尼羅紅熒光光譜法快速測(cè)定解脂耶氏酵母油脂含量的研究

高 山,劉相岑,朱晨光,史吉平,張保國(guó),*

(1.上海大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

尼羅紅熒光光譜法快速測(cè)定解脂耶氏酵母油脂含量的研究

高 山1,2,劉相岑1,2,朱晨光1,*,史吉平2,張保國(guó)2,*

(1.上海大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

為了建立快速簡(jiǎn)便檢測(cè)解脂耶氏酵母油脂含量的方法,探討了尼羅紅-光譜法測(cè)定解脂耶氏酵母油脂含量的檢測(cè)條件。通過(guò)研究解脂耶氏酵母最佳發(fā)射光波長(zhǎng)、細(xì)胞密度、尼羅紅染液用量、染色時(shí)間、不同助溶劑效能及最佳體積分?jǐn)?shù)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響,確定了最佳檢測(cè)條件,得到細(xì)胞油脂含量與熒光強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系。解脂耶氏酵母在激發(fā)光560 nm、發(fā)射光650 nm處有最高熒光值,每毫升菌液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 mg/mL的尼羅紅染液20 μL,加入體積分?jǐn)?shù)為15%的異丙醇,黑暗染色5 min,在細(xì)胞OD600=0～1.3的范圍內(nèi),菌液的油脂含量(X)與熒光值(Y)呈較好的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性關(guān)系式為Y=6.3651X+10.097,R2=0.9902,靈敏度達(dá)0.0001 g。該方法能夠準(zhǔn)確地反映出解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂含量。尼羅紅-熒光法可成為一種快速檢測(cè)解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂含量的新方法。

解脂耶氏酵母,油脂含量,尼羅紅,熒光光譜法

自然界中存在多種產(chǎn)油微生物。由于種類(lèi)、營(yíng)養(yǎng)條件及生長(zhǎng)環(huán)境等原因,微生物儲(chǔ)存的油脂可占其生物量干重的20%～80%,一般將這種菌類(lèi)稱(chēng)為產(chǎn)油微生物,包括細(xì)菌、酵母、霉菌以及藻類(lèi)等[1-3]。這些微生物生產(chǎn)的油脂富含花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)等,具有重要生理功能。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一種油脂含量很高的真菌酵母[4-5],通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基可使細(xì)胞濃度達(dá)到100 g DCW/L[6],其工業(yè)化產(chǎn)物也可直接用于奶酪、肉類(lèi)等乳制品的加工[7]。因此,對(duì)解脂耶氏酵母油脂含量快速、準(zhǔn)確的測(cè)定就顯得尤其必要。目前,對(duì)微生物油脂含量檢測(cè)的主要方法有傳統(tǒng)的有機(jī)試劑稱(chēng)重法[8]和酸水解法[9]。這兩種方法對(duì)材料的需求量大,檢測(cè)效率低,過(guò)程繁瑣,存在一定的安全隱患并且無(wú)法應(yīng)用于高通量分析[8]。

尼羅紅(9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one)是一類(lèi)苯吩啞嗪酮類(lèi)化合物,在有機(jī)或疏水的環(huán)境下,有光穩(wěn)定性和熒光性。尼羅紅不溶于水,能夠與脂類(lèi)物質(zhì)(甘油酯、磷脂、蠟以及各種脂肪酸)結(jié)合發(fā)出很強(qiáng)的熒光,尼羅紅在水中能夠很快地發(fā)生熒光猝滅,所以多余的尼羅紅染料在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需要清除掉[10]。尼羅紅的這些特性可應(yīng)用于很多實(shí)驗(yàn),如通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪滴的數(shù)量大小對(duì)胞內(nèi)脂肪含量進(jìn)行定量測(cè)定[11],尼羅紅染色與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合對(duì)不同脂肪含量的細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)收集等。而且,尼羅紅與蘇丹黑染料、尼羅藍(lán)-A等染料相比,能夠更加準(zhǔn)確地將胞內(nèi)脂類(lèi)與其他物質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)[12]。因此,尼羅紅染色法可檢測(cè)動(dòng)物及微生物細(xì)胞內(nèi)的油脂含量,其準(zhǔn)確性也在很多微生物的油脂含量測(cè)定中得到驗(yàn)證[13-15]。但是,由于菌種差異及檢測(cè)樣品中油脂種類(lèi)含量的不同,無(wú)法建立一套適合大多數(shù)微生物的油脂檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[16],而只能根據(jù)具體的菌種探索特定的檢測(cè)條件[17]。

目前,還尚未有關(guān)于解脂耶氏酵母的熒光油脂檢測(cè)的分析報(bào)道。為了建立適合于解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂測(cè)定的尼羅紅熒光染色檢測(cè)法,本文以解脂耶氏酵母作為研究對(duì)象,以酶標(biāo)儀作為熒光強(qiáng)度檢測(cè)儀器,獲取二甲基亞砜(DMSO)等助溶劑、尼羅紅染色劑用量、染色時(shí)間、染色溫度對(duì)尼羅紅熒光染色法測(cè)定解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂含量的影響,以期建立一種快速檢測(cè)解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解脂耶氏酵母野生型菌株(Yarrowialipolytica)ATCC20362 美國(guó)菌種保藏中心,本實(shí)驗(yàn)室保存;葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、二甲基亞砜(DMSO)化學(xué)試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司;YNB 美國(guó)Sigma Aldrich公司;尼羅紅(Nile Red,NR) 上海生工公司?；A(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母提取物10 g,定容到1 L,pH6.0;產(chǎn)油培養(yǎng)基 葡萄糖90 g,YNB 1.5 g,硫酸銨2 g,酵母提取物1 g,定容到1 L,pH6.0;磷酸鹽緩沖液(PBS) 磷酸二氫鉀0.68 g,0.1 mol/L氫氧化鈉溶液15.2 mL,定容至100 mL,pH6.5;尼羅紅染液 稱(chēng)取1 mg尼羅紅粉末添加到10 mL丙酮中溶解,即得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的尼羅紅染液。

Centrifuge5430低溫離心機(jī) 德國(guó)eppendorf公司;BSA224S-CW電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;MLS-3780高溫蒸汽滅菌器 日本三洋公司;Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)公司;HWS-12數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一恒公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)與發(fā)酵 將解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica(ATCC20362)從斜面培養(yǎng)基上接種到基礎(chǔ)平板上,28 ℃培養(yǎng)2～3 d,待形成較大的橢圓型菌落并且菌落表面尚未出現(xiàn)褶皺時(shí),用接種環(huán)挑取基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中解脂耶氏酵母單菌落于含有50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在30 ℃、200 r/min條件下恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)約40 h,通過(guò)測(cè)定菌體OD600數(shù)值確定菌體生長(zhǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期。

按10%的接種量將長(zhǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)接于含100 mL產(chǎn)油培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,在30 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵3 d左右,此時(shí)菌體OD600值達(dá)到最大。

1.2.2 稱(chēng)重法測(cè)定油脂含量 取適量發(fā)酵液,8000 r/min離心5 min,沉淀用無(wú)菌去離子水清洗三遍,置于105 ℃烘箱中烘干至恒重后研磨成粉末狀。稱(chēng)取100 mg菌粉,加入4 mL甲醇、2 mL氯仿和0.4 mL去離子水,充分混勻。加入2 mL氯仿和2 mL去離子水,2000 r/min離心10 min后,抽取下層的脂質(zhì)層于烘干至恒重(W0)的離心管中,再加入4 mL甲醇-氯仿(體積比1∶1)混合液反復(fù)抽提3～5次,合并所有脂質(zhì)層并將離心管置于105 ℃烘箱中烘干至恒重(W1)。

解脂耶氏酵母油脂含量計(jì)算公式:

油脂含量(%)=(W1-W0)/100 mg×100

式(1)

1.2.3 尼羅紅熒光染色法測(cè)定油脂含量 取10 mL發(fā)酵液8000 r/min離心5 min,去除上清,菌體沉淀用PBS緩沖液清洗三次,棄上清液,用PBS緩沖液重懸菌體至合適濃度(OD600=1)。每1 mL酵母細(xì)胞重懸液加一定量的尼羅紅染液(0.1 mg/mL),快速震蕩混勻后,放置于恒溫水浴鍋30 ℃暗處中染色。用移液槍吸取200 μL準(zhǔn)確加入到96微孔板中,每個(gè)樣品做3個(gè)平行。選用Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀對(duì)96微孔板中樣品進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定,相對(duì)熒光強(qiáng)度(N)為添加尼羅紅樣品的熒光強(qiáng)度值(N1)減去未添加尼羅紅樣品熒光強(qiáng)度值(N0)。

相對(duì)熒光強(qiáng)度(N)=N1-N0

式(2)

1.2.4 解脂耶氏酵母最佳發(fā)射光波長(zhǎng)的選擇 選擇多功能酶標(biāo)儀的熒光測(cè)定功能,對(duì)解脂耶氏酵母染色與未染色細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)。檢測(cè)條件為:菌懸液稀釋到一定密度(OD600=1),用10 μL尼羅紅染液(0.1 mg/mL)進(jìn)行染色,染色時(shí)間為10 min,激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm,發(fā)射波長(zhǎng)在400～800 nm范圍內(nèi)每隔10 nm進(jìn)行一次熒光值檢測(cè),確定最佳發(fā)射光波長(zhǎng)檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.5 細(xì)胞密度對(duì)染色的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的酵母細(xì)胞,用PBS緩沖液清洗去除培養(yǎng)基殘?jiān)z測(cè)條件為:用10 μL尼羅紅染液(0.1 mg/mL)進(jìn)行染色,染色時(shí)間為10 min,激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為650 nm,考察不同密度(以O(shè)D600表征,OD600=0.1～2.0)的細(xì)胞懸液對(duì)染色的影響。

1.2.6 尼羅紅染液用量對(duì)細(xì)胞染色的影響 取解脂耶氏酵母細(xì)胞,用PBS緩沖液清洗。檢測(cè)條件為:菌懸液稀釋到一定密度(OD600=1),加入不同體積的尼羅紅染液(0.1 mg/mL),染色時(shí)間為10 min,激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)650 nm,考察不同的尼羅紅染液用量對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度值的影響。

1.2.7 染色時(shí)間對(duì)細(xì)胞染色的影響 取解脂耶氏酵母細(xì)胞,用PBS緩沖液清洗。檢測(cè)條件為:菌懸液稀釋到一定密度(OD600=1),加入20 μL尼羅紅染液(0.1 mg/mL),激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)650 nm,考察不同染色時(shí)間(0～20 min)對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度值的影響。

1.2.8 不同助溶劑對(duì)細(xì)胞染色的影響 取解脂耶氏酵母細(xì)胞,用PBS緩沖液清洗。檢測(cè)條件為:菌懸液稀釋到一定密度(OD600=1),加入20 μL尼羅紅染液(0.1 mg/mL),染色時(shí)間為5 min,激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)650 nm,考察不同體積分?jǐn)?shù)(0～40%)的助溶劑甲醇、異丙醇、丙酮和DMSO對(duì)細(xì)胞熒光值的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖,采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析(oneway ANOVA),顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 解脂耶氏酵母最佳發(fā)射光波長(zhǎng)的選擇

由圖1和圖2可知,無(wú)論細(xì)胞是否染色,在發(fā)射波長(zhǎng)540～590 nm處都有極大的發(fā)射光熒光值,這可能是來(lái)自96孔微板的背景干擾[11]。而在發(fā)射光波長(zhǎng)為600～700 nm范圍內(nèi),經(jīng)尼羅紅染色的細(xì)胞能夠發(fā)出較強(qiáng)的熒光,并且在650 nm處有最大熒光強(qiáng)度。而未染色的細(xì)胞則基本不發(fā)出熒光。從圖3中染色與未染色細(xì)胞熒光強(qiáng)度值的對(duì)比可以看出,激發(fā)光波長(zhǎng)560 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)650 nm時(shí)解脂耶氏酵母有最大的熒光值,表明該激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 解脂耶氏酵母未染色細(xì)胞在發(fā)射光400～800 nm處的熒光強(qiáng)度值Fig.1 Fluorescence intensity of unstained Yarrowia lipolytica cell at emission 400～800 nm

圖2 解脂耶氏酵母染色細(xì)胞在發(fā)射光400～800 nm處的熒光強(qiáng)度值Fig.2 Fluorescence intensity of stained Yarrowia lipolytica cell at emission 400～800 nm

圖3 解脂耶氏酵母染色與未染色細(xì)胞在發(fā)射光400～800 nm處的熒光強(qiáng)度值對(duì)比Fig.3 The comparison of stained and unstained Yarrowia lipolytica cell fluorescence intensity at emission 400～800 nm

2.2 細(xì)胞密度對(duì)染色的影響

由圖4可得,不同細(xì)胞濃度下的酵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度值隨密度增大而增大,但在不同濃度值區(qū)域,有不同的線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果顯示,兩者只在OD600<1.3的范圍內(nèi)才有較好的線(xiàn)性相關(guān)性。當(dāng)細(xì)胞OD600≥1.3時(shí)呈其他線(xiàn)性關(guān)系,并且熒光值逐漸趨于穩(wěn)定,可能的原因是當(dāng)脂類(lèi)物質(zhì)增多時(shí),尼羅紅無(wú)法與多余的脂質(zhì)結(jié)合,導(dǎo)致熒光值無(wú)法增大。

圖4 不同OD600值對(duì)尼羅紅染色酵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of different OD600on the yeast cell fluorescence intensity

對(duì)細(xì)胞OD600=0～1.3范圍的熒光值與細(xì)胞OD600值做相關(guān)性線(xiàn)性回歸分析。由圖5可得出,在酵母細(xì)胞OD600=0～1.3時(shí),熒光值與細(xì)胞OD600值呈較好的線(xiàn)性關(guān)系(R2=0.9971)。由此可知,用尼羅紅染液對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行油脂染色實(shí)驗(yàn)時(shí),酵母細(xì)胞菌懸液的密度應(yīng)控制在OD600<1.3的范圍內(nèi)。否則測(cè)得的熒光值不準(zhǔn)確。對(duì)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的酵母細(xì)胞,其OD600可達(dá)到近30,所以在測(cè)定熒光值時(shí),需對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行稀釋至合適OD600值。

圖5 細(xì)胞OD600值與熒光強(qiáng)度值的相關(guān)性Fig.5 The correlation between the OD600and the fluorescence intensity

2.3 尼羅紅染液用量對(duì)細(xì)胞染色的影響

圖6顯示,當(dāng)尼羅紅染液用量為0～20 μL時(shí),細(xì)胞熒光強(qiáng)度值隨著尼羅紅染液用量的增加而增加,這是因?yàn)槟崃_紅染液未將全部的脂肪滴染色,細(xì)胞內(nèi)還存在未被染色的脂肪滴。尼羅紅染液用量為20～30 μL時(shí),熒光強(qiáng)度逐漸減小,可能的原因?yàn)樵谀崃_紅濃度較高時(shí),尼羅紅熒光團(tuán)更易相互碰撞發(fā)生猝滅[21]。在尼羅紅染液用量為20 μL時(shí)熒光強(qiáng)度值達(dá)到最大值。

圖6 不同尼羅紅染液用量對(duì)酵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of different dosage of Nile red dye solution on the yeast cell fluorescence intensity

2.4 染色時(shí)間對(duì)細(xì)胞染色的影響

由圖7所示,染色時(shí)間為0～5 min時(shí),熒光強(qiáng)度值隨著染色時(shí)間延長(zhǎng)而變大,這是由于尼羅紅開(kāi)始進(jìn)入細(xì)胞并與胞內(nèi)脂肪滴結(jié)合發(fā)出熒光,在染色5 min左右熒光值達(dá)到最大。當(dāng)染色時(shí)間為5～30 min時(shí),熒光值隨染色時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減小,可能的原因是尼羅紅染液在PBS緩沖液中不穩(wěn)定易分解,發(fā)生了猝滅現(xiàn)象,如圖8所示。所以,染色5 min時(shí)為最佳染色時(shí)間。

圖7 不同染色時(shí)間對(duì)尼羅紅染色酵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Different dyeing time of Nile red on the effect of yeast cell fluorescence intensity

圖8 尼羅紅染液在PBS緩沖液中的熒光強(qiáng)度值Fig.7 The fluorescence intensity of Nile red dye solution in PBS buffer

2.5 不同助溶劑處理對(duì)染色的影響

很多酵母菌由于菌的種屬不同,其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有所不同,細(xì)胞壁的厚度也有很大的差異[15]。這需要能夠破壞酵母細(xì)胞壁甚至于進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜完整性的物質(zhì),從而讓尼羅紅染液能夠更充分的與細(xì)胞內(nèi)脂類(lèi)物質(zhì)結(jié)合,從而發(fā)出較強(qiáng)的熒光值。

圖9為四種助溶劑對(duì)酵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明,在開(kāi)始增加助溶劑的含量時(shí),都會(huì)使細(xì)胞熒光值增大,原因是各個(gè)助溶劑開(kāi)始破壞酵母細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜的通透性,使尼羅紅染液能夠更充分的與胞內(nèi)脂肪滴結(jié)合發(fā)出熒光。當(dāng)加入助溶劑達(dá)到一定量后,細(xì)胞熒光值反而逐漸減小,可能的原因?yàn)槟崃_紅染液發(fā)生了相互碰撞引起猝滅或者與水結(jié)合失去結(jié)合活性[20]。

各個(gè)助溶劑的最佳體積分?jǐn)?shù)為:甲醇和丙酮皆為10%,異丙醇為15%,DMSO為20%。在酵母細(xì)胞OD600<1.3的范圍內(nèi),加入一定量的助溶劑,再加入20 μL尼羅紅染液,黑暗條件下染色5 min。在激發(fā)光波長(zhǎng)為560 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為650 nm處檢測(cè)熒光值,發(fā)現(xiàn)各助溶劑中對(duì)酵母細(xì)胞壁的破壞效果最強(qiáng)的是異丙醇,其次是DMSO,再次是丙酮,效果最差的為甲醇。DMSO在很多真菌的尼羅紅熒光實(shí)驗(yàn)中都被認(rèn)為是一種較好的助溶劑[18-20]。在本實(shí)驗(yàn)中,DMSO與異丙醇的助溶效果最明顯,異丙醇的助溶效果稍好于DMSO,其原因可能是由于解脂耶氏酵母與其他酵母或者真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)稍有差異,而異丙醇對(duì)解脂耶氏酵母的細(xì)胞壁中脂類(lèi)物質(zhì)和幾丁質(zhì)等多糖的裂解效果更強(qiáng)。

圖9 不同助溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)尼羅紅染色酵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響Fig.9 Effect of different penetrating agents volume fraction on the yeast cell fluorescence intensity

2.6 菌懸液油脂含量與熒光強(qiáng)度值的相關(guān)性

酵母細(xì)胞懸液的油脂含量由1.2.2的傳統(tǒng)稱(chēng)重法測(cè)定,熒光強(qiáng)度值由尼羅紅染液染酵母細(xì)胞胞內(nèi)油脂得到。對(duì)油脂含量(X)和熒光強(qiáng)度值(Y)進(jìn)行回歸分析。

由圖10可得,油脂含量(X)和熒光強(qiáng)度值(Y)之間具有較高的相關(guān)性,回歸方程為Y=6.3651X+10.097,R2=0.9902。結(jié)果表明尼羅紅染色法測(cè)得的熒光值較好地反映了解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂的含量。而且尼羅紅染色法測(cè)得的數(shù)據(jù)偏差小,并且重復(fù)性也較好,經(jīng)數(shù)據(jù)分析該方法的靈敏度可達(dá)0.0001 g。表明尼羅紅染色法不僅測(cè)得的數(shù)據(jù)可靠,而且能夠準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞內(nèi)油脂含量,可以用作解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂含量的快速定量測(cè)定。

圖10 酵母細(xì)胞懸液油脂含量與熒光強(qiáng)度相關(guān)性Fig.10 The correlation between the yeast cell lipids content with the fluorescence intensity

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)解脂耶氏酵母尼羅紅染色測(cè)得的熒光強(qiáng)度值與稱(chēng)重法得到的數(shù)值進(jìn)行對(duì)比分析,表明采用尼羅紅熒光染色法可以定量測(cè)定解脂耶氏酵母所產(chǎn)生的油脂,并且通過(guò)稱(chēng)重法測(cè)得的油脂含量(X)與通過(guò)尼羅紅染色法測(cè)得的熒光強(qiáng)度(Y)之間有較好的線(xiàn)性相關(guān)性,回歸方程為Y=6.3651X+10.097,R2=0.9902。

對(duì)尼羅紅染色法測(cè)定菌液中油脂含量影響的分析,得到的最佳檢測(cè)條件為:酵母細(xì)胞懸液用PBS緩沖液稀釋至OD600<1.3的范圍內(nèi),體積分?jǐn)?shù)為15%的異丙醇作為助溶劑在30 ℃水浴30 min,并加20 μL尼羅紅染液,暗處染色5 min,于激發(fā)光波長(zhǎng)560 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)650 nm處測(cè)定熒光值,根據(jù)得到的熒光值可估算出酵母細(xì)胞的胞內(nèi)油脂含量。

與傳統(tǒng)的稱(chēng)重法相比,尼羅紅染色法具有所需原料少、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)。因此,尼羅紅染色法能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的稱(chēng)重法進(jìn)行解脂耶氏酵母胞內(nèi)油脂含量的定量實(shí)驗(yàn),為酵母油脂含量的快速檢測(cè)提供方法依據(jù)并對(duì)酵母生產(chǎn)油脂實(shí)現(xiàn)工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

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Study on a Nile Red fluorescence spectrometry for rapid lipid determination inYarrowialipolytica

GAO Shan1,2,LIU Xiang-cen1,2,ZHU Chen-guang1,*,SHI Ji-ping2,ZHANG Bao-guo2,*

(1.College of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai 200444,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

In order to establish a rapid lipid determination method inYarrowialipolytica,the determination conditions were studied with the Nile Red fluorescence spectrometry. The optimal determination conditions were confirmed by researching the optimal emission wavelength inYarrowialipolytica,optimal volume fraction,dosage of Nile Red dye solution,dyeing time and efficiency of different penetrating agents,the linearity between lipid content in cell and fluorescence intensity were affirmed.Yarrowialipolyticahad maximum fluorescence value in excitation wavelength 560 nm,emission wavelength 650 nm,20 μL 0.1 mg/mL mass fraction of Nile Red dye solution and 15% volume fraction of isopropanol were added in per milliliter ofYarrowialipolyticasuspension respectively,dyeing time 5 min in darkness,in the range of cell with OD600of 0～1.3,there was a good linear relationship between lipid content(X)of solution and fluorescence intensity(Y),and the linear formula was Y=6.3651X+10.097(R2=0.9902),the sensitivity of this method was 0.0001 g. The Nile Red fluorescence spectrometry could reflect the lipid content accurately inYarrowialipolyticaand be used as a new method for rapid lipid determination inYarrowialipolytica.

Yarrowialipolytica;lipid content;Nile Red;fluorescence spectrometry

2017-01-19

高山(1992-),男,碩士,研究方向:微生物油脂代謝調(diào)控,E-mail:m15853830932@163.com。

*通訊作者:朱晨光(1978-),男,博士,研究方向:氮高效利用轉(zhuǎn)基因玉米新種質(zhì)創(chuàng)制,E-mail:cgzhu@shu.edu.cn。 張保國(guó)(1979-),男,博士,研究方向:微生物油脂代謝調(diào)控,E-mail:zhangbg@sari.ac.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41106125)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)15-0270-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.050