?？谑形妹椒植技耙夷X病毒分離鑒定

趙宣，侯乃旭，陳晨，張琪悅，趙靜，蘆亞君

(1.熱帶病轉化醫(yī)學教育部重點實驗室海南醫(yī)學院，海南?？?71199；2.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?71199)

?？谑形妹椒植技耙夷X病毒分離鑒定

趙宣1，2，侯乃旭1，2，陳晨1，2，張琪悅1，2，趙靜1，2，蘆亞君1，2

(1.熱帶病轉化醫(yī)學教育部重點實驗室海南醫(yī)學院，海南?？?71199；2.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?71199)

目的調查?？谑形妹椒植技拔孟x攜帶乙腦病毒的情況。方法于2015年7月至2016年6月采用帳誘法捕捉蚊蟲，用細胞培養(yǎng)法分離病毒，磁珠法提取病毒RNA、RT-LAMP擴增，并進行分子生物學鑒定。結果于?？谑胁蹲轿孟x共561只，其中庫蚊528只，占94.12%，伊蚊33只，占5.88%；庫蚊研磨液接種于BHK21產生典型的細胞病變，RT-LAMP擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示，蚊媒體內乙腦病毒陽性。結論?？谑写嬖跀y帶乙腦病毒的吸血蚊媒。

流行性乙型腦炎病毒(乙腦病毒)；蚊媒；海口

流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis type B)又稱日本乙型腦炎(Japanese B encephalitis)，是一種嚴重損害中樞神經系統(tǒng)的急性傳染病。其病原體是流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，簡稱乙腦病毒，隸屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，是一種有囊膜的似球形病毒，可破壞神經系統(tǒng)，對人體傷害巨大[1]。流行性乙型腦炎的傳播媒介主要為吸血蚊蟲[2]，常見帶毒蚊種有三帶喙庫蚊(Culex tritaeniorhynchus)、致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)、淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)、中華按蚊(Anopheles sinensis)和騷擾阿蚊(Armigeres subalbatus)等。其中分離出病毒最多的蚊種為三帶喙庫蚊。自建國以來文獻記載[3-10]，海南省曾發(fā)生多次乙腦爆發(fā)。乙腦病例主要在儋州市、三亞市、樂東縣等地，其他市縣存在散發(fā)病例。本研究于2015年7月至2016年6月在海南省?？谑羞M行蚊蟲采集，調查蚊蟲種類、密度及攜帶乙腦病毒情況。

1 材料與方法

1.1 相關試劑及儀器BHK21(幼倉鼠腎細胞)、FBS(胎牛血清)、MEM培養(yǎng)液購于武漢博士德生物工程有限公司；病毒RNA提取試劑盒(磁珠法)購于北京百泰克生物技術有限公司；DNA Ladder DL2000購于江蘇凱基生物技術股份有限公司；核酸染料SYBR Green(10 000×)購于北京索萊寶科技有限公司；Bst DNA聚合酶大片段購于紐英倫生物技術(北京)有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；高效組織細胞破碎儀購于湖北新縱科病毒疾病工程技術有限公司；小型臺式高速冷凍離心機Eppendorf 5424R購于艾本德中國有限公司；L1型低溫連接儀購于珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；Thermo fisher超微量分光光度計Nano Drop 2000購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；全自動數碼凝膠成像分析系統(tǒng)Tanon-1600購于上海天能科技有限公司。

1.2 蚊媒采集2015年7月至2016年6月，選擇在海口市人口流動量大的火車東站、汽車東站、汽車南站和汽車西站作為捕蚊點，采用帳誘法在傍晚連續(xù)捕蚊1 h。待蚊蟲胃血消化殆盡，-80℃保存。

1.3 蚊蟲處理及細胞染毒于冰板上進行蚊種鑒別，并分類計數。50只一批，放入裝有研磨珠的研磨管內，加2 mL 4℃預冷的MEM，置高效組織細胞破碎儀內，以4 000 r/min研磨破碎兩次，每次20 s，充分研磨至組織碎片消失呈勻漿狀；4℃12 000 r/min離心20 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，取500 μL濾液接種于BHK21細胞，置于37℃CO2培養(yǎng)箱內，每15 min晃動一次，使蚊蟲研磨液與細胞充分接觸，染毒1 h后棄去蚊研液，加10%FBS MEM進行細胞常規(guī)培養(yǎng)，每12 h觀察一次，BHK21細胞是否出現(xiàn)細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，如有CPE，則為陽性反應；如無CPE，繼續(xù)傳代培養(yǎng)三次，仍無病變，則為陰性[11-12]；

1.4 病毒RNA提取及擴增

1.4.1 病毒RNA提取取200 μL CPE細胞懸液，用病毒RNA提取試劑盒(磁珠法)提取RNA；使用超微量分光光度計測定RNA含量及純度。

1.4.2 引物設計及合成乙腦病毒RNA RT-LAMP擴增引物共6條[13]，包括2條外引物F3/B3，2條內引物FIP/BIP，2條環(huán)引物FLP/BLP(表1)，由上海生工合成。

表1 乙腦病毒RT-LAMP引物序列

1.4.3 RT-LAMP擴增病毒RNA使用逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)擴增病毒RNA[14-15]，25 μL，反應體系(表2)，65℃孵育70 min，80℃20 min終止反應。

表2 RT-LAMP反應體系

1.5 病毒RNA擴增產物檢測及鑒定

1.5.1 擴增產物初步檢測于RT-LAMP擴增產物加1 μL SYBR green，混勻震蕩，避光室溫充分結合30 min，置于紫外成像系統(tǒng)觀察是否產生強烈的熒光；等量RNase-free水與1 μL SYBR green結合作為陰性對照。

1.5.2 擴增產物鑒定取5 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1 蚊媒種類及密度2015年7月至2016年6月在?？谑兴膫€蚊蟲捕捉點共捕獲蚊蟲561只(表3)，平均蚊密度為11.69只/h。庫蚊528只，占94.12%，1月份、4月份、10月份為庫蚊密度高峰(圖1)；伊蚊33只，占5.88%，5月份和9月份為伊蚊高峰(圖2)。

表3 ?？谑?015年7月至2016年6月蚊媒種類、數量及密度

圖12005 年7月至2016年6月庫蚊分布

圖22005 年7月至2016年6月伊蚊分布

2.2 病毒分離BHK21細胞接種蚊研液后，倒置顯微鏡(10蚊研液)下觀察出現(xiàn)CPE，為陽性反應(圖3)。

2.3 病毒鑒定

2.3.1 擴增產物初步檢測RT-LAMP擴增產物與核酸染料SYBR green充分結合后，在紫外成像系統(tǒng)照射下陽性反應呈顯著熒光，陰性反應無熒光，陰性對照管也無熒光(圖4)。

2.3.2 擴增產物電泳鑒定含乙腦病毒RNA的擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外成像系統(tǒng)下呈特異性明亮條帶(圖5)。

圖3 CPE細胞

圖4 RT-LAMP產物初步檢測

圖5 RT-LAMP產物電泳鑒定

3 討論

海南省位于中國的最南處，屬于熱帶海洋性季風氣候，氣候溫暖潮濕，非常適宜蚊蟲的孳生及繁殖。同時在國際旅游島的建立和一帶一路政策背景的推進下，海南省的旅游、貿易和人員來往與日俱增。人員流量激增、旅游業(yè)的發(fā)展、氣候和環(huán)境的變化，為蚊媒傳染病提供了有利的傳播條件，出現(xiàn)嚴重的疾病傳播隱患。海口市作為省會城市，具有人口密度大和人員流動量高的特點，極利于蚊媒病的傳播和擴散。

本研究于2015年7月至2016年6月，在海南省海口市人口流動量大的四個捕蚊點進行為期一年的蚊媒采集，其中庫蚊占94.12%，為優(yōu)勢蚊種，伊蚊僅占5.88%。平均蚊媒密度為11.69只/h，比2012-2014的1.79只/h[16]高出6.53倍。經細胞染毒培養(yǎng)和分子生物學鑒定顯示，已從該批蚊蟲中分離出乙腦病毒。以往資料顯示，乙腦病例主要分布在儋州市、樂東縣等地，且發(fā)病季節(jié)早于全國2個月。自2001年全省開始建立乙腦監(jiān)測系統(tǒng)后，至2014年共確診乙腦病例143例。雖然?？谑兄两裆形从幸夷X病例報道，但蚊媒體內確有乙腦病毒存在，對當地人群具有潛在威脅。

因此，對病媒生物蚊蟲的種類、密度、病原體攜帶情況進行系統(tǒng)調查和及時監(jiān)測，才能為乙腦疾病及其他蚊媒傳染病的預防和控制提供詳實依據和針對性措施。

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Distribution of mosquito vectors and isolation and identification of Japanese encephalitis virus in Haikou City.

ZHAO Xuan1,2,HOU Nai-xu1,2,CHEN Chen1,2,ZHANG Qi-yue1,2,ZHAO Jing1,2,LU Ya-jun1,2.1.Key Laboratory of Translation Medicine Tropical Diseases,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA;2.College of Tropical Medicine and Laboratory Medicine,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the distribution of blood-sucking mosquitoes and the situation of mosquitoes carrying Japanese encephalitis virus in Haikou City.MethodsThe mosquitoes were caught by mosquito net from July 2015 to June 2016.The viruses were isolated by cell culture and RNAwere extracted by paramagnetic particle method.RT-LAMP was used for molecular biological identification.ResultsA total of 561 mosquitoes were collected,of which 94.12%were Culex(528)and 5.88%were Aedes mosquito(33).The cell pathological effects were observed in BHK21 inoculated grinding fluid of Culex.RT-LAMP amplification products were tested by electrophoresis with 1% agarose gel,which showed that Japanese encephalitis virus in Culex was positive.ConclusionThere are mosquitos carrying JEV in Haikou City.

Japanese encephalitis virus(JEV);Mosquito vector;Haikou City

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.020

R512.32

A

1003—6350（2017）15—2478—03

2017-01-18)

海南省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：HYCX20140109)

蘆亞君。E-mail：luyajuncc@163.com