葛根素立方液晶的制備及在微針作用下的體外透皮特性研究

莫建民（湖州市第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江湖州 313000）

葛根素立方液晶的制備及在微針作用下的體外透皮特性研究

莫建民＊（湖州市第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江湖州 313000）

目的：制備葛根素立方液晶，研究其在微針作用下的體外透皮特性。方法：以單油酸甘油酯、乙醇、葛根素、純化水為材料，采用注入法制備葛根素立方液晶；用偏光顯微鏡和小角X射線衍射進行表征。采用改進的Franz擴散池比較葛根素10%乙醇水溶液和葛根素立方液晶的體外透皮特性；考察葛根素立方液晶在微針作用下的體外透皮特性。結(jié)果：所制葛根素立方液晶在偏光顯微鏡下無明顯晶體分布，呈暗綠色，顯各向同性；其散射峰位之比為，證明其內(nèi)部結(jié)構(gòu)為螺旋型晶格。葛根素10%乙醇水溶液和葛根素立方液晶的透皮速率分別為15.306、29.101 μg（/cm2·h），20 h內(nèi)的累積透皮量分別為190、545 μg/cm2；200 μm微針預(yù)處理皮膚后，葛根素立方液晶的透皮速率為78.15 μg（/cm2·h），20 h內(nèi)的累積透皮量為1 450 μg/cm2。結(jié)論：成功制得葛根素立方液晶，其具有較葛根素乙醇水溶液更強的透皮能力，且聯(lián)合微針給藥具有更好的透皮性能。

葛根素；立方液晶；制備；微針；體外透皮

葛根素是葛根中的有效成分之一，屬于黃酮類藥物，具有提高免疫、增強心肌收縮力、保護心肌細胞、降低血壓、抗血小板聚集、改善胰島素抵抗等作用[1-2]。但是葛根素有口服吸收較差、生物利用度低、注射給藥不良反應(yīng)多等缺點[3-4]。采用經(jīng)皮給藥制劑可避免肝首關(guān)效應(yīng)，維持持久的血液濃度，降低葛根素的毒副作用。

立方液晶是兩親性材料與水形成的溶質(zhì)液晶的一種相態(tài)[5]。作為藥物傳遞系統(tǒng)，該獨特的雙水道結(jié)構(gòu)和巨大的膜表面積使其具有多樣化的藥物包載性[6]。立方液晶凝膠具有促透皮及緩釋等特點。

微針給藥系統(tǒng)是近幾年來最熱門的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)之一，其可實質(zhì)性地打通皮膚孔道，增加藥物的透皮量[7]。筆者制備了葛根素立方液晶，并研究了其在微針作用下的體外透皮特性。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UV-3000紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；DM2500P偏光顯微鏡（德國Leica公司）；SAXSess小角X射線衍射儀（奧地利HMBG公司）。

1.2 藥品與試劑

葛根素原料藥（西安華萃生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20150115，純度：98%）；葛根素對照品（上海瑞楚生物科技有限公司，批號：20150322，純度：98.694%）；無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20140910）；單油酸甘油酯（美國杜邦集團丹尼斯克有限公司，批號：116703，純度：≥90%）；其余試劑均為分析純或藥用級。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量為（90±10）g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2009-0033。實驗前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周左右，室溫25℃，自由進食和飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 立方液晶中葛根素的含量測定

2.1.1 色譜條件 按文獻[8]中相應(yīng)方法進行測定。色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（含0.01%乙酸）（35∶65），流速：1.0 mL/min，檢測波長：252 nm，柱溫：20℃，進樣量：20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取葛根素對照品100 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇定容，得1.0 mg/mL的葛根素母液。取適量葛根素母液分別稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的葛根素對照品溶液，進樣測定。以葛根素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（c）、峰面積為縱坐標(biāo)（A）進行回歸分析，得回歸方程為A＝28 571c+9 152.1（r＝0.999 1，n＝5）。結(jié)果表明，葛根素檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為1.0～50.0 μg/mL。

2.1.3 精密度試驗 制備低、中、高質(zhì)量濃度（1.0、10.0、 50.0 μg/mL）的葛根素對照品溶液，進樣測定。每個濃度同日內(nèi)進樣5次，連續(xù)進樣3 d，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD分別為0.56%、1.32%、1.25%（n＝5），日間RSD分別為1.53%、1.87%、1.01%（n＝3）。

2.1.4 回收率試驗 分別量取低、中、高質(zhì)量濃度（1.0、10.0、50.0 μg/mL）的葛根素對照品溶液適量，按處方比例加入單油酸甘油脂混合均勻，進樣測定，計算回收率。結(jié)果，回收率分別為（98.56±5.4）%、（99.12± 4.1）%、（101.32±7.1）%（n＝3）。

2.1.5 樣品含量測定 精密稱取0.5 g葛根素立方液晶，置于100 mL量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣測定。結(jié)果，葛根素立方液晶中葛根素含量為（5.04±1.12）mg/g（n＝3）

2.2 葛根素立方液晶的制備

稱取6.4 g單油酸甘油酯，置于50 mL離心管中，加入0.6 mL乙醇，密封，60℃水浴融化30 min作為有機相；取50.83 mg葛根素原料藥溶于3 mL 60℃的去離子水中作為水相；在渦旋狀態(tài)下將水相緩慢滴加到有機相中形成葛根素含量約為5.0 mg/g的葛根素立方液晶。

2.3 葛根素立方液晶的表征

2.3.1 偏光顯微鏡 取葛根素立方液晶和未攪拌均勻的葛根素層狀液晶適量，在偏光顯微鏡下觀察其晶體分布，見圖1。

圖1 偏光顯微圖（×400）Fig 1 Polarized photomicrographs（×400）

由圖1可知，因為立方液晶具有各向同性，所以葛根素立方液晶在偏光顯微鏡下未見明顯的晶體分布，且顯暗綠色（圖中未顯現(xiàn)）[9]；而葛根素層狀液晶因具有各向異性，故能看到明顯的晶體分布[10]。

2.3.2 小角X射線衍射儀 將裝有葛根素立方液晶的樣品池，置于小角X射線衍射儀檢測室，抽真空至10－5Pa后，進行射線測定葛根素立方液晶的散射強度。以散射強度對散射因子（q）作圖得小角X射線衍射譜圖，見圖2。

2.4 體外透皮試驗

圖2 葛根素立方液晶的小角X射線衍射譜圖Fig 2 Small angle X ray diffraction spectrum of puerarin cubic phase

圖3 葛根素10%%乙醇水溶液和葛根素立方液晶的體外透皮曲線Fig 3 The in vitro transdermal curves of Puerarin 10%%ethanol solution and puerarin cubic phase

2.4.3 微針作用下葛根素立方液晶的體外透皮試驗 將“2.4.1”項下處理好的皮膚取出，用長度為200 μm的微針陣列施以5 N的力分別處理1 min后用于葛根素立方液晶透皮試驗，其他步驟同“2.4.2”項。結(jié)果顯示，微針預(yù)處理后，葛根素立方液晶的透皮速率為78.15 μg/（cm2·h），Q20h為1 450 μg/cm2，分別是未用微針處理時的2.69、2.66倍。這說明微針與立方液晶共同作用可顯著提高藥物的透皮特性。葛根素立方液晶及其微針作用下的體外透皮曲線見圖4。

圖4 葛根素立方液晶及其微針作用下的體外透皮曲線（±s，n＝3）Fig 4 The in vitro transdermal curves of puerarin cubic phase and under microneedle（±s，n＝3）

3 討論

立方液晶具有雙連續(xù)水區(qū)和脂質(zhì)區(qū)的閉合脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，有巨大的膜表面積，能包裹不同極性的藥物并可提高藥物的穩(wěn)定性。作為藥物的載體，立方液晶有兩大外用的優(yōu)勢，一是較高的原位生物黏附特性，二是具有良好的透皮吸收性能。而立方液晶透皮的主要機制是單油酸甘油酯能紊亂角質(zhì)層細胞間的脂質(zhì)排列，影響皮膚完整結(jié)構(gòu)而促進藥物經(jīng)皮吸收[13]。

常用的立方液晶制備材料有植烷三醇和單油酸甘油酯[14]。本研究選擇單油酸甘油酯，以注入法制備葛根素立方液晶。除水、乙醇、單油酸甘油酯三者用量影響立方液晶形成之外，能否均勻攪拌也是影響立方液晶形成的關(guān)鍵因素。同樣的處方，若沒有混勻，則可形成各向異性的層狀液晶。

微針陣列技術(shù)是一種新型的物理輔助經(jīng)皮給藥技術(shù)，其透皮機制是在很小的面積上，同時覆蓋數(shù)百根微針刺穿皮膚角質(zhì)層，打開給藥通路，允許藥物通過這個重要的屏障。本實驗結(jié)果顯示，在微針的作用下葛根素立方液晶的體外透皮效果與被動給藥時相比明顯提高。

葛根素臨床功效廣泛，但因為其偏親水性，一直未見有相關(guān)的外用制劑上市。立方液晶聯(lián)合微針陣列給藥可很好地促進藥物透皮吸收，有望成為葛根素的新型經(jīng)皮給藥系統(tǒng)。

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（編輯：鄒麗娟）

Preparation of Puerarin Cubic Phase and Study on Its in vitro Transdermal Characteristics under Microneedle

MO Jianmin（Dept.of Pharmacy，the First People’s Hospital of Huzhou City，Zhejiang Huzhou 313000，China）

OBJECTIVE：To prepare the puerarin cubic phase，and study its in vitro transdermal characteristics under microneedle.METHODS：Using glycerol monooleate，ethanol，puerarin and purified water as materials，injection method was used to prepare the puerarin cubic phase.Polarizing microscopy and small angle X-ray diffraction were used for characterizing.The in vitro transdermal characteristics of Puerarin 10%ethanol solution and puerarin cubic phase were comparatively studied by modified Franz diffusion cell，and the in vitro transdermal characteristics of puerarin cubic phase under microneedle were studied.RESULTS：Prepared puerarin cubic phase had no obvious phase distribution under polarizing microscope with dark green color，showing isotropic trait.The ratio of scattering peak position wasindicating that its internal structure was spiral lattice.The transdermal rates of Puerarin 10%ethanol solution and puerarin cubic phase were 15.306，29.101 μg（/cm2·h），and the cumulative transdermal amounts within 20 h were 190，545 μg/cm2，respectively.After the pretreatment on skin by 200 μm microneedle，the transdermal rates of puerarin cubic phase was 78.15 μg（/cm2·h），and the cumulative transdermal amounts within 20 h was 1 450 μg/cm2. CONCLUSIONS：Puerarin cubic phase is successfully prepared，which shows stronger transdermal ability than puerarin ethanol aqueous solution and better transdermal ability when combined with microneedle administration.

Puerarin；Cubic phase；Preparation；Microneedle；in vitro transdermal

R943

A

1001-0408（2017）22-3132-04

2016-10-25

2017-01-09）

＊藥師。研究方向：藥物經(jīng)皮給藥系統(tǒng)。E-mail：903818262@qq. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.29