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    川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用機(jī)制

    2017-09-03 10:27:28馬方旭張秀瓏張志華王布湯建華
    山東醫(yī)藥 2017年28期
    關(guān)鍵詞:抑瘤川芎嗪生理鹽水

    馬方旭,張秀瓏,張志華,王布,湯建華

    (1 河北北方學(xué)院,河北張家口075000;2 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

    川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用機(jī)制

    馬方旭1,張秀瓏2,張志華2,王布2,湯建華2

    (1 河北北方學(xué)院,河北張家口075000;2 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

    目的 探討川芎嗪(TMP)聯(lián)合順鉑(DDP)對肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用機(jī)制。方法 將56只C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為生理鹽水組、DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組。各組右腋皮下接種Lewis肺腺癌細(xì)胞,建立移植瘤模型。接種第7天,生理鹽水組腹腔注射生理鹽水0.2 mL,TMP組腹腔注射TMP 100 mg/kg,DDP組腹腔注射DDP 2 mg/kg,TMP聯(lián)合DDP組腹腔注射TMP及DDP,劑量同上,每天1次,連續(xù)2周。末次注射24 h,各組均眼球取血,檢測血清CXCL16、TNF-α;斷頸處死,稱取瘤質(zhì)量,計算抑瘤率;取部分腫瘤組織,檢測CXCL16、TNF-α蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果 DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率分別為40.74%、21.69%、61.11%,TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率明顯高于DDP組、TMP組(P均<0.05),而DDP組與TMP組比較P>0.05。DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組血清CXCL16水平及腫瘤組織CXCL16蛋白相對表達(dá)量均低于生理鹽水組,以TMP聯(lián)合DDP組最低(P均<0.05);血清TNF-α水平及腫瘤組織TNF-α蛋白相對表達(dá)量均高于生理鹽水組,以TMP聯(lián)合DDP組最高(P均<0.05);DDP組與TMP組血清CXCL16、TNF-α水平及腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白相對表達(dá)量比較P均>0.05。結(jié)論 TMP、DDP對肺腺癌小鼠均有一定抑瘤作用,二者聯(lián)合抑瘤效果更佳;其作用機(jī)制可能與上調(diào)TNF-α表達(dá)、下調(diào)CXCL16表達(dá)有關(guān)。

    肺腺癌;川芎嗪;順鉑;趨化因子配體16;腫瘤壞死因子α

    肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,其中約50%為肺腺癌。手術(shù)、放化療及靶向治療是目前治療肺腺癌的主要方法,但總體治療效果較差。川芎嗪(TMP)是臨床常用活血化瘀藥川芎的主要活性成分,屬于酰胺類生物堿。TMP作為血管新生抑制劑,不但可直接抑制腫瘤生長,還可提高化療藥物免疫調(diào)節(jié)作用,間接發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。順鉑(DDP)是臨床常用的抗腫瘤藥,具有抗腫瘤譜廣、作用強(qiáng),可與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用且無交叉耐藥等特點。故理論上TMP輔助治療能提高DDP的化療效果[2],但目前關(guān)于二者聯(lián)合用于肺腺癌治療的報道較少。CXCL16是近年新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,具有促血管新生作用[3]。TNF-α是目前公認(rèn)抗腫瘤作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。TMP聯(lián)合DDP是否通過CXCL16、TNF-α發(fā)揮作用尚不清楚。2016年2~8月,我們觀察了TMP聯(lián)合DDP對肺腺癌小鼠的抑瘤效果,現(xiàn)分析結(jié)果并探討其可能的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 健康雄性C57BL/6小鼠56只,5~6周齡,體質(zhì)量20~22 g,購自中國軍事科學(xué)院實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK2011- 0004。Lewis肺腺癌瘤株,由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫提供。HS-1300-U型超凈工作臺,上海博泰實驗設(shè)備有限公司;倒置相差顯微鏡,日本Olympus公司;SpectraMax M3型多功能酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices公司。鹽酸川芎嗪注射液,廣東南國藥業(yè)有限公司;注射用順鉑,齊魯制藥有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基,美國Gibco公司;FBS,浙江天杭生物科技股份有限公司;兔抗鼠CXCL16抗體,北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠TNF-α抗體,武漢博士德生物工程有限公司;免疫組化試劑盒,北京莊盟國際生物基因科技有限公司;EDTA,美國Gibco公司;小鼠CXCL16 ELISA試劑盒,上海研晶生化試劑有限公司;小鼠TNF-α ELISA試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司。

    1.2 模型制備及分組處理 取Lewis肺腺癌細(xì)胞,接種于含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,用含EDTA的胰酶消化后傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期Lewis肺腺癌細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,用生理鹽水制備密度為1×107個/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液0.2 mL,接種于小鼠右腋皮下,制備Lewis肺腺癌模型。接種第2天,隨機(jī)將小鼠分為生理鹽水組、TMP組、DDP組、TMP聯(lián)合DDP組,每組14只。接種第7天,所有小鼠可觸及直徑2~3 mm的腫瘤,表明模型制備成功。模型制備成功同日,生理鹽水組腹腔注射生理鹽水0.2 mL,TMP組腹腔注射TMP 100 mg/kg,DDP組腹腔注射DDP 2 mg/kg;TMP聯(lián)合DDP組腹腔注射TMP 100 mg/kg+DDP 2 mg/kg。每天1次,連續(xù)2周。

    1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

    1.3.1 血清CXCL16、TNF-α水平 末次注射24 h,眼球取血,靜置30 min,2 000 r/min離心15 min,收集上清液,-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測血清CXCL16、TNF-α。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

    1.3.2 抑瘤率 各組眼球取血后,斷頸處死,分離腋下腫瘤組織,清理干凈后稱質(zhì)量,計算抑瘤率。抑瘤率=(對照組腫瘤質(zhì)量-觀察組腫瘤質(zhì)量)/對照組腫瘤質(zhì)量×100%。

    1.3.3 腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白表達(dá) 采用免疫組化SP法。取各組腫瘤組織,4%多聚甲醛固定,脫水,石蠟包埋,4 μm厚切片。切片經(jīng)脫蠟水化,97 ℃枸櫞酸鹽修復(fù)液修復(fù),室溫冷卻10 min,5% BSA常溫封閉15 min,分別滴加兔抗小鼠CXCL16一抗(1∶50)或TNF-α一抗(1∶100),以PBS代替一抗作為陰性對照,濕盒30 min,4 ℃冰箱過夜。次日37 ℃復(fù)溫45 min,甩去多余液體,PBS沖洗。用濾紙將組織周圍的液體吸干,加入羊抗兔二抗(1∶200),37 ℃恒溫箱孵育30 min,PBS沖洗。DAB避光染色2 min,蘇木素復(fù)染,氨水返藍(lán),常規(guī)脫水,透明,封片,顯微鏡下拍照觀察。CXCL16或TNF-α蛋白陽性表達(dá)定位于胞質(zhì)或胞膜,呈棕黃色顆粒狀。采用Image-proplus6.0軟件分析圖像,統(tǒng)計積分光密度(IOD)值[4]。以IOD值代表目的蛋白相對表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1 各組血清CXCL16、TNF-α水平比較 見表1。

    2.2 各組抑瘤率比較 生理鹽水組、DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組腫瘤質(zhì)量分別為(3.78±0.09)、(2.24±0.26)、(2.96±0.25)、(1.47±0.30)g,抑瘤率分別為0、40.74%、21.69%、61.11%。TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率明顯高于DDP組、TMP組(P均<0.05),而DDP組與TMP組比較P>0.05。

    表1 各組血清CXCL16、TNF-α水平比較

    注:與生理鹽水組比較,*P<0.05;與DDP組比較,#P<0.05;與TMP組比較,△P<0.05。

    2.3 各組腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白表達(dá)比較 見表2。

    表2 各組腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白相對表達(dá)量比較

    注:與生理鹽水組比較,*P<0.05;與DDP組比較,#P<0.05;與TMP組比較,△P<0.05。

    3 討論

    肺腺癌細(xì)胞主要來源于支氣管黏膜上皮,一般情況下腫瘤生長較緩慢,但早期即可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。因早期無明顯臨床癥狀,多數(shù)患者就診時已屬中晚期。肺腺癌的治療方法較多,但含鉑類的化療方案仍占有重要地位。近年來隨著對中醫(yī)藥理研究的深入,發(fā)現(xiàn)中藥輔助西藥化療不但能增加化療藥物敏感性,增強(qiáng)化療效果,還能降低化療藥物引起的毒副作用,提高患者機(jī)體免疫力,延長患者生存期[5,6]。因此,探索高效低毒的增敏劑以增強(qiáng)化療藥物療效,成為當(dāng)前研究的熱點。

    TMP是中藥川芎、當(dāng)歸的主要活性成分,其有效化學(xué)成分為四甲基吡嗪,具有抗炎、抗凋亡、舒張血管等多種生物學(xué)活性,在心腦血管病、消化系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病中應(yīng)用較為廣泛[7]。近年研究發(fā)現(xiàn),TMP不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞,還能間接抑制腫瘤血管生成,繼而抑制腫瘤生長[8]。研究發(fā)現(xiàn),TMP能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞G1期阻滯和早期凋亡[9]; TMP能夠引起U937細(xì)胞中凋亡抑制因子、凋亡促進(jìn)因子及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的變化,啟動凋亡程序,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10];TMP還可抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長,其機(jī)制可能是通過促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯、抑制NF-κB及其靶基因蛋白表達(dá)等[11];TMP能通過上調(diào)NK細(xì)胞等的生物學(xué)活性,調(diào)控Th2類細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá),提高機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答效果,從而增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用,間接發(fā)揮抗腫瘤作用[12];TMP還可增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,降低化療藥物引起的毒副作用,改善腫瘤組織周圍的微環(huán)境及腫瘤細(xì)胞的缺氧環(huán)境,增強(qiáng)腫瘤在放療中的敏感性[13,14]。DDP是臨床應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤藥,可與DNA結(jié)合形成DDP-DNA復(fù)合物,導(dǎo)致DNA復(fù)制障礙,從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂,為非特異性細(xì)胞周期化療藥物。有研究表明,TMP聯(lián)合DDP不僅能增強(qiáng)DDP的化療效果,還能降低化療藥物引起的毒副作用[15,16]。本研究結(jié)果顯示,TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率明顯高于DDP組、TMP組,而DDP組與TMP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明TMP和DDP均具有抑瘤作用,二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

    CXCL16是近年發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,屬于CXC趨化因子家族。目前國內(nèi)外對CXCL16的研究主要集中于心血管疾病、免疫性疾病及炎癥性疾病等方面。除在先天性免疫和獲得性免疫介導(dǎo)的機(jī)體防御中具有重要作用外,CXCL16還能介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和血管生成[17]。CXCL16與其惟一的受體CXCR6結(jié)合,可激活NF-κB和AKT/mTOR等信號通路,促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的多肽類細(xì)胞因子,是迄今為止抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子。TNF-α不僅能通過調(diào)控NF-κB信號通路干擾腫瘤血管系統(tǒng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)機(jī)體免疫力[19,20],還可誘導(dǎo)腫瘤血管的高滲透性,使腫瘤部位化療藥物濃度升高,提高抗腫瘤效果[21]。本研究結(jié)果顯示,DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組血清CXCL16水平及腫瘤組織CXCL16蛋白表達(dá)均低于生理鹽水組,以TMP聯(lián)合DDP組最低;血清TNF-α水平及腫瘤組織TNF-α蛋白相對表達(dá)量均高于生理鹽水組,以TMP聯(lián)合DDP組最高;DDP組與TMP組血清CXCL16、TNF-α水平及腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白相對表達(dá)量比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。表明TMP和DDP均能通過抑制CXCL16表達(dá),促進(jìn)TNF-α表達(dá),抑制腫瘤血管生成,繼而抑制腫瘤生長,二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

    綜上所述,TMP、DDP對肺腺癌小鼠均有一定抑瘤作用,二者聯(lián)合應(yīng)用抑瘤效果更佳;其作用機(jī)制可能與上調(diào)TNF-α表達(dá)、下調(diào)CXCL16表達(dá)有關(guān),但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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    河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題資助計劃項目(20170185)。

    張秀瓏(E-mail: zzh19641229@163.com)

    10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.011

    R734.2

    A

    1002- 266X(2017)28- 0040- 03

    2016- 09-27)

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