹膜表面光滑，可見一層扁平腹膜間皮細(xì)胞，間皮下基質(zhì)薄，基質(zhì)內(nèi)見脂肪細(xì)胞、少許炎癥細(xì)胞及血管；與對(duì)照組相比，模型組大鼠腹膜間皮細(xì)胞脫落，間皮下基質(zhì)顯著增厚，新生血管增多伴大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；治療組上述改變得到顯著改善(圖1)。炎癥細(xì)胞和血管計(jì)數(shù)半定量結(jié)果見表1。

大鼠壁層腹膜Masson染色結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠腹膜間皮下致密層厚度增加，腹膜明顯增厚[(206.60±52.60) μmvs(15.89±4.90) μm，P<0.05]；與模型組相比，治療組腹膜厚度顯著降低[(78.11±9.39) μmvs(206.60±52.60) μm，P<0.05](表1、圖2)。

大鼠壁層腹膜α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表達(dá)情況 α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1在對(duì)照組和單獨(dú)H2S組大鼠腹膜中僅微弱表達(dá)；與對(duì)照組相比，模型組大鼠腹膜間皮下α-SMA、TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，Col-Ⅲ表達(dá)量也顯著增加(均P<0.05)；治療組大鼠腹膜組織上述蛋白表達(dá)量顯著低于模型組(均P<0.05)(表1、圖3～5)。

圖2 大鼠壁層腹膜病理改變(Masson,×100)對(duì)照組(A)和單獨(dú)H2S組(B)大鼠壁層腹膜間皮下僅有少量基質(zhì)；模型組(C)腹膜間皮下基質(zhì)增加，腹膜增厚；與模型組相比，治療組(D)腹膜厚度顯著降低

圖3 大鼠壁層腹膜α-SMA表達(dá)情況(IH,×200)對(duì)照組(A)和單獨(dú)H2S組(B)大鼠壁層腹膜表達(dá)少量α-SMA；C:模型組大鼠腹膜間皮下α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多；D:治療組大鼠腹膜間皮下α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著減少

圖4 大鼠壁層腹膜Col-Ⅲ表達(dá)情況(IH,×200)對(duì)照組(A)和單獨(dú)H2S組(B)大鼠壁層腹膜中僅表達(dá)少量Col-Ⅲ；C:模型組大鼠腹膜間皮下Col-Ⅲ表達(dá)量顯著增加；D:治療組大鼠腹膜組織Col-Ⅲ表達(dá)量顯著低于模型組

圖5 大鼠壁層腹膜TGF-β1表達(dá)情況(IH,×200)對(duì)照組(A)和單獨(dú)H2S組(B)大鼠腹膜間皮下可見極少TGF-β1陽性細(xì)胞；C:模型組大鼠腹膜間皮下TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加；D:治療組大鼠腹膜間皮下TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著減少

大鼠腹膜間皮細(xì)胞MCP-1、IL-6和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)mRNA表達(dá)情況 與空白組相比，2.5%葡萄糖PDF刺激12 h使腹膜間皮細(xì)胞中MCP-1、IL-6和ICAM-1 mRNA表達(dá)分別升高(7.71±2.82) 倍、(11.07±4.35)倍和(11.02±0.36)倍(均P<0.01)；在培養(yǎng)液中加入300 μM NaHS再加2.5%葡萄糖PDF刺激，與2.5%葡萄糖PDF組相比，MCP-1、IL-6和ICAM-1 mRNA表達(dá)分別下降(49.64%±4.39%)、(80.84%±10.21%)和(58.44%±8.96%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

大鼠腹膜間皮細(xì)胞α-SMA、E-cadherin和TGF-β1 mRNA表達(dá)情況 與空白組相比，2.5%葡萄糖PDF刺激12h使腹膜間皮細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1 mRNA表達(dá)分別升高(1.96±0.89) 倍和(7.57±1.99) 倍，E-cadherin mRNA表達(dá)下降(91.53%±1.05%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在培養(yǎng)液中加入NaHS 300 μmol/L再用2.5%葡萄糖PDF刺激,與2.5%葡萄糖PDF組相比，α-SMA、TGF-β1 mRNA表達(dá)分別下降(49.52%±9.38%)和(62.46%±7.98%)，E-cadherin mRNA表達(dá)增加(7.73±1.37)倍(均P<0.01)(圖6)。

圖6 腹膜間皮細(xì)胞MCP-1、ICAM-1、IL-6、α-SMA、E-cadherin和TGF-β1 mRNA表達(dá)MCP-1：?jiǎn)魏思?xì)胞趨化蛋白1；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子1；IL-6：白細(xì)胞介素6；α-SMA：α平滑肌肌動(dòng)蛋白；E-cadherin ：E鈣黏素；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；2.5%PDF：2.5%腹膜透析液；NaHS：硫氫化鈉；**：與空白組比較，P<0.01；##：與2.5%PDF組比較，P<0.01

討 論

內(nèi)源性H2S存在于多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)并發(fā)揮重要作用。在肝硬化、肺纖維化、腎間質(zhì)纖維過程中，常伴內(nèi)源性H2S水平偏低，適量補(bǔ)充外源性H2S，可顯著改善器官纖維化[1,3,6]。然而，PDF中加入適量H2S能否改善PD所致的腹膜纖維化尚未見報(bào)道，故本研究旨在觀察在PDF中添加外源性H2S能否減輕腹膜纖維化，并在細(xì)胞水平探討其機(jī)制。我們前期研究發(fā)現(xiàn)NaHS治療腎臟纖維化的最佳劑量為56 μg/(kg·d)，560 μg/(kg·d)時(shí)具有毒性[1]。故本研究中大鼠NaHS劑量采用56 μg/(kg·d)，此劑量產(chǎn)生的H2S濃度在大鼠生理濃度范圍內(nèi)[1,7]。文獻(xiàn)報(bào)道，NaHS作用于細(xì)胞的濃度為25～500 μmol/L[8-9]，我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示濃度超過500 μmol/L對(duì)細(xì)胞具有毒性。故本研究選擇100 μmol/L和300 μmol/L NaHS作用于腹膜間皮細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腹膜表面間皮細(xì)胞脫落，間皮下基質(zhì)增厚伴新生血管增多和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，且超濾量顯著減少，與既往研究相符[10]。而予模型組大鼠腹腔注射NaHS[56 μg/(kg·d)]能明顯降低腹膜厚度，減少血管增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴腹膜通透性降低、超濾量顯著增加，提示腹膜結(jié)構(gòu)及功能均明顯改善。既往研究表明，TGF-β1可引起腹膜間皮下新生血管增多、α-SMA表達(dá)增多及腹膜通透性增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腹膜間皮下TGF-β1表達(dá)明顯增多，α-SMA、Col-Ⅲ等細(xì)胞外基質(zhì)成分聚集；予NaHS干預(yù)后，腹膜間皮下TGF-β1表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)成分顯著減少，再次證實(shí)外源性H2S對(duì)改善PDF誘導(dǎo)的腹膜結(jié)構(gòu)和功能損傷有益，具有抗腹膜纖維化作用。

腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)直接參與腹膜纖維化[11-12]。高糖刺激下，腹膜間皮細(xì)胞分泌大量TGF-β1和炎癥因子，促使間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即細(xì)胞失去典型上皮細(xì)胞骨架，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白(如E-cadherin)表達(dá)減少，成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白(如α-SMA)表達(dá)增多，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)[13-14]。與既往研究相符[13-14]，本研究發(fā)現(xiàn)，高糖PDF使腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1及炎癥因子表達(dá)顯著增多，同時(shí)伴E-cadherin表達(dá)減少、α-SMA表達(dá)增加，提示在此過程中腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化；而給予NaHS干預(yù)，TGF-β1表達(dá)明顯減少，并能抑制E-cadherin表達(dá)減少和α-SMA表達(dá)增加，提示外源性H2S能通過抑制腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而發(fā)揮抗纖維化作用。

炎癥是誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要使動(dòng)因素，也是腹膜纖維化的上游事件[15-16]。在急性肺損傷模型中，H2S明顯抑制肺內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集，降低血漿和肺組織中IL-8和IL-6水平，增加IL-10水平[17]。哮喘大鼠的肺組織中內(nèi)源性H2S濃度、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathio nine γ-lyase,CSE)活性及蛋白表達(dá)降低；給予NaHS 后支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞均減少[18]。外源性H2S可下調(diào)腦組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和MCP-1表達(dá)，上調(diào)IL-10，減輕腦組織炎癥損傷[19]。GYY4137(一種新型H2S外源性供體)可減少細(xì)胞促炎癥因子產(chǎn)生，增強(qiáng)抗炎物質(zhì)分泌，保護(hù)機(jī)體免受內(nèi)毒素血癥[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖PDF刺激后，腹膜間皮細(xì)胞分泌大量炎癥因子(如MCP-1等)，NaHS可顯著抑制腹膜間皮細(xì)胞合成以上炎癥因子，提示H2S抗腹膜纖維化作用與其抗炎作用有關(guān)。

綜上所述，適當(dāng)濃度外源性H2S可減輕高糖PDF對(duì)大鼠腹膜結(jié)構(gòu)及功能的損傷，改善腹膜纖維化，初步研究結(jié)果認(rèn)為其保護(hù)作用與抗炎、抑制腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)，但其涉及的具體信號(hào)通路及分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究探明。

1 Song K,Wang F,Li Q,et al.Hydrogen sulfide inhibits the renal fibrosis of obstructive nephropathy.Kidney Int,2014,85(6):1318-1329.

2 Babaei-Karamshahlou M,Hooshmand B,Hajizadeh S,et al.The role of endogenous hydrogen sulfide in pathogenesis of chronotropic dysfunction in rats with cirrhosis.Eur J Pharmacol,2012,696(1-3):130-135.

3 Zhou X,An G,Chen J.Inhibitory effects of hydrogen sulphide on pulmonary fibrosis in smoking rats via attenuation of oxidative stress and inflammation.J Cell Mol Med,2014,18(6):1098-1103.

4 Lu Y,Shen H,Shi X,et al.Hydrogen sulfide ameliorates high-glucose toxicity in rat peritoneal mesothelial cells by attenuating oxidative stress.Nephron Exp Nephrol,2014,126(3):157-165.

5 Kato H,Mizuno T,Mizuno M,et al.Atrial natriuretic peptide ameliorates peritoneal fibrosis in rat peritonitis model.Nephrol Dial Transplant,2012,27(2):526-536.

6 Mani S,Cao W,Wu L,et al.Hydrogen sulfide and the liver.Nitric Oxide,2014,41:62-71.

7 Whitfield NL,Kreimier EL,Verdial FC,et al.Reappraisal of H2S/sulfide concentration in vertebrate blood and its potential significance in ischemic preconditioning and vascular signaling.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2008,294(6):R1930-1937.

8 Ge SN,Zhao MM,Wu DD,et al.Hydrogen sulfide targets EGFR Cys797/Cys798 residues to induce Na(+)/K(+)-ATPase endocytosis and inhibition in renal tubular epithelial cells and increase sodium excretion in chronic salt-loaded rats.Antioxid Redox Signal,2014,21(15):2061-2082.

9 Lee HJ,Mariappan MM,Feliers D,et al.Hydrogen sulfide inhibits high glucose-induced matrix protein synthesis by activating AMP-activated protein kinase in renal epithelial cells.J Biol Chem,2012,287(7):4451-4461.

10 Padwal M,Siddique I,Wu L,et al.Matrix metalloproteinase 9 is associated with peritoneal membrane solute transport and induces angiogenesis through beta-catenin signaling.Nephrol Dial Transplant,2017,32(1):50-61.

11 Strippoli R,Moreno-Vicente R,Battistelli C,et al.Molecular Mechanisms Underlying Peritoneal EMT and Fibrosis.Stem Cells Int,2016,2016:3543678

12 彭衛(wèi)生,周巧玲,唐榮,等.法舒地爾對(duì)腹膜透析大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.腎臟病與透析腎移植雜志,2013,22(2):134-138.

13 Morishita Y,Ookawara S,Hirahara I,et al.HIF-1alpha mediates Hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in peritoneal mesothelial cells.Ren Fail,2016,38(2):282-289.

14 黃玉晗.腹膜透析與腹膜纖維化.腎臟病與透析腎移植雜志,2014,23(4):382-384.

15 Lambie MR,Chess J,Summers AM,et al.Peritoneal inflammation precedes encapsulating peritoneal sclerosis:results from the GLOBAL Fluid Study.Nephrol Dial Transplant,2016,31(3):480-486.

16 Raby AC,Colmont CS,Kift-Morgan A,et al.Toll-Like Receptors 2 and 4 Are Potential Therapeutic Targets in Peritoneal Dialysis-Associated Fibrosis.J Am Soc Nephrol,2016,28(2):461-478.

17 Li T,Zhao B,Wang C,et al.Regulatory effects of hydrogen sulfide on IL-6,IL-8 and IL-10 levels in the plasma and pulmonary tissue of rats with acute lung injury.Exp Biol Med (Maywood),2008,233(9):1081-1087.

18 Chen YH,Wu R,Geng B,et al.Endogenous hydrogen sulfide reduces airway inflammation and remodeling in a rat model of asthma.Cytokine,2009,45(2):117-123.

19 Yin J,Tu C,Zhao J,et al.Exogenous hydrogen sulfide protects against global cerebral ischemia/reperfusion injury via its anti-oxidative,anti-inflammatory and anti-apoptotic effects in rats.Brain Res,2013,1491:188-196.

20 Li L,Salto-Tellez M,Tan CH,et al.GYY4137,a novel hydrogen sulfide-releasing molecule,protects against endotoxic shock in the rat.Free Radic Biol Med,2009,47(1):103-113.

(本文編輯 青 松)

Effects of exogenous H2S on peritoneal morphological and functional damages in a rat model of peritoneal dialysis

LUYing,GAOLuyan,SONGKai,WANGZhi,SHENHuaying

DepartmentofNephrology,SecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215004,China

SHENHuaying(E-mail:shenhy513@sina.com)

Objective：To investigate the effect of exogenous hydrogen sulfide (H2S) on peritoneal morphological and functional damages in a rat model of peritoneal dialysis (PD). Methodology：A model of peritoneal fibrosis was established by intraperitoneally injecting 4.25%-glucose peritoneal dialysis fluids (PDFs) and lipopolysaccharide (LPS) to Sprague-Dawley rats. And rats

daily intraperitoneal injections of NaHS (56 μg/kg), an H2S donor. After 28 days, peritoneal equilibration test (PET) was used to assess peritoneal function. Hematoxylin and eosin and Masson-trichrome staining were performed to observe pathological changes of parietal peritoneum. Immunohistochemical staining was used to detect α-smooth muscle actin (α-SMA), type III collagen (Col-Ⅲ) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Synchronized confluent rat peritoneal mesothelial cells (PMCs) were incubated with 2.5%-glucose PDFs with or without NaHS. The level of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)、interleukin-6 (IL-6)、intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1)、α-SMA、E-cadherin and TGF-β1 mRNA produced by PMCs were detected by RT-PCR. Results： Compared with the control group, parietal peritoneum of the model rats under light microscopy exhibited thicker collagen accumulation, more neoangiogenesis and inflammatory cells infiltration (P<0.05). The expressions of Col-Ⅲ, α-SMA and TGF-β1 were significantly increased in the fibrotic peritoneum (P<0.05). Moreover, ultrafiltration volume (UV) of the PD model group was significantly decreased, while a higher peritoneal permeability reflected as a decrease of the D2/D0 glucose and an increase of the D2/P2 creatinine ratio (P<0.05). By contrast, administration of NaHS to the model rats, markedly decreased the inflammatory cells infiltration, neoangiogenesis and the biomarkers of fibrosis in the peritoneum (P<0.05), paralleled by reduced peritoneal permeability and increased ultrafiltration capacity (P<0.05). In cell culture experiments, exposure of rat PMCs to 2.5%-glucose PDFs for 12 hours resulted in a significantly upregulated expression of MCP-1, IL-6, ICAM-1 and TGF-β1 mRNA, which were attenuated by NaHS (P<0.01). Moreover, treatment with NaHS prevented 2.5%-glucose PDFs-induced upregulated expression ofα-SMA and downgulated expression of E-cadherin in rat PMCs (P<0.01). Conclusion：These findings suggest that, exogenous H2S is able to ameliorate peritoneal fibrosis and improve peritoneal transport function.

peritoneal dialysis hydrogen sulfide peritoneal fibrosis epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1006-298X.2017.04.008

國(guó)家自然科學(xué)基金(青年科學(xué)基金)(81400762);蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目基金(應(yīng)用基礎(chǔ)研究)(SYS201469)

蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科(蘇州，215004)

沈華英(E-mail：shenhy513@sina.com )

2016-11-21

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有