IL-36α對銀屑病小鼠皮膚病變的影響及其作用機制

朱超英，溫炬，李婷，趙琪楠，秦思

(1 南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省第二人民醫(yī)院，廣州510317；2南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院)

IL-36α對銀屑病小鼠皮膚病變的影響及其作用機制

朱超英1，2，溫炬1，李婷1，趙琪楠1，秦思1

(1 南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省第二人民醫(yī)院，廣州510317；2南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院)

目的 探討白細(xì)胞介素36α(IL-36α)對銀屑病小鼠皮膚病變的影響及其作用機制。方法 將30只雌性小鼠隨機分為對照組、模型組及觀察組，每組10只。模型組及觀察組于背部裸露皮膚處涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，對照組涂抹等量凡士林乳膏，1次/d，連續(xù)8天。觀察組隔日皮下注射IL-36α 5 μg，對照組、模型組注射等量PBS，共注射4次。評估各組建模第1～8天銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評分(PASI評分)。建模第8天處死，測量表皮垂直厚度，分別采用實時熒光定量PCR法、Western blotting法檢測皮膚組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和IL-36α mRNA和蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果 隨建模時間延長，模型組和觀察組PASI評分逐漸升高(P均<0.05)。觀察組、模型組建模第5天開始PASI評分明顯升高，以觀察組升高更明顯(P均<0.05)。觀察組表皮垂直厚度為(98.519±3.442)μm，模型組為(68.383±2.499)μm，對照組為(9.804±1.682)μm，組間兩兩比較P均<0.05。觀察組、模型組和對照組皮膚組織VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相對表達(dá)量依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。結(jié)論 IL-36α可加重銀屑病小鼠皮膚病變，其機制可能與促進VEGF表達(dá)有關(guān)。

銀屑??；白細(xì)胞介素36α；血管內(nèi)皮生長因子

銀屑病屬于慢性炎癥性增生性皮膚病之一，主要組織病理學(xué)改變?yōu)樾律苄纬?、角質(zhì)形成、細(xì)胞過度增生及炎癥細(xì)胞浸潤等[1]。白細(xì)胞介素36(IL-36)是一種新型促炎性因子，屬于IL-1家族，由3個生物學(xué)功能相似的分子(IL-36α、IL-36β及IL-36γ)組成。IL-36受體(IL-36R)主要表達(dá)于皮膚組織，IL-36與其受體結(jié)合后激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB，在銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等疾病的發(fā)生中具有重要作用[2～5]。目前，關(guān)于IL-36α在銀屑病發(fā)病中的作用及其機制尚不完全明了。為此，我們于2016年2～8月進行如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雌性BALB/c小鼠30只，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～24 ℃，光照12 h明暗交替，自由攝食飲水。5%咪喹莫特乳膏(美國3M公司)，凡士林乳膏(河北蘭煉飛天石化有限公司)，IL-36α(美國R&D公司)，Anti-VEGFA抗體(美國Abcam公司)，ECL顯色液及DAB顯色液(杭州弗德生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(美國DBI公司)；多功能酶標(biāo)儀(上海現(xiàn)科分光儀器有限公司)，實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 銀屑病模型建立及干預(yù) 將30只小鼠隨機分為對照組、模型組及觀察組，每組10只，單籠飼養(yǎng)。各組背部剃毛，裸露皮膚，面積約2 cm×3 cm。模型組及觀察組于裸露皮膚處涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，對照組涂抹等量凡士林乳膏，1次/d，連續(xù)8天。觀察組隔日皮下注射IL-36α 5 μg，對照組、模型組注射等量PBS，共注射4次。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評分(PASI評分) 觀察各組建模第1～8天皮膚變化并行PASI評分。PASI評分標(biāo)準(zhǔn)包括紅斑、鱗屑及浸潤增厚3個項目，每個項目共4分，無為0分、輕度為1分、中度為2分、重度為3分、極重度為4分，總分12分。PASI評分越高說明銀屑病皮損越嚴(yán)重[6]。

1.3.2 皮膚組織病理學(xué)變化及表皮厚度 各組于建模第8天采用頸椎脫臼法處死，取背部皮損面積約1 cm×1 cm，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片。常規(guī)HE染色，100倍顯微鏡下觀察皮損增厚程度、炎癥細(xì)胞浸潤情況等。同時，測量表皮垂直厚度。

1.3.3 皮膚組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和IL-36α mRNA表達(dá) 采用實時熒光定量PCR法。取凍存皮膚組織，TRIzol法提取組織總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄。采用實時熒光定量PCR儀進行擴增。引物序列：VEGF上游引物：5′-GTCTGTGCTCTGGGATTTG-3′，下游引物：5′-ATTTCCACAATCCGAAGTGA-3′；IL-36α上游引物：5′-ACCTCTACATTTGAGTCTGC-3′，下游引物：5′-GATGAAGATTTCCCCCAGTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。擴增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共45個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算VEGF和IL-36α mRNA相對表達(dá)量。

1.3.4 皮膚組織IL-36α蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。取凍存皮膚組織，RIPA裂解，提取皮膚組織蛋白，BCA法進行蛋白定量。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE，然后將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至NC膜，用含3%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶20 000)室溫孵育1 h，ECL顯色。采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶的光密度(OD)值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白OD值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3.5 皮膚組織VEGF蛋白表達(dá) ①Western blotting法。參照1.3.4的方法檢測VEGF蛋白相對表達(dá)量。②免疫組化法。皮膚組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，抗原修復(fù)，加入一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)4 ℃孵育50 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，同步設(shè)立陰性對照。以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡棕色、淡褐色、棕色、棕褐色以及褐色顆粒為陽性染色。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比及染色強度綜合評分。陽性細(xì)胞百分比：0～5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強度：無著色為0分，淡褐色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。兩項評分相加≥1分為陽性。

2 結(jié)果

2.1 各組皮膚變化及PASI評分比較 對照組背部皮膚正常，無明顯變化。隨著建模時間延長，模型組和觀察組逐漸出現(xiàn)紅斑、增厚、鱗屑；模型組建模第7、8天出現(xiàn)典型銀屑病樣改變，第8天部分出現(xiàn)脫屑；觀察組建模第4～8天開始出現(xiàn)典型銀屑病樣改變，其紅斑、鱗屑、增厚表現(xiàn)均較模型組嚴(yán)重。各組建模第1、2天PASI評分均為0分；隨建模時間延長，觀察組及模型組PASI評分逐漸升高(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組、模型組建模第5天開始PASI評分均升高，但觀察組升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 各組建模第3～8天PASI評分比較

注：與對照組同時間比較，*P<0.05；與模型組同時間比較，#P<0.05。

2.2 各組皮膚組織病理學(xué)變化及表皮厚度比較 對照組皮膚未見明顯異常。模型組呈銀屑病樣改變，表皮明顯增厚，可見鱗屑、角化不全及Muro微膿腫，棘層增厚明顯，表皮突延長。觀察組各層變化及炎癥細(xì)胞浸潤均較模型組明顯。見插頁Ⅰ圖3。觀察組表皮垂直厚度為(98.519±3.442)μm，模型組為(68.383±2.499)μm，對照組為(9.804±1.682)μm，組間兩兩比較P均<0.05。

2.3 各組皮膚組織VEGF及IL-36α表達(dá)比較 觀察組、模型組和對照組皮膚組織VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相對表達(dá)量均依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。見表2。

表2 各組皮膚組織VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05。

2.4 各組皮膚組織VEGF蛋白表達(dá)比較 見插頁Ⅰ圖4。免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組VEGF僅少量表達(dá)，在真皮乳頭微血管輕度染色，呈淡褐色；模型組著色細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量顯著增多，VEGF顯著染色，主要表達(dá)于表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈褐色；觀察組著色細(xì)胞數(shù)量多于模型組，VEGF染色呈深褐色，主要表達(dá)于表皮層及血管內(nèi)皮細(xì)胞。觀察組、模型組和對照組皮膚組織VEGF 陽性表達(dá)率分別為100%、100%、10%。觀察組、模型組明顯高于對照組(P均<0.05)。

3 討論

多項研究表明，IL-36與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)[7～10]。銀屑病發(fā)病過程中表皮角質(zhì)形成細(xì)胞加強了VEGF的自我表達(dá)，并通過一系列信號傳導(dǎo)，促進血管通透性增加及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，最終形成新生血管。朱凡等[11]研究表明，由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的VEGF對銀屑病皮損部血管異常起著決定性作用。Towne等[2]研究認(rèn)為，IL-36可促進角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF。既往研究表明，IL-17可促進角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF，而IL-36又可促進角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-17[12]，這間接提示IL-36可促進VEGF分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1家族中的IL-1及IL-33可促進VEGF分泌[13]，而IL-36也屬于IL-1家族，進一步提示IL-36可促進VEGF分泌。

咪喹莫特是一種免疫激活劑，通過激活Toll樣受體刺激小鼠產(chǎn)生銀屑病樣皮損，并已廣泛用于銀屑病動物模型的建立[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組與觀察組在背部涂抹咪喹莫特后逐漸出現(xiàn)紅斑、鱗屑、增厚現(xiàn)象，伴有角質(zhì)層、棘細(xì)胞層的增厚以及顆粒層消失，而對照組未見明顯異常，表明銀屑病小鼠建模成功。既往研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射IL-36α的小鼠背部皮膚可出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤[9]，而氣管內(nèi)灌注IL-36α的小鼠肺部可出現(xiàn)大量的趨化因子、腫瘤壞死因子等炎癥因子浸潤[15]。本研究結(jié)果顯示，觀察組較模型組皮膚炎癥反應(yīng)更為嚴(yán)重，且觀察組、模型組和對照組IL-36α mRNA和蛋白相對表達(dá)量依次降低，表明IL-36α可加重銀屑病小鼠的皮膚炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組與觀察組VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量均明顯升高，而觀察組升高更明顯，表明IL-36α可促進VEGF表達(dá)。另外，免疫組化結(jié)果顯示，對照組表皮層幾乎不表達(dá)VEGF，僅在真皮乳頭層微血管處低表達(dá)，呈淡褐色；而模型組與觀察組著色細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量較對照組增多，VEGF表達(dá)于表皮層及真皮層，且觀察組著色細(xì)胞數(shù)量多于模型組，呈深棕褐色；且觀察組與模型組VEGF陽性表達(dá)率明顯高于對照組，進一步證實IL-36α可促進VEGF的表達(dá)。

綜上所述，IL-36α可加重銀屑病小鼠皮膚病變，其機制可能與促進VEGF的表達(dá)有關(guān)。

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廣東省中醫(yī)藥局基金資助項目(20141008)。

溫炬(E-mail： gdwenju@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.010

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A

1002- 266X(2017)28- 0037- 03

2016- 09- 03)