響應面法優(yōu)化薏仁米糠蛋白堿提工藝的研究

任勰珂，陳莉*，盧紅梅，賈青慧

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025）

響應面法優(yōu)化薏仁米糠蛋白堿提工藝的研究

任勰珂1，2，陳莉1，3*，盧紅梅1，3，賈青慧2，3

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025）

該試驗以貴州興仁縣產(chǎn)純種小薏仁米米糠作為研究對象，采用堿提酸沉法提取薏仁米糠中的蛋白質(zhì)?？疾炝弦罕?、堿提溫度、堿提時間、堿提pH對蛋白提取率的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用4因素3水平響應面優(yōu)化試驗，并對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，建立各因素對提取率的二次多項式回歸預測模型，確定最佳堿提工藝參數(shù)。結(jié)果表明，堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白最佳提取工藝為料液比1∶22（g∶m L），堿提溫度45.5℃，堿提時間3 h，堿提pH9.6，平均蛋白提取率為78.9%。

薏仁米糠蛋白；提取率；堿提酸沉法；響應面優(yōu)化

薏仁米在加工成精米的過程中需去掉外殼和占總質(zhì)量10%左右的種皮和胚[1]，種皮和胚加工制成的米糠是薏仁米加工的主要副產(chǎn)品[2]。米糠在國外被稱為“天賜營養(yǎng)源”[3]，含有米糠蛋白、米糠油、米糠多糖、米糠植酸鈣等多種營養(yǎng)成分[4-6]，具有較高的保健開發(fā)價值。貴州省薏仁米資源豐富，但目前大多加工企業(yè)還屬于粗放型加工，精深加工缺乏，生產(chǎn)設備落后、技術(shù)不完善[7]，大量的糠殼等副產(chǎn)物僅作為低值產(chǎn)品直接處理銷售[8]，綜合利用不充分，給薏仁米生產(chǎn)加工企業(yè)造成了較大損失。

本研究采用貴州興仁縣產(chǎn)純種小薏仁米米糠作為研究對象，采用堿提酸沉法提取薏仁米糠中的蛋白質(zhì)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應面法優(yōu)化堿提酸沉法提取工藝，確定最佳提取工藝參數(shù)，用Design-Expert軟件建立各因素對提取率的二次多項式回歸預測模型，以期為薏仁米糠蛋白的提取和利用提供依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，對推動貴州省薏仁米產(chǎn)業(yè)向精深加工方向發(fā)展具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

薏仁米糠：貴州興仁縣興誠華英食品有限公司，將薏仁米糠粉碎后（粉碎度為50～300目）用30～60℃沸程的石油醚以1∶3（mg/m L）的比例在室溫條件下振蕩脫脂3 h，過濾，并用石油醚沖洗，放于通風廚中風干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、硼酸、濃鹽酸、濃硫酸、石油醚、硫酸鉀等（均為分析純）、牛血清白蛋白（生化試劑）：天津市瑞金特化學品有限公司。

雙縮脲試劑：1.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500m L蒸餾水中，在攪拌條件下加入300m L 10%NaOH溶液，用水稀釋至1 000m L，此試劑可長期保存。

1.2 儀器與設備

SH220石墨消解儀：濟南海能儀器股份有限公司；CMD-20X恒溫鼓風干燥箱：上?，槴\試驗設備有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；ZD-2A自動電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；FW-80萬能粉碎機：上海仕元科學器材有限公司；722S可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；80-2電動離心機：常州澳華儀器有限公司；CJJ-781磁力加熱攪拌器：城西曉陽電子儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 薏仁米糠蛋白提取工藝流程

脫脂薏仁米糠→堿液浸泡提取→離心→上清液等電點沉淀→靜置、離心→沉淀物→水洗至中性→真空干燥→薏仁米糠蛋白

1.3.2 單因素試驗

固定其他條件不變，分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶m L））；堿提pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）；堿提溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）；堿提時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h）對薏仁米糠蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以薏仁米糠蛋白提取率（Y）為評價指標，采用Box-Behnken中心組合設計原理，設計4因素3水平的響應面優(yōu)化試驗[9]，對堿提pH（A）、堿提溫度（B）、堿提時間（C）、料液比（D）進行響應面分析，因素與水平如表1所示。再用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，對所得模型進行失擬性檢驗、方差分析[10]，確定堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白的最佳工藝條件。

表1 堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction conditions optim ization o f adlay bran protein by alkaliextraction and acid precipitation method

1.3.4 測定方法

薏仁米糠蛋白等電點的確定：取蛋白提取液20m L，用15%HCl溶液調(diào)節(jié)pH值分別為3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，4 000 r/min離心15min，采用雙縮脲法測出各上清液的蛋白含量，以pH為橫坐標，蛋白質(zhì)量濃度（mg/m L）為縱坐標，繪制蛋白質(zhì)量濃度-pH標準曲線。

蛋白含量：參照參考文獻[11]的方法進行測定。蛋白提取率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 薏仁米糠蛋白等電點確定

2.1.1 牛血清蛋白標準曲線

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum album in

由圖1可知，牛血清白蛋白質(zhì)量濃度在0～10mg/m L范圍內(nèi)與吸光度值具有良好的線性關(guān)系，標準曲線的線性回歸方程為y=0.053 7x-0.008 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

2.1.2 薏仁米糠蛋白等電點測定

圖2 薏仁米糠蛋白等電點測定結(jié)果Fig.2 Determ ination resu lts of isoelectric point of adlay bran protein

由圖2可知，蛋白提取液在不同pH條件下，經(jīng)離心沉淀后，當pH值為4.2時上清液中殘留的蛋白質(zhì)量濃度最低，為2.526mg/m L，表明在此pH條件下大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀，因此薏仁米糠蛋白等電點為pH4.2。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對薏仁米糠蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在料液比為1∶10（g∶m L）時，提取率最低為46.99%；在料液比為1∶20（g∶m L）時，薏仁米糠蛋白提取率達最大值為76.63%，這可能是因為在料液比較低時，提取液黏度較大，分子擴散速率較低，則蛋白分子溶出率低，導致提取率較低；隨著料液比的增大，提取液黏度降低，蛋白分子溶出率增加，提取率增加[18]。繼續(xù)增大料液比，蛋白提取率反而下降。因此選擇料液比為1∶20（g∶m L）進行后續(xù)試驗。

圖3 料液比對薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effect ofm aterial-liquid ratio on extraction rate of ad lay bran protein

2.2.2 堿提pH對薏仁米糠蛋白提取率的影響

圖4 堿提pH對薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of alkaliextraction pH on extraction rate of adlay bran protein

由圖4可知，隨著堿提pH值的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在pH值為7.5時，薏仁米糠蛋白提取率較低；當pH值為9.5時，薏仁米糠蛋白提取率達到最高為77.04%，可能是因為薏仁米糠蛋白中大量的二硫鍵和疏水基團使其溶解性下降，而堿液對蛋白質(zhì)分子中氫鍵具有破壞作用，并可使某些極性基團發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)表面分子帶相同電荷，從而提高蛋白質(zhì)分子的溶出，所以隨著pH的不斷增大，薏仁米糠蛋白的提取率也不斷增大[12]。但pH過高，會對蛋白質(zhì)量造成不良影響，降低其營養(yǎng)價值，因此選擇堿提pH為9.5進行后續(xù)試驗。

2.2.3 堿提溫度對薏仁米糠蛋白提取率的影響

由圖5可知，隨著堿提溫度的升高，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在35～45℃時，隨著溫度的增加，薏仁米糠蛋白提取率增加，當堿提溫度為45℃時，薏仁米糠蛋白提取率達到最高為48.54%；繼續(xù)升高堿提溫度，薏仁米糠蛋白提取率有所下降，這可能是熱動能的增加，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開、非極性集基團暴露，聚集和沉降作用使蛋白溶解度降低[13]。因此選擇堿提溫度為45℃進行后續(xù)試驗。

圖5 堿提溫度對薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of alkaliextraction temperature on extraction rate of adlay bran protein

2.2.4 堿提時間對薏仁米糠蛋白提取率的影響

圖6 堿提時間對薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of a lkaliextraction time on extraction rate o f ad lay bran protein

由圖6可知，隨著提取時間的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當堿提時間為3.0 h時，薏仁米糠蛋白提取率達到最高為57.05%；繼續(xù)延長堿提時間，薏仁米糠蛋白提取率逐漸降低。出現(xiàn)這樣的變化趨勢可能是因為隨著時間的延長，薏仁米糠蛋白不斷被溶出，提取率不斷增加，達到一定的時間，溶解量達到最大值，繼續(xù)延長時間，部分蛋白發(fā)生水解，導致提取率降低[14-16]。因此選擇堿提時間為3.0 h進行后續(xù)試驗。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗結(jié)果

用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得料液比（A）、堿提pH（B）、堿提溫度（C）、堿提時間（D）的二次多項回歸方程為：Y=82.71+3.54A+1.47B+0.65C+ 2.46D+1.76AB-0.25AC-0.81AD-1.13BC-0.21CD-4.18A2-8.48B2-4.36C2-8.24D2。

由表4、表5可知，對所得模型進行失擬性檢驗、方差分析顯示：該模型的一次項和交互項顯著（P＜0.05），平方項和立方項不顯著（P＞0.05）。在本試驗所涉及范圍內(nèi)，模型的P值＜0.000 1，模型極顯著；失擬項P=0.109 0＞0.05，失擬項不顯著，方程擬合不足，檢驗不顯著，無其他因素影響本試驗，說明該模型能夠較好的反應各個因素的變化對薏仁米糠蛋白提取率造成的影響。由F值可得，各個因素對蛋白提取率影響的主次順序為：料液比＞堿提時間＞堿提pH＞堿提溫度。各系數(shù)方差分析結(jié)果表明，料液比、堿提pH影響極顯著（P＜0.01），堿提時間影響顯著，堿提溫度影響不顯著；在交互作用中，堿提pH和堿提溫度交互作用顯著（P＜0.05），其他交互作用均不顯著（P＞0.05）；在二次項中，堿提pH、堿提溫度、堿提時間、料液比影響都極顯著（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 模型的失擬性檢驗Table 4 Loss-faulty determ ination of the model

表5 二次多項式模型的方差分析Table 5 Variance analysis of quadratic polynom ialm odel

2.3.2 響應面最優(yōu)結(jié)果

為了進一步研究相關(guān)變量間的交換作用以及確定最優(yōu)點，通過Design-ExpertV8.0.6軟件繪制響應面曲線圖進行可視化分析，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，6組以薏仁米糠蛋白提取率為響應值的趨勢圖，其等高線圖可直觀反應出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。由圖7可知堿提pH和堿提溫度的交互作用對蛋白提取率的影響最為顯著（P＜0.05）。以蛋白提取率最大為目標，應用響應面分析軟件進行預測，對各因素在試驗范圍內(nèi)進行最優(yōu)化處理，得到薏仁米糠蛋白堿提酸沉法最佳提取工藝為料液比1∶21.74（g∶m L），酶解溫度45.49℃，堿提時間2.96 h，堿提pH9.62，在此條件下薏仁米糠蛋白平均提取率為80.39%。

2.3.3 最佳工藝條件的驗證

為了進一步驗證模型預測的最佳工藝條件的準確性，并且為了方便實際操作，將提取工藝修正為料液比1∶22（g∶m L），堿提溫度45.5℃，堿提時間3 h，堿提pH 9.6。在上述最佳工藝條件下，進行3次驗證試驗，得到薏仁米糠蛋白提取率分別為78.2%、79.3%，79.2%，平均提取率為78.9%，與模型理論值相接近。說明利用該模型可以較好的預測薏仁米糠蛋白的提取條件。

圖7 料液比、堿提時間、堿提pH、堿提溫度交互作用對薏仁米糠蛋白提取率影響的響應面圖及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between material-liquid ratio,alkaliextraction time, pH and temperature on extraction rate of adlay bran protein

3 結(jié)論

本試驗利用薏仁副產(chǎn)物—薏仁米糠，通過堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白。運用Design-Expert建立各因素對提取率的二次多項式回歸預測模型，并提取工藝進行響應面優(yōu)化。試驗表明料液比、堿提pH影響極顯著（P＜0.01），堿提時間影響顯著（P＜0.05），堿提pH和堿提溫度交互作用顯著P＜0.05），這幾個因素對蛋白提取率的影響非簡單的線性關(guān)系。經(jīng)回歸分析及檢驗表明，此法合理可行，最佳工藝條件為料液比1∶22（g∶m L），堿提溫度45.5℃，堿提時間3 h，堿提pH 9.6。此最佳條件下平均蛋白質(zhì)提取率為78.9%。

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Optim ization ofalkaliextraction processofadlay bran protein by response surfacemethodology

REN Xieke1,2,CHEN Li1,3*,LU Hongmei1,3,JIA Qinghui2,3
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.College ofChem istry and Chem icalEngineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.Key Laboratory ofFermentation Engineering and BiologicalPharmacy ofGuizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using the adlay bran from Guizhou Xingren county as research object,the protein in adlay branwasextracted by alkaliextraction and acid precipitationmethod.The effectsofmaterial-liquid ratio,alkaliextraction temperature,timeand pH on protein extraction ratewere investigated.On the basis of single factor experiments,the quadratic polynom ial regressionmodelwas established by 4 factors and 3 levels response surface experimentsoptimizationandmultiple regression fittinganalysis.Theoptimum alkaliextraction conditionswere identified asmaterial-liquid ratio1∶22(g∶m l), alkaliextraction temperature45.5℃,time3 h and pH 9.6.Under the conditions,theaverage protein extraction ratewas78.9%.

adlay bran protein;extraction rate;alkaliextraction and acid precipitationmethod;responsesurfaceoptimization

TS201.3

0254-5071（2017）08-0099-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.022

2017-03-29

貴州省科技合作計劃（LH[2015]7668）

任勰珂（1992-），女，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵。

*通訊作者：陳莉（1981-），女，副教授，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。