經(jīng)尿道灌注干細(xì)胞白血病重組基因慢病毒對(duì)糖尿病膀胱病變豚鼠膀胱功能的影響

余運(yùn)運(yùn)，王勤章，王子雄，錢彪，丁國(guó)富，徐浩，張思源

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

·基礎(chǔ)研究·

經(jīng)尿道灌注干細(xì)胞白血病重組基因慢病毒對(duì)糖尿病膀胱病變豚鼠膀胱功能的影響

余運(yùn)運(yùn)，王勤章，王子雄，錢彪，丁國(guó)富，徐浩，張思源

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

目的 探討經(jīng)尿道灌注干細(xì)胞白血病重組(SCL)基因慢病毒對(duì)糖尿病膀胱病變(DCP)豚鼠膀胱功能的改善作用。方法 采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)法建立豚鼠糖尿病模型，培養(yǎng)12周后建立DCP模型。選取DCP豚鼠20只，隨機(jī)分為模型組、SCL組各10只。取未造模的10只作為對(duì)照組。各組麻醉后經(jīng)尿道插入自制尿管，排空尿液，對(duì)照組和模型組均經(jīng)尿管灌注PBS液0.2 mL，SCL組經(jīng)尿管灌注最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的SCL基因慢病毒0.2 mL(2×107IU)。灌注后結(jié)扎尿管，保留膀胱灌注液2 h。灌注后28 d時(shí)用代謝籠收集三組24 h尿量；行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，于膀胱排尿后即刻測(cè)殘余尿量、最大膀胱容量、排尿期最大逼尿肌壓、單次排尿周期灌注量、膀胱順應(yīng)性。切除完整膀胱，排盡尿液后稱量膀胱濕重。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組和SCL組24 h尿量、膀胱濕重、最大膀胱容量、殘余尿量均增加，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性均降低(P均<0.05)；與模型組相比，SCL組24 h尿量、膀胱濕重、最大膀胱容量、殘余尿量均降低，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性均增加(P均<0.05)。結(jié)論 經(jīng)尿道灌注SCL慢病毒能夠顯著改善DCP豚鼠的膀胱功能，為治療DCP提供了新的途徑與方法。

糖尿病膀胱病變；慢病毒；干細(xì)胞白血病基因；膀胱功能；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；豚鼠

糖尿病膀胱病變(DCP)是糖尿病導(dǎo)致的泌尿系統(tǒng)慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率占糖尿病患者的25%～85%[1]。其臨床特征表現(xiàn)為膀胱充盈功能受損，膀胱容量增大，收縮功能降低和殘余尿量增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制包括神經(jīng)功能障礙、逼尿肌功能改變和膀胱上皮功能障礙等，是多因素共同作用的結(jié)果[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，膀胱逼尿肌存在一種類似胃腸道的Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)，命名為膀胱ICC細(xì)胞，并推測(cè)該細(xì)胞就是膀胱的起搏細(xì)胞，能夠調(diào)控逼尿肌的收縮。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境導(dǎo)致的膀胱內(nèi)ICC細(xì)胞功能受損和數(shù)量減少是DCP的發(fā)病機(jī)制之一[4]。膀胱ICC細(xì)胞能夠特異性表達(dá)酪氨酸蛋白激酶生長(zhǎng)因子受體(c-kit)，c-kit 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在干細(xì)胞白血病基因(SCL)結(jié)合位點(diǎn)，SCL能夠通過c-kit基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)c-kit表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，SCL過表達(dá)能上調(diào)c-kit的表達(dá)[5]。但目前，對(duì)于SCL在DCP治療中的作用尚無明確認(rèn)識(shí)。2016年2～8月，我們對(duì)DCP豚鼠經(jīng)尿道灌注SCL基因重組慢病毒，探討其對(duì)DCP膀胱功能的改善作用，為臨床治療DCP奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 普通級(jí)荷蘭種健康雄性豚鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量250～350 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；檸檬酸與檸檬酸鈉(上?；ぴ噭┕?；烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；血糖儀及試紙(美國(guó)強(qiáng)生公司)；SCL慢病毒(上海吉?jiǎng)P恩公司)；尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)儀(加拿大Laborie公司)；大小鼠代謝籠(型號(hào)B6-10，江蘇蘇州市蘇杭科技器材有限公司)；眼科手術(shù)剪；自制豚鼠用尿管(由麻醉用的硬膜外導(dǎo)管改良而成，每次使用前后消毒滅菌)。

1.2 SCL基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及重組慢病毒的包裝 對(duì) SCL基因質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，上游引物序列為 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCGAGCGGCCGCCGAG-3′，下游引物序列為5′-TCACCATGGTGGCGACCGGCCGAGGGCCGGCTC-CATC-3′。將人SCL基因質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物提純，通過In-Fusion轉(zhuǎn)換酶的催化作用將人SCL基因質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物與GV287-EGF結(jié)合，形成重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL，即含人SCL基因慢病毒載體。提取重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆菌落PCG模板上的交換轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，直至長(zhǎng)出菌落后加入到10 μL培養(yǎng)基混勻，抽取1 μL混合物設(shè)置模板，通過PCF法進(jìn)行基因擴(kuò)增，與陽性轉(zhuǎn)化子對(duì)接后分裝測(cè)序。以293T細(xì)胞為包裝細(xì)胞，制備編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及2種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，3種質(zhì)粒分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素提純，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集含人SCL基因慢病毒載體的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高低度的含人SCL基因慢病毒載體濃縮液，熒光法在293T細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度為2×108IU。

1.3 動(dòng)物模型制備及分組方法 60只豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取50只，禁食12 h后按200 mg/kg單次腹腔注射1%的STZ(0.1 mol/L、pH 4.4的枸櫞酸緩沖液)制備糖尿病模型。全價(jià)飼養(yǎng)6周后剪耳法檢測(cè)隨機(jī)血糖，以隨機(jī)血糖連續(xù)4周≥16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功。糖尿病模型誘導(dǎo)成功后繼續(xù)全價(jià)飼養(yǎng)6周，參考糖尿病豚鼠DCP標(biāo)準(zhǔn)[6,7]，STZ單次腹腔注射12周后88. 89%的糖尿病豚鼠發(fā)生DCP病變，建立較為可靠的DCP動(dòng)物模型。選取DCP豚鼠20只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、SCL組各10只。未造模的10只作為對(duì)照組，給予等量的枸櫞酸緩沖液?jiǎn)未胃骨蛔⑸洹?/p>

1.4 SCL基因慢病毒轉(zhuǎn)染方法 各組禁食水6 h，200 g/L烏拉坦1.5 g/kg麻醉后經(jīng)尿道插入自制尿管，排空尿液。對(duì)照組和模型組均經(jīng)尿管灌注PBS液0.2 mL，SCL組灌注最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的SCL基因慢病毒0.2 mL(2×107IU)[8]。灌注后結(jié)扎尿管，保留膀胱灌注液2 h。

1.5 24 h尿量、膀胱濕重檢測(cè) 慢病毒灌注后28 d時(shí),用代謝籠收集三組豚鼠24 h尿量；在尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，切除完整膀胱，排盡尿液后稱量膀胱濕重。

1.6 尿動(dòng)力學(xué)檢查 烏拉坦麻醉生效后，仰臥固定，碘伏消毒下腹部，恥骨上作切口顯露膀胱。兩個(gè)41/2號(hào)留置針分別自膀胱頂刺入，其中一個(gè)與微量泵相連，另一個(gè)與尿動(dòng)儀壓力感受器相連，結(jié)扎兩側(cè)輸尿管。37 ℃生理鹽水以0.25 mL/min的速度進(jìn)行膀胱灌注，進(jìn)行充盈性膀胱測(cè)壓。連續(xù)記錄10個(gè)排尿周期，待膀胱排尿后即刻測(cè)殘余尿量。最大膀胱容量為單次充盈周期膀胱灌注量與殘余尿量之和。排尿期最大逼尿肌壓及單次排尿周期灌注量均取10個(gè)排尿周期中各指標(biāo)的均值。膀胱順應(yīng)性為單次充盈周期膀胱灌注量與充盈期膀胱內(nèi)壓力變化的比值。以上各項(xiàng)參數(shù)均取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組24 h尿量及膀胱濕重比較 與對(duì)照組比較，模型組和SCL組24 h尿量及膀胱濕重均增加(P均<0.05)；與模型組比較，SCL組24 h尿量及膀胱濕重均降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組24 h尿量、膀胱濕重比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 各組尿動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 與對(duì)照組比較，模型組和SCL組最大膀胱容量、殘余尿量均增加，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性均降低(P均<0.05)。與模型組比較，SCL組最大膀胱容量、殘余尿量均降低，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性均增加(P均<0.05)。見表2。

表2 各組尿動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

DCP是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，其進(jìn)展呈隱匿性，在糖尿病早期即可發(fā)生，隨著病程的延長(zhǎng)膀胱功能損傷進(jìn)行性加重[9,10]。Satriano等[11]研究認(rèn)為，DCP膀胱肥大可能是尿量增多的適應(yīng)性結(jié)果。而殘余尿量增多與逼尿肌和膀胱順應(yīng)性降低有關(guān)，表明膀胱逼尿肌收縮和舒張功能受損是膀胱失代償?shù)慕Y(jié)果。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組24 h尿量及膀胱濕重均增加，考慮為糖尿病利尿狀態(tài)下，膀胱代償性增生所致，長(zhǎng)期進(jìn)展導(dǎo)致膀胱出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能損害；與對(duì)照組比較，模型組最大膀胱容量、殘余尿量均增加，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性均降低，提示DCP豚鼠出現(xiàn)膀胱功能受損，表現(xiàn)為最大膀胱容量、殘余尿量明顯增加，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性降低。

研究發(fā)現(xiàn)，膀胱ICC細(xì)胞具有維持逼尿肌的起搏功能和膀胱張力、協(xié)調(diào)逼尿肌運(yùn)動(dòng)功能[12,13]。ICC細(xì)胞在被抑制的情況下，膀胱逼尿肌收縮功能明顯下降。ICC細(xì)胞膜上c-kit與其配體干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合后可啟動(dòng)SCF/c-kit信號(hào)通路，該信號(hào)通路在維持ICC細(xì)胞表型和功能中具有重要作用[14]。DCP患者膀胱內(nèi)ICC細(xì)胞SCF/c-kit信號(hào)傳導(dǎo)受阻，可導(dǎo)致ICC細(xì)胞功能受損、數(shù)量減少或消失。而SCL基因是c-kit上游重要的調(diào)控基因，能夠作用于c-kit基因的啟動(dòng)子，具有強(qiáng)烈的促進(jìn)c-kit表達(dá)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SCL 過表達(dá)可使 c-kit 表達(dá)升高，并對(duì)SCF 反應(yīng)性恢復(fù)正常，修復(fù)受損的SCF/c-kit信號(hào)通路[15]。于建超等[16]通過SCL基因重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)染了體外培養(yǎng)的豚鼠膀胱ICC，并成功介導(dǎo)SCL在ICC中的表達(dá)。周建民等[17]以腺病毒為載體，將SCL基因?qū)塍w外高糖環(huán)境培養(yǎng)的ICC，成功上調(diào)c-kit mRNA和蛋白的表達(dá)，顯著改善了ICC的形態(tài)以及功能損害，提示通過促進(jìn)DCP膀胱中ICC細(xì)胞表型和功能的恢復(fù)，進(jìn)而改善膀胱功能是可行的。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，SCL組24 h尿量及膀胱濕重均降低，最大膀胱容量、殘余尿量均減少，最大逼尿肌壓、膀胱順應(yīng)性均增加，提示SCL組豚鼠排尿效率顯著提高，膀胱功能得到一定程度的改善，表明SCL基因重組慢病毒能夠改善DCP豚鼠的膀胱功能。其作用機(jī)制可能與上調(diào)c-kit表達(dá)，逆轉(zhuǎn)SCF/c-kit信號(hào)通路相關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)DCP膀胱中ICC細(xì)胞表型和功能的恢復(fù)。

基因治療是DNA或RNA水平上人為地將某些外源性的基因?qū)胂鄳?yīng)的靶細(xì)胞，從而獲得表達(dá)繼而產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng),以達(dá)到治療的目的[18]。腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒以及非病毒載體等均可將目的基因整合至靶細(xì)胞，其中以慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率最高、容量大，能夠感染原代細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，保證轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，且無病毒蛋白的表達(dá)，自身免疫反應(yīng)小，應(yīng)用越來越廣泛。傳統(tǒng)的基因治療多通過血管導(dǎo)入基因載體，這樣基因載體可通過血流分布至全身，造成一定程度的浪費(fèi)，且安全性差。近年來，通過膀胱灌注途徑進(jìn)行基因治療泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤已在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。研究[8]表明，通過尿道將腺病毒等基因載體灌入小鼠膀胱內(nèi)后，膀胱腫瘤細(xì)胞內(nèi)能夠檢測(cè)到目的基因的蛋白產(chǎn)物，且未發(fā)現(xiàn)在肝、肺等其他組織表達(dá)，因此本研究構(gòu)建的SCL基因重組慢病毒經(jīng)由尿道途徑灌注入膀胱內(nèi)，可在保證較高轉(zhuǎn)染率的同時(shí),避免肝、腎等其他部位的毒性反應(yīng)，也減少慢病毒的浪費(fèi)。

綜上所述，經(jīng)尿道灌注將SCL基因慢病毒轉(zhuǎn)染豚鼠DCP膀胱后，能夠顯著改善DCP豚鼠的膀胱功能，為治療DCP提供了新的途徑與方法。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81360120)。

王勤章(E-mail: wqz1969@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.008

R587.2

A

1002-266X(2017)30-0030-03

2017-03-12)