附睪上皮中單核吞噬細胞的研究進展①

馬斌芳 湯 臻 馬 赫 馮 瀟 李 臻

(第四軍醫(yī)大學組織學與胚胎學教研室，西安710032)

附睪上皮中單核吞噬細胞的研究進展①

馬斌芳 湯 臻②馬 赫 馮 瀟 李 臻

(第四軍醫(yī)大學組織學與胚胎學教研室，西安710032)

自20世紀60年代中期以來，許多研究人員對附睪的細胞和分子生物學進行了大量的研究,包括附睪的結(jié)構(gòu)、基因表達、蛋白合成與功能研究等，但是附睪的免疫學研究報道相對較少。附睪管上皮為假復(fù)層纖毛柱狀上皮，主要由主細胞、基細胞和亮細胞組成[1- 3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)附睪上皮中存在有單核吞噬細胞(Mononuclear phagocytes，MPs)，高度提示男性生殖管道和免疫系統(tǒng)之間存在著動態(tài)的串話調(diào)節(jié)[4]。

1 單核吞噬細胞(Mononuclear phagocytes，MPs)

1.1 MPs的來源和分化 長期以來人們認為，巨噬細胞(Macrophage，Mφ)和樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)來自血液中的單核細胞(Monocyte,Mo)，這一觀念在過去五年間被改變[5- 7]，譜系示蹤研究表明，穩(wěn)態(tài)環(huán)境下，大多數(shù)組織中定居的Mφ來源于胚胎發(fā)育期的髓系祖細胞，并在局部自我更新；而炎癥刺激后，循環(huán)的單核細胞進入組織并分化成Mφ和DC(圖1)。成人體內(nèi)DCs的分化方式如下:骨髓中的造血干細胞分化成普通單核祖細胞和普通樹突前體細胞，單核祖細胞進一步分化為單核細胞，后者經(jīng)過炎癥感染后分化為單核DCs(Mononuclear DCs,moDCs)和單核Mφ(mononuclear Mφ,moMφ)；而樹突前體細胞進一步分化為DCs，最終形成經(jīng)典DCs(classical DCs,cDCs)和漿細胞樣DCs(plasmacytoid DCs,pDCs)[8]。每一個器官，在特定的微環(huán)境及其與外部環(huán)境動態(tài)作用下，形成高度特異性的MPs亞群[7]。因此，大多數(shù)外周器官都含有不同起源和表型的Mφ和DCs亞群，有些Mφ具有器官特異性的名稱，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞、肝臟的庫普弗細胞、肺臟中的塵細胞、皮膚的朗格漢斯細胞。DCs在不同組織也有不同名稱，如:輸出淋巴管中的面紗細胞，淋巴結(jié)中的濾泡樹突狀細胞等。

1.2 MPs的特性 Mφ和DCs是具有多種功能的免疫細胞，屬于MPs中的不同家族，是專職抗原提呈細胞(Antigen- presenting cells,APCs)，可內(nèi)化外源性和內(nèi)源性的抗原，與主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)結(jié)合，形成抗原肽- MHC復(fù)合物表達在細胞表面并提呈給T細胞，刺激細胞毒性T細胞或輔助T細胞的分裂和分化，在組織自穩(wěn)、防御感染、自身免疫及腫瘤等生理和病理狀態(tài)中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

Mφ的公認作用是對病原體、死亡細胞及其碎片的吞噬，被稱為免疫系統(tǒng)的清道夫，在機體固有免疫中發(fā)揮重要作用。其細胞質(zhì)較豐富，功能活躍時內(nèi)含許多顆粒和空泡，具有變形運動和吞噬能力，主要參與非特異性和特異性免疫?；罨蟮腗φ可分化為M1和M2兩個不同的亞群，M1型Mφ具有殺滅微生物及促炎癥作用；M2型Mφ具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用和組織修復(fù)能力但殺滅微生物功能很弱。在非特異性免疫中Mφ通過吞噬作用殺滅和清除病原體及異物，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而在特異性免疫中Mφ主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗原呈遞功能[9]。相比Mφ，DCs的吞噬能力較弱，但細胞表面積較大，MHC表達水平比Mφ高10～100倍，具有較強捕獲抗原和呈遞抗原的能力，是特異性免疫應(yīng)答的始動者，在獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[10]。cDCs存在多種功能特異的亞群，在外周非淋巴器官主要有CD103+DCs和CD11b+DCs兩種亞型，CD103+DCs是專職的抗原提呈細胞，提呈外源性的抗原給CD8+T細胞，在病原體防御、腫瘤等免疫耐受中發(fā)揮重要作用[11,12]，CD11b+DCs則主要表達高水平的MHC- Ⅱ分子，激活CD4+T細胞從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13]；pDCs則通過分泌干擾素參與抗病毒反應(yīng)[14]。

圖1 小鼠MPs發(fā)生分化簡圖Fig.1 Simplified classification of mouse mononuclear phagocytes based on their ontogeny

簡單區(qū)分Mφ和DCs并不能準確反映免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性。首先，Mφ和DCs包括多種密切相關(guān)的細胞亞型，不同類型細胞的發(fā)生和功能各異，人們通常應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測細胞表面標記來區(qū)分MPs的亞群，但有些表面標記物并不能作為某種細胞的單一特征而是同時表達于多種細胞(表1[15])。例如CD11c和MHC- Ⅱ通常作為標志物被用于鑒別淋巴組織中的DCs，但是外周非淋巴組織中的Mφ也同時表達CD11c和MHC- Ⅱ；其次，Mφ和DCs的個體發(fā)生仍然是有爭議的，二者在功能上也有所重疊，即DCs和Mφ都具有吞噬和抗原呈遞功能[8]’最后，這些細胞具有極大的可塑性，為了應(yīng)對變化的炎性環(huán)境，他們在形態(tài)、位置、表型和功能方面都在不斷地變化。

2 附睪上皮中的MPs

2.1 附睪上皮中MPs的分布 附睪是精子成熟和儲存的場所，其上皮屬于假復(fù)層纖毛柱狀上皮，主要由主細胞、亮細胞、狹窄細胞和基細胞(Basal cells,BCs)組成。這些細胞相互作用，共同維持一個相對穩(wěn)定的環(huán)境以利于精子獲得運動及受精能力[16- 18]。精子的成熟是一個復(fù)雜有序的過程，精子表達其他器官所沒有的抗原，不但要抵御外來病原體的侵襲還要防止自身免疫，因此除了上皮細胞，免疫細胞也存在于附睪，如:上皮內(nèi)淋巴細胞(又稱Halo細胞)和Mφ[19- 21]。由于BCs表達Mφ特有抗原，并且形態(tài)和Mφ相似，研究者一度將BCs和Mφ相混淆，認為BCs就是附睪中的Mφ并發(fā)揮免疫功能[22- 24]，后來Shum等[4]利用轉(zhuǎn)基因鼠(CD11c- EYFP50和CX3CR1- GFP51)結(jié)合流式細胞及成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)BCs和Mφ屬于完全不同的細胞，Mφ表達F4/80、CX3CR1和CD11c，而BCs表達KRT5。目前認為，附睪中存在著錯綜復(fù)雜的MPs網(wǎng)絡(luò)，MPs在附睪各段均有分布，且具有區(qū)域特異性[4]。在附睪起始段(Initial segment,IS),MPs(CD11c+、CX3CR1+)位于附睪上皮基底部，胞體緊貼基膜并伸出細長突起穿過上皮細胞到達管腔(圖2)；在頭尾部，MPs位于附睪基膜和上皮細胞之間。Mφ在附睪各段分布不均一，而DCs在IS的分布明顯比其他各段密集。Mφ在附睪頭部有短的細胞突起，尾部幾乎沒有突起，DCs在頭尾部均沒有突起。此外在附睪管間隙及結(jié)締組織膜上也存在少量Mφ和DCs。根據(jù)MPs的來源和分化，我們推測血液循環(huán)中的單核細胞和樹突前體細胞進入附睪分化為成熟的CX3CR1+CD11c+F4/80+Mφs和CD11c+CD103+DCs，而附睪中定居的Mφ可在局部自我更新(圖2)，但此部分Mφ來源于胚胎時期的髓系祖細胞還是血液中的單核細胞還有待進一步研究。

表1 鑒別小鼠MPs的細胞表面標記[15]

Tab.1 Most common cell- surface markers used to identify murine MPs[15]

MarkerAlternatenamesExpressionCD11bITGAM,Mac-1Leukocytesincludingmonocytes/macrophsgesandsubsetsofDCsCD11cITGAXOftendescribedasaDCmarker,CD11cisalsofoundonsubsetsofmonocytesandmacropha-ges,aswellassubsetsoflymphocytes,NKcellsandneutrophilsCD103ITGAEExpressedonintestinalIELsandsubsetsofDCsCX3CR1CX3CL1receptorExpressedonsubsetsofmonocytes,DCs,macrophages,NKcellsandT-cells.F4/80EMR1(human)F4/80isexpressedbymurinematuremacrophagesMHCclassⅡMHCclassⅡExpressedonprofessionalAPCs,includingDCsandmacrophages

Note：MPs.Mononuclear phagocytes;DCs.Dendritic cells;NK.Natural killer;IELs.Intraepithelial lymphocytes;APCs.Antigen- presenting cells;MHC.Major histocompatibility complex;ITGAM.Integrin alpha M;ITGAX.Integrin alpha X;ITGAE.Integrin alpha E.

圖2 穩(wěn)定狀態(tài)下小鼠附睪起始段中MPs的表型、分布及功能[15]Fig.2 Localization,phenotype and possible functions of MPs in steady[15]Note: Principal cells(gray),Clear or narrow cells(orange),BCs(red),lymphocytes(blue),MPs(green).

2.2 附睪上皮中MPs的生物學功能 MPs在淋巴器官以及外周非淋巴器官特別是小腸黏膜系統(tǒng)中的作用已被廣泛研究。相對于與外界相通的器官如小腸或呼吸道，附睪處于相對穩(wěn)定的環(huán)境，整個生育期附睪管腔被相對穩(wěn)定的附睪液占據(jù)，只有在發(fā)育期會有大量精子涌入，盡管如此，附睪上皮仍然必須建立一個相對穩(wěn)定的精子免疫防護機制。雖然很多學者都描述了Mφ和DCs在附睪中的存在，但是他們在附睪中的作用以及具體的免疫生理學機制目前尚不清楚。盡管小腸和附睪的環(huán)境不同，但他們的黏膜接受的是相似的免疫挑戰(zhàn)，因此我們結(jié)合MPs的基本功能以及其在小腸黏膜中的作用，推測MPs在附睪中具有維護附睪內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保證附睪精子正常成熟的作用。

2.2.1 維護血- 附睪屏障 血- 附睪屏障(Blood- epididymis barrier，BEB)由附睪上皮的緊密連接組成(圖2)，控制附睪管腔中的分子與外周血液和淋巴的相互作用，從而形成一種特定的環(huán)境，保護成熟中的精子不受外界的干擾，是附睪中天然的免疫生理屏障[25]。BEB功能的維持依賴于附睪上皮結(jié)構(gòu)的完整，任何對附睪上皮緊密連接造成的破壞都將造成附睪生理和免疫屏障的開放，從而造成管腔微環(huán)境的改變以及精子抗原的泄露[26]。研究證實，對凋亡細胞的清除在維護附睪上皮中起著非常重要的作用，清除有缺陷的上皮細胞有助于上皮屏障結(jié)構(gòu)的完整，保持附睪的自我免疫耐受，而清理不及時將會導(dǎo)致多種病理狀態(tài)以及自身免疫性疾病[15,27- 29]。Mφ和DCs是清除凋亡細胞的專職細胞，有趣的是在附睪上皮很少發(fā)現(xiàn)凋亡細胞而MPs卻分布很廣，提示附睪上皮存在著高效的清除機制[30]。另外附睪上皮中的巨噬細胞高表達CX3CR1，已知凋亡細胞會釋放“找到我”(find me)信號趨化吞噬細胞啟動吞噬，而CX3CR1是“find me”分子CX3CL1的受體[15]。

MPs在附睪中的清除機制在輸出小管結(jié)扎術(shù)(Efferent duct ligation，EDL)中被證實。EDL后，由于阻斷了睪丸液進入附睪的起始段，從而引起附睪近端上皮細胞廣泛的凋亡，這種急劇而大范圍的凋亡可影響B(tài)EB結(jié)構(gòu)的完整性[23,31]。然而研究者發(fā)現(xiàn)CX3CR1+CD11c+Mφ會通過表型和形態(tài)的改變對EDL造成的破壞做出快速反應(yīng)，吞噬凋亡的上皮細胞及其碎片，保持附睪上皮緊密連接的完整[32](圖2)。雖然EDL造成的這種凋亡在附睪正常生理中很少出現(xiàn)，但仍可以證實MPs在維持BEB穩(wěn)定中的作用。而生理狀態(tài)下上皮細胞的凋亡率很低，也可能在于Mφ有效的吞噬作用，使得上皮細胞能快速再生，防止其釋放一些細胞殘骸到附睪管腔，影響精子的成熟，具體機制還有待進一步研究[33]。

2.2.2 免疫監(jiān)視并介導(dǎo)附睪局部的免疫反應(yīng) 附睪最常見的病理反應(yīng)是由尿路感染引起的附睪炎，附睪腫瘤更是極為罕見。在過去，人們很少關(guān)注附睪的免疫生理學。雖然附睪管腔內(nèi)成分在整個生育期都保持相對恒定，但是附睪仍會受到致病菌的侵襲，特別是性傳播細菌和病毒，如沙眼衣原體、淋病奈瑟菌和大腸桿菌可以經(jīng)尿路引起附睪炎，從而引起暫時性或永久性的生育力改變[34，35]；附睪也易受到病毒入侵，如人類免疫缺陷病毒HIV[36]。男性生殖功能的維持依賴于生殖器官及生殖道強有力的固有免疫和獲得性免疫機制，雖然睪丸和附睪相鄰，但相對于附睪，睪丸很少有炎癥，表明睪丸的防御機制有附睪的參與，研究發(fā)現(xiàn)附睪可分泌大量的抑菌蛋白(β- 防御素)到管腔內(nèi)從而參與固有免疫應(yīng)答[37，38]。

鑒于Mφ和DCs的抗原提呈功能以及在附睪中的定位，其可能參與附睪的免疫監(jiān)視?？乖岢始毎?Antigen presenting cells，APs)捕獲并提呈抗原后誘導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答，其可直接或間接的攝取抗原，在起始段，CX3CR1+CD11c+上皮內(nèi)細胞可伸出長的突起直接獲得管腔中的抗原，而附睪管周的APs可協(xié)同上皮細胞攝取管腔中成分[39](圖2)。這種分工類似于其他的黏膜系統(tǒng)，如小腸，上皮中的杯狀細胞、CX3CR1+Mφ、CD11c+DCs相互作用參與管腔抗原的攝取與提呈[40,41]。雖然附睪和小腸中的黏膜系統(tǒng)處于不同的環(huán)境，但他們有著極其相似的Mφ和DCs的分布。

附睪還會受循環(huán)血液中病原體的入侵，嚙齒類動物附睪的血液供應(yīng)并不豐富，但在IS，附睪管周卻分布著密集的毛細血管網(wǎng)，包括有孔毛細血管[42,43]。IS的特征之一是具有較強的重吸收能力，睪丸液流經(jīng)輸出小管到達起始段時90%液體被重吸收，證明此處的毛細血管負責排出大量的液體，然而這個網(wǎng)絡(luò)是雙向的，IS處的毛細血管網(wǎng)除了重吸收附睪液外，或許也需要向附睪運輸一些營養(yǎng)物質(zhì)或者免疫細胞。雖然IS中毛細血管的的功能并不完全清楚，但是大量有孔毛細血管靠近附睪管可能會影響B(tài)EB的屏障功能。有趣的是，IS中Mφ和DCs尤其豐富，因此我們推測IS中的MPs不僅監(jiān)測管腔成分的變化，而且監(jiān)視血液中的抗原。在小腸，固有層中的CX3CR1+細胞和有孔毛細血管形成緊密聯(lián)系以獲取循環(huán)血液中的抗原，并提呈給CD8+T細胞誘導(dǎo)其分化[43]?；诟讲G和小腸黏膜的相似性，IS可能是附睪中免疫反應(yīng)極為活躍區(qū)，此處的Mφ和DCs可監(jiān)測附睪管腔成分的變化以及毛細血管網(wǎng)中血流的變化，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。因此，IS中BEB可視為附睪中的天然免疫屏障，而Mφ和DCs是保護屏障的“衛(wèi)士”。附睪的這種高度免疫活性可保護睪丸這個“免疫赦免”器官，使其免受病原體的入侵[44]。

2.2.3 誘導(dǎo)對精子抗原的免疫耐受 免疫系統(tǒng)的首要任務(wù)是保持對有害病原體的免疫防御和對自身抗原的免疫耐受之間的平衡。免疫耐受是與固有免疫和獲得性免疫完全不同的免疫機制，分中樞耐受和外周耐受。中樞耐受形成于胚胎時期或免疫系統(tǒng)發(fā)育早期的胸腺和骨髓，涉及淋巴細胞識別和清除自身抗原，從而避免免疫系統(tǒng)對自身抗原的免疫反應(yīng)。而外周耐受形成于T/B淋巴細胞成熟以后，有多種細胞和分子的參與，包括MPs[15]。生精細胞和成熟中的精子從青春期開始出現(xiàn)于生殖系統(tǒng)，表達機體其他部位沒有的抗原，而此時中樞耐受已建立很長時間，所以當精子以1 000個/秒出現(xiàn)在附睪中時對于免疫系統(tǒng)來說是一個挑戰(zhàn)[34,45]，對精子抗原的自我免疫將導(dǎo)致不育，因此附睪在整個生育期必須有一個強大的耐受機制[34,45]，這種機制稱為外周耐受[46]。在小腸，CD103+DCs通過與上皮細胞或上皮中的Mφ相互作用，直接或間接地捕獲抗原，然后在CCR7的作用下遷移到淋巴結(jié)，誘導(dǎo)CD4+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)的發(fā)展分化，Treg可表達轉(zhuǎn)錄因子FoxP3+，抑制效應(yīng)T細胞的活化，從而避免對自身抗原或無害抗原的免疫反應(yīng)[40,41,47]。附睪近段上皮密集分布著和在小腸黏膜中極為相似的MPs，上皮內(nèi)的CX3CR1+Mφ可伸出長的突起到達管腔[4]，新近研究證實CX3CR1+CD11c+Mφ具有吞噬功能，表明他們可以直接攝取附睪管腔中的可溶性抗原或微粒[39]，因此我們推測Mφ可以直接獲取精子抗原，或者改變附睪上皮細胞頂部的緊密連接，通過滲透間接獲得精子成分，并通過與附睪上皮中的CD11c+CD103+DCs相互作用啟動免疫耐受。而體外研究也證實從小鼠附睪分離的CD11c+MPs具有抗原提呈作用[48]。

此外附睪中也存在多種免疫抑制因子，如IL- 10、轉(zhuǎn)化生長因子β、吲哚胺2，3加雙氧酶(Indolea- mine 2,3- dioxygenase，Ido)，Ido可通過調(diào)節(jié)色氨酸的分解代謝發(fā)揮免疫抑制作用，在小腸，CD11c+CD103+DCs可合成Ido，從而調(diào)節(jié)Treg的發(fā)展分化，參與小腸的口服免疫耐受[49]。在小鼠模型中破壞Ido可改變附睪的免疫平衡，影響精子的數(shù)量和質(zhì)量，然而CD103+DCs不是附睪中Ido的主要來源，Ido在DCs和Mφ中的作用還有待進一步研究[50]。

2.2.4 參與精子的質(zhì)量控制和附睪管的收縮 關(guān)于附睪上皮細胞監(jiān)測并清除異常精子，控制精子質(zhì)量這一學說一直備受爭議[51- 53]，有實驗證實，附睪管結(jié)扎或輸精管切除將會導(dǎo)致附睪上皮破裂、局部炎癥，最后大量精子和免疫細胞(包括巨噬細胞)聚集形成精子肉芽腫，雖然附睪中存在精子自噬以及異常精子的吞噬[51,54]，但目前還沒有確切證據(jù)證實Mφ在監(jiān)測和清除有缺陷精子這一生理活動中的作用。另外，最新研究顯示，小腸肌層的Mφ通過與腸神經(jīng)相互作用調(diào)節(jié)腸道的蠕動[55]，而精子在附睪中的運輸同樣需要附睪管的收縮，因此我們推測附睪管周的巨噬細胞可能與周圍神經(jīng)相互作用，參與附睪管的收縮，以利于精子在附睪中的運動。

3 結(jié)語

人們對哺乳動物附睪的研究已有半個世紀，但對精子的成熟調(diào)控機制卻知之甚少[56]。附睪的功能受其他器官系統(tǒng)以及附睪中免疫細胞的影響，表明男性生殖管道和免疫系統(tǒng)存在動態(tài)的串話機制。最近Mφ和DCs在附睪中的發(fā)現(xiàn)，使人們更加關(guān)注其在附睪中的生理學意義。人們致力于腸黏膜的研究已多年，相關(guān)黏膜免疫學知識在不斷更新，幸運的是Mφ和DCs在腸和附睪中的功能和形態(tài)的相似性，使得人們能利用在小腸中的發(fā)現(xiàn)去推測附睪黏膜免疫的功能。EBE在附睪中的免疫學意義已被普遍認可[43]，然而最新研究發(fā)現(xiàn)IS是附睪主要的免疫調(diào)節(jié)部位，MPs在IS密集分布且唯獨在此處伸出長的突起到管腔，精子離開睪丸后在此處與上皮細胞，包括上皮內(nèi)的MPs相互作用，因此IS被視為附睪中的“流式細胞分析儀”[15]。此外IS中淋巴管較少，推測IS并不是DCs遷徙和進行抗原提呈的主要部位，或者此處DCs遷徙和進行抗原提呈的效率非常高，稀疏的淋巴管就可以維持免疫平衡。而在附睪的頭體尾部，MPs分布在上皮基底部以及分散在管周間隙中，且沒有樹狀突起，說明并沒有直接獲取管腔抗原。有趣的是附睪尾部淋巴系統(tǒng)較為豐富，預(yù)示APCs除了IS也可在此處遷移到淋巴管中，因此在分析附睪獨特黏膜功能時，必須考慮MPs在附睪不同節(jié)段(輸出小管、頭、體、尾)上皮中的分布差異以及形態(tài)的多樣性。此外，Mφ和DCs在外周具有器官特異性，所以對Mφ和DCs及其他免疫細胞的研究必須在其各自相應(yīng)的環(huán)境中，雖然附睪MPs形態(tài)、表型與小腸、腎臟、小腦相似，但在附睪獨特微環(huán)境中的作用仍需進一步研究。

對附睪黏膜的研究不應(yīng)只關(guān)注生殖生理學作用，還應(yīng)進一步了解其在外周耐受和保護生殖管道不受病原體侵襲，以及保持附睪癌的極低發(fā)生率中的作用。研究附睪黏膜免疫學，將有助于闡明附睪免疫調(diào)節(jié)機制，進一步理解男性生殖調(diào)控并確定免疫避孕的有效靶點。

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[收稿2017- 02- 16]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.027

①本文為國家自然科學基金(No.31272606)和陜西省自然科學基金(No.2014JZ006,No.2016JM8084)資助項目。

馬斌芳(1982年-)，女，碩士，講師，主要從事男性生殖方面的研究，E- mail: zupeimbf@fmmu.edu.cn。

及指導(dǎo)教師：李 臻(1974年-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事男性生殖方面研究，E- mail:lizhenhe@fmmu.edu.cn。

Q492.4

A

1000- 484X(2017)08- 1246- 06

②共同第一作者，第四軍醫(yī)大學臨床醫(yī)學系，西安710032。