金黃色葡萄球菌定量檢測中四種培養(yǎng)基的比較

□ 蘇妙貞 曾曉琮 韓志杰 周 露 廣東省食品檢驗(yàn)所

金黃色葡萄球菌定量檢測中四種培養(yǎng)基的比較

□ 蘇妙貞 曾曉琮 韓志杰 周 露 廣東省食品檢驗(yàn)所

使用Baird-Parker平板、RPF平板、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基平板及3M PerifilmTM金黃色葡萄球菌測試片對金黃色葡萄球菌檢測，濃度范圍在103～104CFU/mL，3M測試片、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、RPF平板與BP平板結(jié)果相當(dāng)。在實(shí)際檢測中，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基輔助檢測，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

金黃色葡萄球菌；定量檢測；培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌是我國細(xì)菌性食物中毒的致病菌之一，致病力與產(chǎn)生腸毒素相關(guān)。而腸毒素的產(chǎn)生與樣品中金黃色葡萄球菌濃度有關(guān)，一般認(rèn)為濃度≥105CFU/g，即可能產(chǎn)生腸毒素[1]。因此國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICMSF）采樣方案設(shè)定指南中，把金黃色葡萄球菌的危險(xiǎn)性列為中度危害，偶爾會使人嚴(yán)重不適，治療后無后遺癥，病程較短，癥狀可治愈。中度危害菌采用三級采樣方案，即允許一定量的金黃色葡萄球菌存在于樣品中。GB 29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》是根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和評估結(jié)果，參考CAC、ICMSF和澳大利亞、新西蘭、香港、臺灣等國際組織、國家和地區(qū)不同類別即食食品中金黃色葡萄球菌限量標(biāo)準(zhǔn)，按三級采樣方案設(shè)置肉制品、水產(chǎn)制品、糧食制品、即食豆類制品、即食果蔬制品、飲料、冷凍飲品及即食調(diào)味品8類食品中金黃色葡萄球菌限量[2]。

金黃色葡萄球菌定量檢測在日常微生物檢驗(yàn)工作中所占比重越來越大，選出一個(gè)簡便、快捷并準(zhǔn)確的方法變得十分有必要。本文通過對四種培養(yǎng)基比較，得出它們優(yōu)缺點(diǎn)，為提高檢測效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2015年食藥總局組織的金黃色葡萄球菌盲樣考核樣品，共10份。樣品為10個(gè)西林瓶裝金黃色葡萄球菌菌球和10袋奶粉樣品，每袋奶粉質(zhì)量為25 g，每個(gè)相同編碼金黃色葡萄球菌樣品和奶粉樣品作為1件樣品檢測，以平板計(jì)數(shù)法報(bào)告檢測結(jié)果，單位為CFU/g。將奶粉與小球放入盛有225 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)1 min。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

成品Baird-Parker瓊脂平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；成品兔血漿纖維蛋白原瓊脂平板（RPF平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（法國科馬嘉公司）；金黃色葡萄球菌測試片（美國3M公司）；金黃色葡萄球菌反應(yīng)確認(rèn)片（美國3M公司）；凍干血漿（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

Baird-Parker平板、 RPF平板、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基平板均依據(jù)GB 4789.10-2010 第二法 平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)涂布法涂布，三塊平板即吸取2～3個(gè)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液以0.3、0.3、0.4 mL接種量分別加在三塊平板上，涂布均勻、培養(yǎng)[3]。3M金黃色葡萄球菌測試片按說明書測試，即吸取1 mL樣品勻液，揭起上層膜，將樣品滴加在測試片中央處，使用壓板將樣品均勻覆蓋于培養(yǎng)面積上，等樣品吸收完畢后培養(yǎng)。

1.2.2 選擇性鑒定實(shí)驗(yàn)

Baird-Parker平板依據(jù) GB 4789. 10-2010《第二法鑒定可疑菌落》，即革蘭氏染色及血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。RPF平板血漿凝固酶陽性菌落為灰黑色菌落，外圍是一個(gè)渾濁沉淀環(huán)?？岂R嘉的金黃色葡萄球菌顯色平板根據(jù)說明書判斷，一般金黃色葡萄球菌為紫紅色菌落。3M金黃色葡萄球菌測試片上的金黃色葡萄球菌一般為紫紅色，如有黑色菌落則需使用反應(yīng)確認(rèn)片確定，即掀開測試片上層膜，將確認(rèn)片置入小心壓緊，不能殘留氣泡，36 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h后觀察結(jié)果，金黃色葡萄球菌會在菌落周圍出現(xiàn)粉紅色環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基選擇性比較

選擇性比較結(jié)果見表1。

10份樣品中，在BP平板上生長的菌落均為黑色，區(qū)分金黃色葡萄球菌主要看渾濁帶及透明圈的大小。當(dāng)平板上菌落數(shù)較少時(shí)，很容易從板上分辨出金葡菌，但菌落數(shù)達(dá)到100個(gè)左右時(shí)，由于采用涂布法，菌分布在培養(yǎng)基表面，不同菌落容易互相重疊，渾濁帶與透明圈交叉，影響典型菌落的計(jì)數(shù)。顯色平板和3M測試片的典型菌落均為紫紅色，與非金葡菌區(qū)分開來。在RPF平板上生長的菌落也是黑色的，血漿凝固酶陽性的菌落會在外圍形成渾濁帶，用于區(qū)分金黃色葡萄球菌。RPF平板與BP平板相似，同樣存在平板上菌落較多時(shí)渾濁帶互相影響導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。四種培養(yǎng)基檢出金黃色葡萄球菌的數(shù)量見表2。

2.2 測試結(jié)果

使用SPSS軟件分析以上結(jié)果，BP平板的測試結(jié)果與顯色平板（P=0.747＞0.05）、3M紙片（P=0.826＞0.05）、RPF平板（P=0.909＞0.05）無顯著性差異。

3 結(jié)論

從此次考核樣品結(jié)果來看，金黃色葡萄球菌的濃度范圍在103～104，這個(gè)范圍落在了GB 29921-2013設(shè)定金黃色葡萄球菌最高安全限量值M內(nèi)，具有日常檢驗(yàn)的參考意義。在此濃度范圍內(nèi)，使用BP平板、顯色平板和RPF平板作涂布法檢測結(jié)果與3M紙片法結(jié)果相當(dāng)，無顯著差異。由于涂布法使用涂布棒會帶走一部分菌體，所以理論上直接加樣的3M紙片結(jié)果會比涂布法高。要降低涂布帶來的菌體損失，使用疏水材質(zhì)的一次性涂布棒。

對比幾種培養(yǎng)基，3M金黃色葡萄球菌測試片操作方便，能夠縮短檢測時(shí)間，易于觀察。但樣品出現(xiàn)黑色菌落時(shí)，需要附加使用反應(yīng)確認(rèn)片確認(rèn)，菌量較多時(shí)粉紅色暈圈的重疊現(xiàn)象會影響觀察，此時(shí)需要加大稀釋度。顯色平板同樣具有縮短檢測時(shí)間，結(jié)果容易觀察，可采用傾注法和涂布法實(shí)驗(yàn)。顯色培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，直接加熱溶解即可，能減少工作量。金黃色葡萄球菌在科馬嘉顯色培養(yǎng)基上為粉紅色菌落，雜菌一般為藍(lán)綠色菌落及白色菌落，易于區(qū)分，無需實(shí)驗(yàn)。RPF培養(yǎng)基與BP培養(yǎng)基類似，以氯化鋰和亞碲酸鉀抑制非葡萄球菌生長，但RPF培養(yǎng)基添加牛纖維蛋白原和兔血漿，能使血漿凝固酶陽性葡萄球菌形成灰黑色菌落，周圍有乳白色沉淀環(huán)，直觀區(qū)分血漿凝固酶陽性菌落，不需如BP培養(yǎng)基可疑的菌落，純培養(yǎng)做血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，大大節(jié)省時(shí)間。不過RPF培養(yǎng)基也存在當(dāng)菌落數(shù)較大時(shí)沉淀環(huán)互相重疊影響觀察的問題，需要通過多做稀釋度控制平板上菌落數(shù)量。

表1 選擇性比較結(jié)果

表2 四種培養(yǎng)基檢出金黃色葡萄球菌的數(shù)量

雖然3M測試片、顯色培養(yǎng)基和RPF培養(yǎng)基對比BP培養(yǎng)基均具有一定優(yōu)勢，但成本高于BP培養(yǎng)基。BP培養(yǎng)基在檢測實(shí)驗(yàn)室中通常只需購買基礎(chǔ)，再用雞蛋與亞碲酸鉀加入即可配好，其他三種培養(yǎng)基則需要直接購買成品，不利于控制成本，而且不是GB 4789.10-2010中指定的培養(yǎng)基，不能用于此方法數(shù)據(jù)的出具。但在使用BP培養(yǎng)基進(jìn)行檢測的同時(shí)，可以附加幾種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)，既可縮短檢測時(shí)間，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1]劉海卿,佘之蘊(yùn),陳丹玲,等.金黃色葡萄球菌三種定量檢驗(yàn)方法的比較[J].食品研究與開發(fā),2014,35(13):113-115.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.GB 29921-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.10-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.