多指標(biāo)綜合評分正交試驗法優(yōu)化熟地黃的炮制工藝Δ

屠萬倩，周志敏，張留記，#，劉曉苗，張 寶，崔偉峰，李開言，周 麗（.河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，鄭州 450004；.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450008）

多指標(biāo)綜合評分正交試驗法優(yōu)化熟地黃的炮制工藝Δ

屠萬倩1＊，周志敏2，張留記1，2#，劉曉苗2，張 寶1，崔偉峰1，李開言1，周 麗1（1.河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，鄭州 450004；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450008）

目的：優(yōu)化熟地黃的炮制工藝。方法：以梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷和多糖的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)進行綜合評分，以蒸制溫度（壓力）、蒸制時間和蒸制次數(shù)為考察因素，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化熟地黃的炮制工藝并進行驗證試驗。結(jié)果：熟地黃的最優(yōu)炮制工藝為在蒸制溫度125℃、蒸制壓力150 kPa下蒸制2次，每次2 h；驗證試驗中3批樣品的綜合評分分別為0.698 5、0.675 5、0.701 6，各指標(biāo)的RSD均小于5%（n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化的炮制工藝簡單、穩(wěn)定、可行，可為熟地黃的工業(yè)化炮制生產(chǎn)提供參考。

熟地黃；正交試驗；炮制工藝；多指標(biāo)；綜合評分

地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）的新鮮或干燥塊根。生地黃味甘、性寒，可用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血等。生地黃經(jīng)炮制后得到熟地黃，熟地黃味甘、性微溫，可用于血虛萎黃、心悸怔忡等[1]。地黃中含有多種化學(xué)成分，其中苷類和多糖為地黃的主要活性成分，具有降壓、利尿、保護心血管等多種作用[2-3]。根據(jù)文獻記載，將生地黃炮制成熟地黃的方法較多，有蒸制、酒制、姜汁制、砂仁制、蜜制等[4-5]。現(xiàn)代熟地黃的炮制以蒸、煮為主，不同的蒸制次數(shù)、時間、輔料、工藝等均可影響熟地黃的質(zhì)量[6-10]。熟地黃的傳統(tǒng)炮制工藝古法為“九蒸九曬”，該工藝煩瑣、耗時耗能，不適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。本試驗以地黃中的梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷等多種苷類和多糖為指標(biāo)進行綜合評分，采用正交試驗優(yōu)化出質(zhì)量接近傳統(tǒng)工藝且適用于現(xiàn)代化生產(chǎn)的熟地黃炮制工藝。

1 材料

1.1 儀器

2996高效液相色譜（HPLC）儀，包括2695分離單元、2996紫外檢測器、EmpowerⅡ色譜工作站（美國Waters公司）；UV-265FS紫外分光光度計、LIBROR-160DPT萬分之一分析天平（日本島津公司）；AE240十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Tolerdo公司）；手提式蒸汽壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；GT-350 W超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

生地黃于2016年購自河南省武陟縣，并經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院都恒青研究員鑒定為玄參科植物地黃的干燥塊根；梓醇對照品（批號：110808-201210，純度：≥98%）、D-無水葡萄糖對照品（以下簡稱葡萄糖，批號：833-201001，純度：≥98%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；地黃苷D對照品（批號：150412，純度：≥98%）、毛蕊花糖苷對照品（批號：151121，純度：≥98%）、異毛蕊花糖苷對照品（批號：150617，純度：≥98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為SynergiTMHydro-RP 80 ?（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）梯度洗脫（0→8 min，3%A；8→9 min，3%→4%A；9→25 min，4%A；25→35 min，4%→20%A；35→50 min，20%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為35℃；檢測波長分別為203 nm（0→30 min，測定梓醇、地黃苷D）、334 nm（30→50 min，測定毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷）；進樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備與線性關(guān)系考察 精密稱取梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對照品適量，加水溶解并制備成質(zhì)量濃度分別為0.012、0.030、0.021、0.018 mg/mL的混合對照溶液。精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入HPLC儀、測定，以峰面積（y）對進樣量（x）進行回歸計算，得4種苷類成分的線性范圍和回歸方程，詳見表1。

表1 4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Investigation results of linear ranges of 4 ingredients

2.1.3 供試品溶液的制備及含量測定 取地黃粗粉約0.8 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）提取1 h，放至室溫；再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾；精密量取續(xù)濾液20 mL，濃縮至近干，殘渣加20 mL水溶解；通過D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑約1.8 cm，柱高約6 cm），依次以水、80%乙醇洗脫，棄去水洗液，收集80%乙醇洗脫液，水浴蒸干；殘渣加流動相溶解并定容至10 mL量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

精密吸取各供試品溶液10 μL，注入色譜儀，測定各成分的峰面積并計算含量，混合對照品溶液與供試品（正交試驗中6號）溶液的色譜圖見圖1。

2.2 多糖的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取葡萄糖對照品5.96 mg，加水溶解并定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為0.119 2 mg/mL的對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.2 供試品溶液的制備 取地黃粗粉約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加80%乙醇40 mL，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）提取2次，每次1 h；提取后過濾，棄去溶劑，殘渣揮干溶劑后，加入40 mL水，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）提取2次，每次0.5 h，濾過，合并濾液，定容至100 mL量瓶中，即得。

2.2.3 標(biāo)準曲線的繪制及樣品含量測定 精密量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，置于60℃水浴中加熱10 min，取出置于冷水中冷卻5 min。另以2 mL水作空白，在490 nm波長處測吸光度，以質(zhì)量濃度（x）與吸光度（y）作線性回歸，得回歸方程為y＝12.034x+0.235 3（r＝0.996 9），結(jié)果表明葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.005 96～0.059 6 mg/mL。

精密吸取正交試驗的各樣品溶液0.5 mL，加水至2 mL，按“2.2.3”項下方法操作，測定并計算各樣品中多糖的含量。

2.3 正交試驗優(yōu)化熟地黃的炮制工藝

2.3.1 因素與水平設(shè)計 參考文獻[6，11]及預(yù)試驗結(jié)果，選擇蒸制次數(shù)、蒸制時間、蒸制溫度/壓力為考察因素，各因素設(shè)計3水平，采用L9（34）進行正交設(shè)計。因素與水平見表2。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

2.3.2 正交試驗結(jié)果與分析 取生地黃按正交表安排試驗，按各試驗號的炮制工藝參數(shù)制備1～9號熟地黃樣品。取各試驗號樣品，分別按“2.1”和“2.2”項下方法操作，測定梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷和多糖的含量。同法測定試驗用生地黃中上述成分的含量，并按以下公式計算各成分相應(yīng)的轉(zhuǎn)移率：轉(zhuǎn)移率＝炮制品中待測成分的含量/生地黃中待測成分的含量× 100%。將梓醇（X1）、地黃苷D（X2）、毛蕊花糖苷（X3）、異毛蕊花糖苷（X4）和多糖（X5）的轉(zhuǎn)移率進行綜合評分，評分時以各指標(biāo)的最大值為參照，將數(shù)據(jù)進行歸一化后設(shè)定不同權(quán)重，X1、X2、X3、X4、X5權(quán)重分別為0.15、0.15、0.15、0.15、0.40。綜合評分＝0.15X1i/X1max+0.15X2i/X2max+0.15X3i/ X3max+0.15X4i/X4max+0.40X5i/X5max（X1i、X2i、X3i、X4i、X5i分別為i試驗號的相應(yīng)結(jié)果，i＝1，2，3…9；X1max、X2max、X3max、X4max、X5max分別為相應(yīng)指標(biāo)的最大值）。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Design and results of test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Result of variance analysis

由直觀分析和方差分析可知，各因素影響大小順序為B＞A＞C，B有極顯著影響（P＜0.01），A有顯著影響（P＜0.05），C無顯著影響（P＞0.05）；最優(yōu)炮制工藝為A2B2C3，即生地黃在125℃、壓力150 kPa下蒸制2次，每次2 h。

2.3.3 驗證試驗 稱取生地黃藥材3份，每份約200 g，置于手提式蒸汽壓力滅菌器中于125℃、150 kPa蒸制2次，每次2 h；將所得熟地黃干燥后粉粹，分別按照“2.1”“2.2”項下方法進行測定，結(jié)果3次試驗中4種苷類成分及多糖轉(zhuǎn)移率的RSD均小于5%，表明該炮制工藝條件合理、穩(wěn)定可行，詳見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果（n＝3）Tab 5 Results of verification test（n＝3）

3 討論

熟地黃的傳統(tǒng)炮制方法“九蒸九曬”所得熟地黃“色黑如漆，味甘如飴”，由于操作煩瑣、炮制費時，在藥材市場上很難找到“九蒸九曬”法炮制的熟地黃?，F(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)為節(jié)省時間、節(jié)約資源，通常采用高壓一次蒸制后再烘干的方法炮制熟地黃，且對蒸制時間、溫度、輔料用量均沒有準確規(guī)定，僅憑經(jīng)驗或外觀性狀檢查控制炮制工藝參數(shù)，導(dǎo)致市售熟地黃質(zhì)量參差不齊。近年來有以單一化學(xué)成分為考察指標(biāo)，對熟地黃的炮制次數(shù)或炮制過程中指標(biāo)性成分變化進行研究的報道[12-14]，但鮮有將現(xiàn)代工藝與傳統(tǒng)方法進行比較或采用現(xiàn)代炮制設(shè)備模擬傳統(tǒng)炮制方法的研究報道。本試驗選用多種苷類成分與多糖為考察指標(biāo)，綜合優(yōu)化可適用于現(xiàn)代炮制加工設(shè)備的熟地黃炮制工藝。

在本試驗中，筆者參考文獻[15-16]，建立了測定地黃中梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷含量的HPLC法。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，待測成分均在各自的最大吸收波長下進行測定，保證了測定的靈敏度；通過預(yù)試驗比較了在以乙腈-水、乙腈-0.5%冰乙酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液等為流動相的梯度洗脫條件下待測成分之間以及與雜質(zhì)峰的分離情況，結(jié)果以本試驗所選流動相進行梯度洗脫時，待測成分分離度較好、基線平穩(wěn)。而地黃中多糖的含量則是參考文獻[17-18]采用硫酸苯酚法顯色后的紫外法進行測定。

另外，在對正交試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)，在炮制過程中，4種苷類成分含量出現(xiàn)不同變化，這可能與各自化學(xué)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有密切關(guān)系。根據(jù)正交試驗結(jié)果可知，梓醇在炮制加熱過程中含量下降趨勢明顯，長時間或多次加熱后幾乎全部降解，與文獻[12]研究結(jié)果一致；地黃苷D在炮制2次、加熱2 h內(nèi)含量相對穩(wěn)定，而超出此范圍，則含量隨炮制次數(shù)和時間的增加下降明顯，提示地黃苷D破壞程度明顯增加；毛蕊花糖苷隨炮制次數(shù)的增加而含量減少，異毛蕊花糖苷含量隨蒸制次數(shù)增加而增加，但超過一定加熱時間后也會被破壞。同時，研究結(jié)果表明，熟地黃中的多糖含量隨炮制時間和溫度的增加，呈先上升后下降趨勢。而驗證試驗結(jié)果表明，生地黃經(jīng)炮制加工后梓醇已基本被破壞，毛蕊花糖苷和地黃苷D含量有不同程度的降低，而異毛蕊花糖苷和多糖的含量則大幅度增加，提示地黃炮制過程中有關(guān)化學(xué)成分發(fā)生了不同程度的變化和轉(zhuǎn)化，這在一定程度上可反映生地黃變成熟地黃后藥物性味變化的物質(zhì)基礎(chǔ)。關(guān)于地黃中化學(xué)成分的變化規(guī)律，還有待今后開展更多試驗進行研究。

將最優(yōu)工藝所得熟地黃與自制“九蒸九曬”熟地黃和市售熟地黃比較，結(jié)果最優(yōu)工藝所得熟地黃中4種苷類成分含量均高于市售熟地黃，并接近自制“九蒸九曬”熟地黃樣品，毛蕊花糖苷含量符合2015年版《中國藥典》（一部）中“熟地黃”項下有關(guān)規(guī)定；且熟地黃中多糖含量明顯高于市售熟地黃，與“九蒸九曬”多糖含量相近，可達到“色黑如漆，味甘如飴”的標(biāo)準。經(jīng)過3批工藝驗證試驗證明，優(yōu)化的熟地黃炮制工藝經(jīng)濟合理、穩(wěn)定可行，適用于工業(yè)化炮制生產(chǎn)熟地黃。

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Optimization of the Processing Technology of Rehmanniae Radix Praeparata by Muti-indexes Integrating Score-Orthogonal Test

TU Wanqian1，ZHOU Zhimin2，ZHANG Liuji1，2，LIU Xiaomiao2，ZHANG Bao1，CUI Weifeng1，LI Kaiyan1，ZHOU Li1（1.Institute of Chinese Medicine，Henan Academy of TCM，Zhengzhou 450004，China；2.College of Pharmacy，Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China）

OBJECTIVE：To optimize the processing technology of rehmanniae radix praeparata.METHODS：Using transfer rates of catalpol，rehmaionoside D，acteoside，isoacteoside，polysaccharide as indexes for comprehensive score，heating temperature（pressure），heating time and heating times as investigating factors，L9（34）orthogonal test was used to optimize the processing technology of rehmanniae radix praeparata，and verification test was conducted.RESULTS：The optimal processing technology of rehmanniae radix praeparata was as follow as heating temperature of 125℃，pressure of 150 kPa for twice，2 h every time.The comprehensive scores of 3 batches of samples were 0.698 5，0.675 5，0.701 6 in the verification test，respectively，RSDs were less than 5%（n＝3）.CONCLUSIONS：Optimized processing technology is simple，stable，feasible，and can provide reference for industrial production of rehmanniae radix praeparata.

Rehmanniae radix praeparata；Orthogonal test；Processing technology；Muti-indexes；Comprehensive score

R283

A

1001-0408（2017）22-3121-04

2016-11-24

2016-12-29）

（編輯：劉 萍）

國家中醫(yī)藥管理局重點研究室建設(shè)項目（No.0907291）；河南省重點科技攻關(guān)計劃項目（No.102102310018）

＊副研究員。研究方向：中藥分析及中藥開發(fā)。電話：0371-66331718。E-mail：wqtu632@126.com

#通信作者：研究員。研究方向：中藥質(zhì)量評價及中藥新藥開發(fā)。電話：0371-66331598。E-mail：zlj6666671@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.26