多梳蛋SUZ12預(yù)測(cè)吉西他濱治療肝內(nèi)膽管癌療效和預(yù)后的研究

劉 楠 韓志陽(yáng) 鹿芃恬 李丹陽(yáng) 王英煒 董祥慧 朱 宏

·臨床研究·

多梳蛋SUZ12預(yù)測(cè)吉西他濱治療肝內(nèi)膽管癌療效和預(yù)后的研究

劉 楠1韓志陽(yáng)2鹿芃恬1李丹陽(yáng)1王英煒1董祥慧1朱 宏1

目的 本研究探討了肝內(nèi)膽管癌(ICC)患者多梳蛋白SUZ12的表達(dá)及其在預(yù)測(cè)ICC患者的生存和對(duì)治療反應(yīng)的作用。方法 用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)207個(gè)肝組織樣本(包括ICC患者，膽道上皮內(nèi)瘤樣病變患者BilIN-1，-2，-3，和非瘤樣病變的膽管樣本)SUZ12和p16INK4a蛋白的表達(dá)。評(píng)估這些蛋白的表達(dá)是否和接受化療的ICC患者的病理學(xué)特征和生存結(jié)果相關(guān)，以及是否和隨后的化療反應(yīng)相關(guān)。結(jié)果 從非腫瘤性膽管組織依次到BilIN-1，-2，-3，ICC，SUZ12表達(dá)水平漸進(jìn)增加。而p16INK4a蛋白在非瘤樣病變性膽管組織中大量表達(dá)，但在BilIN-1，-2，-3，ICC組織中依次逐漸降低。SUZ12表達(dá)與未分化的ICC、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期癌癥相關(guān)。Kaplan-Meier曲線分析顯示，高表達(dá)SUZ12的ICC患者與低表達(dá)SUZ12的ICC患者相比，總生存期和無(wú)瘤生存期顯著降低。SUZ12表達(dá)與接受吉西他濱為基礎(chǔ)的輔助化療(Adjuvant gemcitabine-based chemotherapy，AGC)的患者的總體存活顯著相關(guān)。結(jié)論 SUZ12表達(dá)能夠預(yù)測(cè)用吉西他濱為基礎(chǔ)的化療的ICC患者的總生存期和無(wú)病生存期。

SUZ12；肝內(nèi)膽管癌；吉西他濱；p16INK4a

肝內(nèi)膽管癌(ICC)約占所有原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的5%～10%[1-2]。在組織學(xué)上，正常膽管經(jīng)過(guò)癌前病變發(fā)展到ICC遵循著“增生-不典型增生(BilIN-1，-2，-3)-癌”進(jìn)展模型[2-3]。放化療是目前治療ICC的唯一選擇，來(lái)自幾個(gè)臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明，使用吉西他濱的術(shù)后輔助化療對(duì)晚期膽管癌患者的存活有幫助[4-5]。然而，該輔助化療的功效存在個(gè)體差異，因此，迫切需要有效的評(píng)估指標(biāo)來(lái)進(jìn)行個(gè)體化治療。

最近的研究已經(jīng)證明，多梳家族(PcG)EZH2增強(qiáng)子和SUZ12通過(guò)調(diào)節(jié)p16INK4a表達(dá)參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[6-7]，在ICC中，啟動(dòng)子高甲基化是導(dǎo)致p16INK4a基因失活最常見(jiàn)原因[8-9]，因此，本研究分析了SUZ12和p16INK4a蛋白在正常、癌前病變和ICC組織標(biāo)本中的表達(dá)，把SUZ12表達(dá)與ICC患者的臨床病理和生存的信息相聯(lián)系，評(píng)估ICC患者對(duì)化療的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取了哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2002年5月—2007年4月手術(shù)切除并確診的112例ICC患者(表1中列出了腫瘤分類、階段)，根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期系統(tǒng)進(jìn)行分類，Ⅰ期23例，Ⅱ期17例，Ⅲ期11例，Ⅳ期61例。除去術(shù)后死亡患者及術(shù)前放射或化療的患者，共101名患者參與本研究。此外，我們分析了95例肝結(jié)石病和11例原發(fā)性硬化性膽管炎的組織切片，選擇了86例BilIN(79例肝膽管結(jié)石和7例原發(fā)性硬化性膽管炎)和20例轉(zhuǎn)移性肝腫瘤的非腫瘤部位或創(chuàng)傷性肝斷裂的健康肝組織樣本。共207例肝組織樣本，包括ICC(n=101)，BilIN-3(n=21)，BilIN-2(n=27)，BilIN-1(n=38)和非腫瘤膽管(n=20)用于本研究。

1.2 ICC患者用藥方案及隨訪

腫瘤切除術(shù)后AGC的患者有2個(gè)選擇，靜脈和口服聯(lián)合給藥化療或單獨(dú)靜脈內(nèi)給化療藥物。靜脈和口服聯(lián)合給藥化療包括第1天靜脈注射吉西他濱，劑量為700 mg/m2，然后連續(xù)7天口服，劑量為150 mg/m2，每14天重復(fù)一個(gè)治療周期。單獨(dú)靜脈內(nèi)化療的患者每周兩次給予吉西他濱(700 mg/m2)，30 min靜脈內(nèi)輸注。101例患者的中位隨訪時(shí)間為21個(gè)月(范圍1～121個(gè)月，起止時(shí)間2002年6月—2012年7月)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果的判定

p16INK4a(克隆EP1511Y)和SUZ12(克隆SUZ220A)的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。將經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋的組織切片脫蠟并水化后，用3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min。放置組織切片于EDTA緩沖液(pH9)中，在121℃壓力鍋中煮沸20 min對(duì)組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)，并用10%馬血清孵育30 min阻斷非特異性抗體結(jié)合，將切片與PBS稀釋的抗p16INK4a和SUZ12的抗體(1∶100)在濕盒中4℃孵育過(guò)夜，隨后，將切片與生物素標(biāo)記的1∶200稀釋的抗小鼠免疫球蛋白在37℃孵育60 min，然后在37℃下與親和素過(guò)氧化物酶結(jié)合物在37℃進(jìn)一步孵育60 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染。使用小鼠IgG代替一抗作為陰性對(duì)照。由兩個(gè)經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家對(duì)切片進(jìn)行盲審和評(píng)分。

對(duì)于p16INK4a和SUZ12表達(dá)的半定量評(píng)估，隨機(jī)選擇四個(gè)高倍視野大于200個(gè)細(xì)胞計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，并且將平均值視為每個(gè)病變的標(biāo)記指數(shù)(LI)。SUZ12表達(dá)記為陰性(評(píng)分1，無(wú)染色)，弱(評(píng)分2；LI小于25%)，中度(評(píng)分3；LI為25%至75%)和強(qiáng)(評(píng)分4；LI大于75%)。分?jǐn)?shù)1和2被認(rèn)為是SUZ12低表達(dá)，而分?jǐn)?shù)3和4被認(rèn)為是SUZ12高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用Pearson相關(guān)分析法分析SUZ12及p16INK4a蛋白之間的相關(guān)性，采用方差分析法分析BilIN-1，-2，-3和ICC之間SUZ12及p16INK4a蛋白表達(dá)差異；使用卡方檢驗(yàn)分析SUZ12表達(dá)與各臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。使用Kaplan-Meier方法構(gòu)建生存曲線，并通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線的差異，使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BilIN和ICC患者中SUZ12和p16INK4a蛋白的差異表達(dá)

SUZ12表達(dá)水平依次從非腫瘤性膽管組織，BilIN-1，-2，-3到ICC成漸進(jìn)性增加，而p16INK4a蛋白的表達(dá)從非腫瘤性膽管細(xì)胞，BilIN-1，-2，-3和ICC成漸進(jìn)性減少(P<0.001，圖1C和B)。SUZ12表達(dá)的標(biāo)記指數(shù)在BilIN-1中為(11.07±9.77)%，在BilIN-2中為(26.03±13.51)%，在BilIN-3中為(39.71±22.29)%，在ICC中為(49.74±27.84)%。p16INK4a表達(dá)的標(biāo)記指數(shù)在BilIN-1中為(45.84±15.63)%，在BilIN-2中為(32.19±14.07)%，在BilIN-3中為(27.90±22.71)%，在ICC中為(16.55±11.20)%(P<0.001；圖2A和B)。因此，SUZ12和p16INK4a的表達(dá)在這些組織標(biāo)本中呈負(fù)相關(guān)(r=-0.721，P<0.001；圖2C)。

2.2 ICC患者中SUZ12表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

SUZ12表達(dá)在分化不良的腫瘤中表達(dá)率高于在晚期或中度分化的腫瘤(84%vs. 35%)；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例表達(dá)高于未轉(zhuǎn)移病例(80%vs. 42%)；SUZ12在pT3和T4中的表達(dá)顯著高于pT1和T2腫瘤(78%vs. 41%)。在Ⅲ和Ⅳ期ICC患者中表達(dá)高于Ⅰ和Ⅱ期患者(78%vs. 39%)(P<0.05；表1)。

2.4 SUZ12表達(dá)與患者生存的相關(guān)性

本研究ICC患者，1年的總生存率為78%，3年為33%，5年為13%。Kaplan-Meier曲線分析顯示，SUZ12表達(dá)與這些患者的總生存期和無(wú)瘤生存期相關(guān)(圖3)，單因素分析顯示殘余腫瘤(P<0.001)，病理分化(P<0.001)，淋巴淋結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)，pT分期(P<0.001)，臨床分期(P<0.001)，SUZ12表達(dá)(P=0.049)與總生存期顯著相關(guān)，而AGC治療與患者總生存期無(wú)關(guān)(P=0.155)。接受AGC治療的患者的5年存活率為16.36%，相比之下，未接受治療的患者分別為10.87%(表2)。多變量分析顯示對(duì)于ICC患者，腫瘤分化(HR=6.22；95%CI：2.91～13.33；P<0.001)和殘留腫瘤(HR=5.29；95%CI：2.82～9.90；P<0.001)是獨(dú)立預(yù)后因素(表2)。

圖1 SUZ12和p16INK4a蛋白在207個(gè)肝組織標(biāo)本中的表達(dá)(放大倍率 400×)Figure 1 The expression of SUZ12 and p16INK4a proteins in 207 cases of liver tissue specimens(Magnification 400×)

FactorUnivariateanalysisNo．patients(survival)5-yearsurvivalrate(%)PMultivariateanalysisHR(95%CI)PAge(yrs．)0．113<7051(31)6．08≥7050(10)20．00Gender0．285Male59(6)10．17Female42(7)16．67Useofgemcitabine0．155Yes55(9)16．36No46(5)10．87Residualtumor<0．0015．29(2．82～9．90)<0．001R065(2)3．07R136(0)0．00Tumordifferentiation<0．0016．22(2．91-13．33)<0．001Well/moderately43(10)23．26Poorly58(0)0．00Lymphnodemetastasis<0．001No45(10)22．22Yes56(22)3．93UICCpTstage<0．001T1，241(11)26．83T3，460(0)0．00UICCclinicalstage<0．001Ⅰ，Ⅱ38(9)23．68Ⅲ，Ⅳ63(1)1．59SUZ12expression0．049Low37(7)18．92High64(5)7．81

2.5 接受AGC治療的ICC患者中SUZ12表達(dá)的預(yù)后意義

對(duì)于接受AGC治療的55名患者，SUZ12表達(dá)與總生存率顯著相關(guān)(P=0.031)。SUZ12高表達(dá)患者的1年、3年和5年生存率分別為82%、32%和5%，SUZ12低表達(dá)的患者為90%、45%和28%(圖4A)。然而，在沒(méi)有AGC治療的患者中，SUZ12高表達(dá)和低表達(dá)患者之間沒(méi)有顯著的生存差異(P=0.558)。在沒(méi)有AGC治療的患者中，SUZ12高表達(dá)的腫瘤患者的1年、3年和5年生存率分別為68%、22%和11%，而SUZ12低表達(dá)的腫瘤患者為70%、39%和8%(圖4B)。

此外，在低SUZ12表達(dá)的ICC的患者中(n=37)，AGC治療后的總生存顯著好于沒(méi)有AGC治療的患者(P=0.048，圖5A)，而在高表達(dá)SUZ12的腫瘤患者中(n=64)，有和沒(méi)有AGC治療的患者的總生存率沒(méi)有顯著差異(P=0.641，圖5B)。

圖2 BilIN-1，-2，-3和ICC中p16INK4a和SUZ12表達(dá)的免疫組織化學(xué)結(jié)果的半定量分析Figure 2 Semi-quantitative evaluation of p16INK4a and SUZ12 expression in BilIN-1，-2，-3 and ICC by immunohistochemistryNote：# P<0.05

圖4 不同SUZ12分組ICC患者的Kaplan-Meier曲線Figure 4 Kaplan-Meier curves of ICC patients stratified by SUZ12 expressionNote：A.Overall survival of patients with adjuvant gemcitabine-based chemotherapy(AGC)(n=55)；B.Overall survival of patients without AGC(n=46).

圖3 不同SUZ12分組ICC患者的Kaplan-Meier曲線(n=101)Figure 3 Kaplan-Meier curves of ICC patients stratified by SUZ12 expression(n=101)Note：A.overall survival；B.disease free survival；C.Overall survival vs.and disease-free survival.

圖5 不同AGC分組ICC患者的Kaplan-Meier曲線Figure 5 Kaplan-Meier curves of patients stratified by AGCNote：A.ICC patients with SUZ12-expressed tumor(n=64)；B.patients with low SUZ12-expressed tumor(n=37).Gem(+).patients treated with AGC；Gem(-).patients who did not received AGC.

3 討論

本研究數(shù)據(jù)表明從非腫瘤性膽管，BilIN-1，-2，-3，到ICC組織標(biāo)本，SUZ12表達(dá)漸進(jìn)性增加，而p16INK4a表達(dá)在這些組織標(biāo)本中減少。該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了ICC和ICC風(fēng)險(xiǎn)性疾病的“正常-增生-癌前病變-癌”進(jìn)展模型，表明SUZ12表達(dá)可以進(jìn)一步被認(rèn)為是ICC診斷或預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物。此外，我們還發(fā)現(xiàn)SUZ12的表達(dá)與未分化的ICC、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期癌癥相關(guān)。異常的SUZ12表達(dá)與ICC總體生存和無(wú)瘤生存不良有關(guān)，也和吉西他濱為基礎(chǔ)的輔助化療的反應(yīng)有關(guān)。

最近的研究顯示在其他類型癌癥中異常的SUZ12表達(dá)與攻擊性增強(qiáng)相關(guān)[10-11]。例如，Kirmizis等[10]報(bào)道了SUZ12 mRNA在結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌中上調(diào)，并且提議SUZ12作為人癌癥治療的潛在分子靶點(diǎn)。已顯示SUZ12蛋白的消耗導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖的抑制[11]。在本研究中，我們?cè)u(píng)估非腫瘤性膽管，BilIN-1，-2，-3和ICC組織標(biāo)本中的SUZ12表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在ICC發(fā)展過(guò)程中SUZ12表達(dá)逐漸增加，而p16INK4a蛋白在這些組織中逐漸喪失。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了以前對(duì)ICC中p16INK4a蛋白的研究[12-13]。而且，本研究結(jié)果提示SUZ12表達(dá)與ICC患者的生存相關(guān)。此外，本研究結(jié)果證明接受AGC的患者具有比未接受這種治療的患者有更高的存活率，而AGC治療不顯著促進(jìn)或延長(zhǎng)具有高表達(dá)SUZ12患者的總體存活。相比之下，在ICC中低表達(dá)SUZ12和接受AGC的患者比在ICC中具有SUZ12高表達(dá)并且接受AGC的那些患者具有顯著更好的存活。然而，在沒(méi)有接受AGC的患者中，SUZ12表達(dá)和總生存之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

此外，本研究中的多因素分析表明，SUZ12表達(dá)不是ICC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，這可能是由于SUZ12表達(dá)與未分化ICC，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期ICC分期的強(qiáng)關(guān)聯(lián)。這些是與大多數(shù)惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)的已知因素。然而，我們不能排除當(dāng)未來(lái)的研究中使用大樣本量時(shí)，SUZ12表達(dá)可以提供獨(dú)立的預(yù)后信息。本研究的其他主要局限性在于，它不是前瞻性研究，也不是隨機(jī)臨床試驗(yàn)。因此，需要使用更大樣本量的前瞻性研究來(lái)確認(rèn)SUZ12作為ICC的生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值。

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Expression of polycomb protein SUZ12 predicts poor prognosis and response of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma to adjuvant gemcitabine-based chemotherapy

LIUNan1，HANZhiyang2，LUPengtian1，LIDanyang1，WANGYingwei1，DONGXianghui1，ZHUHong1

1.Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China； 2.Department of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

Objective This study explored the expression of polyclonal protein SUZ12 in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma(ICC)，and its role in predicting the survival and treatment of ICC patients.Methods The expression of SUZ12 and p16INK4awas detected by immunohistochemical assay in 207 liver tissue samples including ICC patients，BilIN-1，-2，-3 and non-tumor-like cholangiocarcinoma.The expression of these proteins was assessed to be related to the pathological characteristics of the ICC patients receiving chemotherapy and the outcome of survival as well as the subsequent chemotherapy response.Results The expression level of SUZ12 was gradually increased from non-neoplastic bile duct tissue to BilIN-1，-2，-3 and ICC.The expression of p16INK4aprotein was expressed in non-neoplastic-like cholangiocarcinoma，but it decreased gradually in BilIN-1，-2，-3 and ICC tissues.SUZ12 expression was associated with undifferentiated ICC，lymph node metastasis and advanced cancer.Kaplan-Meier curve analysis showed that ICC patients with high expression of SUZ12 had a significant reduction in overall survival and disease-free survival in comparison with ICC patients with the low expression of SUZ12.SUZ12 expression was significantly associated with overall survival of patients receiving adjuvant gemcitabine-based chemotherapy(AGC).Conclusion SUZ12 expression is able to predict the overall survival and disease-free survival of ICC patients with adjuvant gemcitabine-based chemotherapy.

SUZ12；Intrahepatic cholangiocarcinoma；Gemcitabine；p16INK4a

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H201445)

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科(哈爾濱 150001)；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科

劉楠，女，(1981-)，博士，主治醫(yī)師，從事腫瘤發(fā)病機(jī)制及預(yù)后的研究。

朱宏，E-mail：252302504@qq.com

R322.4

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.007