MicroRNA-30a在膀胱癌中的表達(dá)及作用

柳 清 尤泊森 馬景光 邢麗娜

MicroRNA-30a在膀胱癌中的表達(dá)及作用

柳 清 尤泊森 馬景光 邢麗娜

目的 探究微小RNA(miRNA)在人膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)人膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲能力的影響。方法 應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞系(5637和T24)和膀胱上皮永生化細(xì)胞(SV-HUC-1)中miRNA-30a的表達(dá)水平。通過(guò)對(duì)T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30a mimic和5637細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30a inhibitor上調(diào)或下調(diào)miR-30a的表達(dá)，并對(duì)其分別轉(zhuǎn)染NC mimic和NC inhibitor作為對(duì)照。利用流式細(xì)胞技術(shù)、MTT法和Transwell法探究miR-30a的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲能力的影響。結(jié)果 在兩種膀胱癌細(xì)胞系(5637和T24)中miRNA-30a的表達(dá)顯著低于正常膀胱細(xì)胞系SV-HUC-1，并且在惡性度較高的T24膀胱癌細(xì)胞中其表達(dá)水平明顯低于惡性度相對(duì)較低的5637細(xì)胞系。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，miR-30a mimic組T24細(xì)胞OD值(0.83±0.09)明顯低于NC mimic組(1.21±0.12)(P=0.003)；miR-30a inhibitor組5637細(xì)胞OD值(1.28±0.14)高于NC inhibitor組(1.09±0.14)(P=0.019)。miR-30a mimic組T24細(xì)胞凋亡率(21.27±2.42)%明顯高于NC mimic組(10.61±1.29)%；miR-30a inhibitor組5637細(xì)胞凋亡率(6.78±2.57)%明顯低于NC mimic組(13.42±1.40)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0002，P=0.0014)。miR-30a mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)(183.57±16.61)低于NC mimic組(465.80±9.20)(P<0.0001)；miR-30a inhibitor組(581.25±11.02)高于NC mimic組(397.13±7.57)(P<0.0001)。結(jié)論 miR-30a表達(dá)的上調(diào)能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并降低膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲的能力。膀胱癌細(xì)胞中miR-30a的低表達(dá)可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

膀胱癌細(xì)胞；miRNA-30a；增殖；凋亡；侵襲

膀胱尿路上皮癌為泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤，僅2012年，全球就有超過(guò)四十萬(wàn)新發(fā)病例被確診，約16.5萬(wàn)名患者死于該疾病[1]。膀胱癌(Bladder cancer，BC)病理類型可大致分為2型：非浸潤(rùn)型BC和浸潤(rùn)型BC。非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(Non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)約占50%～80%，可通過(guò)經(jīng)尿道腫瘤切除治療。NMIBC的患者術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中約25%的患者將進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(Muscle invasive bladder cancer，MIBC)。進(jìn)展期BC患者預(yù)后較差，治療以聯(lián)合化療(吉西他濱和順鉑)為主，無(wú)進(jìn)展生存期(Progression-free survival，PFS)較短。因此，尋找一種可靠的生物學(xué)標(biāo)記物，將對(duì)膀胱癌的早期診斷，患者的預(yù)后判斷，以及個(gè)體化治療指導(dǎo)具有重要的意義。

MicroRNA(miRNA)是一類可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的單鏈非編碼RNA，約含有18～25個(gè)堿基，在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、監(jiān)測(cè)及治療方面具有重要價(jià)值[2]。miRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)并發(fā)揮抑癌或促癌基因的作用，其通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移以及凋亡過(guò)程，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及患者的預(yù)后[3-4]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-30a在膀胱癌組織中呈低表達(dá)[5]，提示miR-30a可能作為一種抑癌基因參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。本研究檢測(cè)了miR-30a在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及miR-30a的表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲性之間的關(guān)系，明確了miR-30a對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

膀胱癌細(xì)胞株5637和T24以及正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1購(gòu)自ATCC。含1%鏈霉素-氨芐青霉素的10%胎牛血清的DMEM，在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)PCR試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)Lipofectamine 2000的使用說(shuō)明，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后，提取細(xì)胞RNA核蛋白以便進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)。

1.3 細(xì)胞分組

對(duì)T24細(xì)胞進(jìn)行miR-30a mimic和NC mimic的轉(zhuǎn)染，分為miR-30a mimic組(miR-30a表達(dá)上調(diào)組)和NC mimic對(duì)照組；對(duì)5637細(xì)胞行miR-30a inhibitor和NC inhibitor的轉(zhuǎn)染，分為miR-30a inhibitor組(miR-30a表達(dá)下調(diào)組)和NC inhibitor對(duì)照組。

1.4 RNA提取和qRT-PCR

按照試劑使用說(shuō)明，使用Trizol(Life Technologies)提取細(xì)胞的總RNA。使用小核RNA U6作為miRNA定量的內(nèi)參。采用SYBR Green PCR Master Mix(Life Technologies)進(jìn)行qRT-PCR，對(duì)RNA進(jìn)行定量。β-actin用作mRNA定量的內(nèi)參。miRNA表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示，所用引物如下，miR-30a，F(xiàn)：5′-GCCTGTAAACATCCTCGACTGGAAG-3′，R：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；β-actin，F(xiàn)：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，R：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

行miR-30a mimic和inhibitor細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。96孔板鋪板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞密度為1 500個(gè)/孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)檢測(cè)96 h。自鋪板后48 h起，向每孔加入10 μL 5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，向每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩使之充分反應(yīng)，檢測(cè)490 nm處吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染48 h后的T24細(xì)胞和5637細(xì)胞，4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞1次，再用1×緩沖液250 μL制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×106個(gè)/孔。按照Annexin V/異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒說(shuō)明書(shū)，在5 mL流式管中加入100 μL細(xì)胞懸液、5 μL Annexin V/FITC及10 μL碘化丙錠(PI)標(biāo)記，室溫避光15 min，使其充分反應(yīng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

50 mg/L Matrigel膠以DMEM 1∶8稀釋后取60 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，使其凝結(jié)成膠。用DMEM培養(yǎng)液將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞配置成5×108/L的細(xì)胞懸液。Transwell上室加入200 μL細(xì)胞，下室加入500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后棉棒拭去上室底部未遷移的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗2次，HE染色30 min。200倍光鏡下計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-30a在不同膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，miR-30a在膀胱癌細(xì)胞系5637和T24中的表達(dá)分別為(0.70±0.05)、(0.44±0.07)，明顯低于正常膀胱移行上皮細(xì)胞系SV-HUC-1(1.02±0.02)，并且在惡性度較高的T24膀胱癌細(xì)胞中其表達(dá)水平低于惡性度相對(duì)較低的5637細(xì)胞系，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=216.8，P<0.001)(圖1)。

2.2 miR-30a的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響

首先對(duì)miR-30a表達(dá)較低的T24細(xì)胞和miR-30a表達(dá)較高的5637細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-30a mimic/NC mimic或miR-30a inhibitor/NC inhibitor，轉(zhuǎn)染24 h后對(duì)miR-30a表達(dá)進(jìn)行定量(圖2)。使用MTT法檢測(cè)miR-30a對(duì)細(xì)胞增殖的作用，72 h：miR-30a mimic組T24細(xì)胞OD值(0.83±0.09)明顯低于NC mimic組(1.21±0.12)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；72 h：miR-30a inhibitor組5637細(xì)胞OD值(1.28±0.14)高于NC inhibitor組(1.09±0.14)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。結(jié)果表明膀胱癌細(xì)胞中miR-30a的高表達(dá)能夠抑制癌細(xì)胞增殖；抑制miR-30a后，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖(圖3)。

圖1 人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞系T24、5637中miR-30a的相對(duì)表達(dá)Figure 1 The expression of miR-30a in human normal bladder epithelial immotalized cell and bladder cancer cell lines

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miRNA-30a的相對(duì)表達(dá)Figure 2 The expression of miR-30a after cell transfection

2.3 miR-30a促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的凋亡

miR-30a mimic組T24細(xì)胞凋亡率(21.27±2.42)%明顯高于NC mimic組(10.61±1.29)%(P=0.0002)；miR-30a inhibitor組5637細(xì)胞凋亡率(6.78±2.57)%明顯低于NC mimic組(13.42±1.40)%(P=0.0014)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。結(jié)果顯示miR-30a表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)T24細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制miR-30a的表達(dá)后凋亡率明顯下降。

2.4 miR-30a的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，miR-30a mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于NC mimic組，分別為(183.57±16.61)個(gè)和(465.80±9.20)個(gè)(P<0.0001)；miR-30a inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于NC mimic組，分別為(581.25±11.02)個(gè)和(397.13±7.57)個(gè)(P<0.0001)(圖5)。Transwell小室上層細(xì)胞穿透到下室的數(shù)量反應(yīng)了細(xì)胞侵襲能力的強(qiáng)弱，提示miR-30a表達(dá)的上調(diào)能夠降低膀胱癌細(xì)胞在濾膜中遷移及侵襲的能力；相反，膀胱癌細(xì)胞中miR-30a的低表達(dá)會(huì)增強(qiáng)其遷移及侵襲的能力。

圖3 MiR-30a的表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖的影響 Figure 3 The proliferative curves of miR-30a in T24 cells and 5637 cells Note：A.T24 cells；B.5637 cells.

圖4 MiR-30a的表達(dá)水平對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 The apoptotic rate of miR-30a in T24 cells and 5637 cellsNote：A.T24 cells；B.5637 cells.*P<0.05，#P<0.01，vs. NC minmic.

圖5 miR-30a的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移的影響Figure 5 The number of migration cell of miR-30a in T24 cells and 5637 cellsNote：A.T24 cells；B.5637 cells.* P<0.05，#P<0.01，vs. NC minmic.

3 討論

miRNAs在惡性腫瘤中表達(dá)異常，并通過(guò)調(diào)控癌基因的表達(dá)參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6]。大量證據(jù)表明，異常表達(dá)的miRNAs能使原本受控良好的細(xì)胞內(nèi)RNA網(wǎng)絡(luò)失去調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[7-8]。miRNAs的異常表達(dá)及其所調(diào)控的RNA網(wǎng)絡(luò)的改變?yōu)槲覀冴U述癌細(xì)胞發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。現(xiàn)已證實(shí)表達(dá)異常的miRNAs在膀胱癌細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色[7]。與膀胱癌細(xì)胞相關(guān)的miRNAs包括miR-1/133a(靶基因：TAGLIN2)、miR-23b/27b/24-1(靶基因：EGFR，MET，和FOXM1)以及miR-195/497(靶基因：BRIC5，WNT7A)，通過(guò)對(duì)一些癌基因及其通路的調(diào)節(jié)起到抑制腫瘤的作用[9-12]。

既往研究表明，miR-30在肝癌、乳腺癌和肺癌等多種人類腫瘤中表達(dá)異常，其通過(guò)發(fā)揮抑癌或促癌基因的作用參與細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-16]。在結(jié)腸癌中，miR-30a靶向作用于DTL(Denticleless protein homolog)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[17]。在肺腺癌A549細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)的miR-30a能夠抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[18]。鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)的miR-30a具有促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，miR-30a的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移性鼻咽癌中明顯高于早期鼻咽癌，在惡性度較高的鼻咽癌細(xì)胞系中其表達(dá)水平也顯著高于惡性度低的細(xì)胞系[4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)對(duì)惡性腫瘤的侵襲和遷移至關(guān)重要[19]。MicroRNA通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)分子通路，促進(jìn)或抑制EMT這一過(guò)程，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到了重要作用[19]。在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌中，miR-30a靶向作用于Vimentin和Snail 3端非編碼區(qū)(3′-UTR)，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[16，20]。

相較于正常人膀胱上皮組織，miR-30a在膀胱癌組織中呈低表達(dá)[5]。本實(shí)驗(yàn)中miR-30a在膀胱癌細(xì)胞系中表達(dá)下降這一結(jié)果與以往研究相吻合，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-30a在惡性度較高的T24膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于惡性度相對(duì)較低的5637細(xì)胞系，提示其表達(dá)水平可能與腫瘤惡性度相關(guān)。通過(guò)上調(diào)或下調(diào)miR-30a的表達(dá)觀察膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的能力，證實(shí)miR-30a在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮了抑癌作用。由此推測(cè)，膀胱癌組織中miR-30a的低表達(dá)可能促進(jìn)了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，其表達(dá)水平可能與腫瘤的侵襲性、預(yù)后和治療的敏感性有關(guān)。

本研究?jī)H在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-30a在膀胱癌中的抑癌作用，下一步我們將進(jìn)一步探討其作用途徑和相關(guān)機(jī)制，以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。未來(lái)還需要進(jìn)一步研究以明確miR-30a在膀胱癌中與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。miR-30a有望成為早期診斷和、預(yù)后評(píng)估和指導(dǎo)治療的生物學(xué)標(biāo)志物而應(yīng)用于臨床，此外，其靶基因及相關(guān)通路的進(jìn)一步研究有助于我們尋找膀胱癌中新的治療靶點(diǎn)。

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(收稿：2017-03-29)

The expression and function of microRNA-30a in bladder cancer

LIUQing，YOUBosen，MAJingguang，XINGLina

The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，China

Objective The aims of this study were to investigate the expression of microRNA-30a(miR-30a)in human bladder cancer cell lines and their effects on the proliferation，apoptosis and migration of human bladder cancer cells.Methods The expression levels of miR-30a in bladder cancer cell lines(5637 and T24)and bladder epithelial immortalized cells(SV-HUC-1)were detected by real-time quantitative PCR(qRT-PCR).The expression of miR-30a was up-regulated or down-regulated by T24 cells transfected with miR-30a mimic or 5637 cells transfected with miR-30a inhibitors and controls using NC mimic or NC inhibitor.The effects of miR-30a expression on the proliferation，apoptosis and invasion of bladder cancer cells were investigated by flow cytometry，MTT and Transwell assays.Results The expression level of miR-30a in two bladder cancer T24 and 5637 cell lines was significantly lower than that in normal bladder SV-HUC-1 cell line(P<0.05)，and the expression level of miR-30a was lower in the high degree of malignancy in bladder cancer T24 cells than that in malignant degree of relatively low 5637 cells.After 72 h transfection，the values of optical density(OD)in the miR-30a mimic group(0.83±0.09)was significantly lower than that in NC mimic group(1.21±0.12)in T24 cells(P<0.01).The OD values of miR-30a inhibitor group(1.28±0.14)was significantly lower than that in the NC inhibitor group(1.09±0.14)in 5637 cells(P<0.01).The apoptotic rate of miR-30a mimic group in T24 cells(21.27±2.42)% was significantly higher than that in the NC mimic group(10.61±1.29)%(P<0.01).The apoptotic rate of the miR-30a inhibitor group in 5637 cells(6.78±2.57)% was significantly lower than that in the NC mimic group(13.42±1.40)%(P<0.01).The number of transmembrane cells in miR-30a mimic group in T24 cells(183.57±16.61)was significantly lower than that in NC mimic group(465.80±9.20)(P<0.01).The number of transmembrane cells in the miR-30a inhibitor group in 5637 cells(581.25±11.02)was significantly lower than that in NC mimic group(397.13±7.57)(P<0.01).Conclusion Up-regulation of miR-30a can inhibit the proliferation of bladder cancer cells，promote cell apoptosis and reduce the ability of migration and invasion in bladder cancer cells.The low expression of miR-30a in bladder cancer cells may be related to the development and metastasis in bladder cancer.

Bladder cancer cell；miRNA-30a；Proliferation；Apoptosis；Invasion

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(哈爾濱 150086)

柳清，女，(1989-)，碩士，住院醫(yī)師，從事基因靶向治療的研究。

邢麗娜，E-mail：xinglina@medmail.com.cn

R737.14

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.005