辛二酰苯胺異羥肟酸通過抑制組蛋白去乙酰化酶改善小鼠心肌肥厚的研究

彭昌，李碩，羅孝美，謝新星，肖明晨

辛二酰苯胺異羥肟酸通過抑制組蛋白去乙?；父纳菩∈笮募》屎竦难芯?/p>

彭昌，李碩，羅孝美，謝新星，肖明晨

目的：探討組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）改善小鼠心肌肥厚的作用，為防治心肌肥厚提供新思路。

方法：選取60只昆明小鼠，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、心肌肥厚組、心肌肥厚+ SAHA組,通過部分結(jié)扎小鼠胸主動脈建立心肌肥厚模型，最終每組納入6只。采用蘇木素伊紅（HE）染色觀察小鼠心肌細(xì)胞，超聲心動圖檢測小鼠心功能，比色法檢測HDAC活性，小鼠心肌組織中HDAC亞型HDAC5和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）信使核糖核酸（mRNA）和蛋白表達(dá)水平分別運用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）檢測。

結(jié)果：HE染色結(jié)果表明心肌肥厚組小鼠心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、細(xì)胞核深染。心肌肥厚組小鼠左心室舒張末期直徑、左心室舒張末期容積均顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05），而室間隔明顯較假手術(shù)組增厚（P＜0.05）。心肌肥厚組小鼠HDACs活性顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；心肌肥厚組HDAC5和β-MHC的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。SAHA能夠顯著降低HDAC5表達(dá)水平，顯著下調(diào)心臟肥厚相關(guān)基因β-MHC的表達(dá)并改善小鼠心功能和心肌肥厚（P 均 ＜0.05）。

結(jié)論：HDAC參與了心肌肥厚的發(fā)生，HDAC抑制劑SAHA通過抑制HDAC5的表達(dá)從而改善小鼠心肌肥厚。

組蛋白去乙?；?；心臟擴(kuò)大；治療結(jié)果

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:803.)

心肌肥厚是多種心臟疾病的必經(jīng)階段，如未及時控制，最終將發(fā)展為心力衰竭甚至猝死[1,2]。關(guān)于心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚，且目前的治療手段除了利尿、擴(kuò)血管等對癥處理外尚無有效改善心肌肥厚的特殊措施。研究表明，表觀遺傳的組蛋白乙?；揎椏赡軈⑴c了心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過程[3-5]。這提示我們從表觀遺傳的全新角度去探討心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制將有助于尋找心肌肥厚的干預(yù)新靶點。因此，本研究通過建立小鼠心肌肥厚模型深入探討組蛋白乙酰化調(diào)控在心肌肥厚中的作用，為心肌肥厚的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

將60只8～10周昆明小鼠（購置于遵義醫(yī)學(xué)院動物中心）隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、心肌肥厚組、心肌肥厚+辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）組，每組15只。心肌肥厚組給予部分結(jié)扎胸主動脈（約為胸主動脈直徑的2/3），心肌肥厚+ SAHA組除部分結(jié)扎胸主動脈外，同時給予SAHA[50 mg/（kg·d），Santa Cruz，Texas，美國]腹腔注射，每日1次連續(xù)注射30天，假手術(shù)組給予等量生理鹽水腹腔注射，正常組未予任何處理。除去手術(shù)及干預(yù)過程中死亡的小鼠，最終每組選6只小鼠納入實驗。

1.2 心臟標(biāo)本的制備

選取建模成功后的小鼠，二氧化碳麻醉處死，75%乙醇消毒并剖開胸腔，分離心臟放入預(yù)冷PBS液（KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.6，加水至1000 ml）中清洗后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要實驗方法

10 %水合氯醛腹腔麻醉小鼠后，運用Vevo 770高頻超聲行超聲心動圖檢查。檢查結(jié)束后剖開胸腔，取出心臟，置于4 %多聚甲醛溶液中4 ℃固定48 h切片進(jìn)行蘇木素伊紅（HE）染色。

心肌組織勻漿后，運用核蛋白提取試劑盒（Merck Millipore, 德國）提取核蛋白，參照文獻(xiàn)[6]運用比色法檢測試劑盒（GenMed，上海）檢測組蛋白去乙?；福℉DAC）活性，運用酶標(biāo)儀在450 nm波長范圍測量50 μg蛋白樣品量的光密度（OD）值，嚴(yán)格按照說明書操作。HDAC活性= OD值/50 μg蛋白。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：針對β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）和HDAC亞型HDAC5基因CDS核心編碼區(qū)設(shè)計引物，引物用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計，由寶生物公司合成。將基因產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀擴(kuò)增，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到R2值和擴(kuò)增效率。引物序列：β-MHC（F） 5' -TGAGACGGATGCCATACAGA-3', β-MHC（R） 5'-GCA GCCTGTGCTTGGTCTT-3'，產(chǎn)物大?。?76 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃ 30 s，變性：95℃5 s，退火延伸：58℃ 30 s，39個循環(huán)；HDAC5 （F）5’-CAATCATCGGTATGTCTGCG-3’，HDAC5 （R）5’- CCTGTCCATGACGTTGT GTGCA-3’，產(chǎn)物大?。?44 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃ 30 s，變性：95℃5 s，退火延伸：57℃ 30 s，39個循環(huán)。選取β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參，引物序列：β-actin （F）5’-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3’，β-actin（R） 5’-CCTGACAT TTGTTGGCA-3’，產(chǎn)物大?。?04 bp。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，59℃ 30 s，39個循環(huán)。所得數(shù)據(jù)用PCR儀自帶基于pfaffl原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件處理。

蛋白免疫印跡（Western blot）檢測：提取小鼠心肌組織核蛋白，8% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，聚偏氟乙烯（PVDF）膜半干轉(zhuǎn)膜后，5 %脫脂牛奶封閉1 h分別加入兔來源抗HDAC5和β-MHC單克隆抗體（Abcam，英國，1：1000）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔來源多克隆抗體（Abcam，英國，1：3000），4 ℃孵育過夜，TBST（2.42 g Tris堿，8.06 g NaCl，0.5 ml Tween-20溶于1000 ml蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5）洗滌3次，每次10 min，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔的二抗（中杉金橋，北京，1：5000） 脫色搖床上孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；運用Bio-Rad圖像分析儀進(jìn)行圖像掃描，采用Quantity One 4.4軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組小鼠心功能情況比較（±s）

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果表明：正常組和假手術(shù)組小鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞大小均勻一致（圖1A、1B），心肌肥厚組HE染色可見小鼠心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，細(xì)胞核變大，染色較深（圖1C）。但是，心肌肥厚+SAHA組小鼠心肌細(xì)胞較心肌肥厚組肥大有所減輕，細(xì)胞核也較心肌肥厚組變小，心肌細(xì)胞排列規(guī)則（圖1D）。

圖1 各組小鼠心肌組織蘇木素伊紅染色結(jié)果

2.2 各組小鼠心功能情況比較（表1）

超聲心動圖結(jié)果表明：心肌肥厚組小鼠心臟左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左心室舒張末期容積（LVEDV）均顯著低于假手術(shù)組（P＜ 0.05），室間隔（IVS）厚度在心肌肥厚組顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。而左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）和左心室收縮末期容積（LVESV）心肌肥厚組與假手術(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。而HDAC抑制劑SAHA能夠顯著提高LVEDD和LVEDV，心肌肥厚+ SAHA組與心肌肥厚組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.3 各組小鼠心肌組織中HDAC活性比較（表2）

比色法結(jié)果表明：心肌肥厚組小鼠心肌組織中HDAC活性明顯高于假手術(shù)組，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而HDAC抑制劑SAHA能夠顯著降低小鼠心肌組織中HDAC活性，心肌肥厚+SAHA組與心肌肥厚組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

表2 各組小鼠心肌組織中HDAC活性比較（±s）

2.4 各組小鼠心肌組織中HDAC5和β-MHC mRNA表達(dá)量比較（圖2）

RT-PCR結(jié)果顯示：HDAC5和心肌肥厚相關(guān)基因β-MHC mRNA表達(dá)水平在心肌肥厚組均顯著高于假手術(shù)組，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而心肌肥厚+ SAHA組HDAC5和β-MHC mRNA表達(dá)水平均顯著低于心肌肥厚組（P＜0.05）。2.5 各組小鼠心肌組織中HDAC5蛋白表達(dá)水平（圖3）

圖2 各組小鼠心肌組織中HDAC5和β-MHC mRNA表達(dá)量比較（n=6）

Western blot結(jié)果表明：心肌肥厚組小鼠心肌組織中HDAC5的蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），而心肌肥厚+ SAHA組小鼠心肌組織中HDAC5蛋白表達(dá)水平顯著低于心肌肥厚組（P＜0.05）。2.6 SAHA抑制心肌肥厚小鼠心肌組織中β-MHC蛋白表達(dá)（圖4）

圖3 各組小鼠心肌組織中HDAC5蛋白表達(dá)水平（n=6）

Western blot結(jié)果表明：心肌肥厚組小鼠心肌組織中心肌肥厚相關(guān)基因β-MHC的蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），而心肌肥厚+SAHA組小鼠心肌組織中β-MHC的蛋白表達(dá)量顯著低于心肌肥厚組（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠心肌組織中β-MHC蛋白表達(dá)水平（n=6）

3 討論

心肌肥厚是多種心臟疾病的病理過程，是心功能不全或心力衰竭之前的一個重要階段[7]。但對該病理過程發(fā)生發(fā)展的機(jī)理并不十分明確，也無確切有效的治療方法[8,9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)參與調(diào)控了這一過程，但表觀遺傳學(xué)研究內(nèi)容廣泛，其中的組蛋白乙?；禽^為重要的一種翻譯后修飾方式[10,11]。因此，本課題組通過部分結(jié)扎小鼠胸主動脈建立小鼠心肌肥厚模型，從表觀遺傳學(xué)的角度探討心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)心肌肥厚模型小鼠的心肌組織中HDAC活性顯著增高，尤其是HDAC5的表達(dá)水平在心肌肥厚的小鼠心肌組織中顯著增高，這提示HDAC可能參與了心肌肥厚（梗阻性或壓力超載性）的發(fā)生、發(fā)展，這與其他報道相一致[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)，心臟發(fā)育相關(guān)基因受到組蛋白乙?；{(diào)控，且組蛋白乙?；徒M蛋白去乙酰化是體內(nèi)共同維持基因穩(wěn)態(tài)的一對重要修飾方式，其在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持是保證機(jī)體正常生理機(jī)能得以進(jìn)行的基本因素[14,15]。HDAC的主要作用是使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，不利于基因轉(zhuǎn)錄，而組蛋白乙?；缸饔谜孟喾碵16]。本研究發(fā)現(xiàn)HDAC活性在心肌肥厚小鼠心肌組織中是顯著增高的，而心肌肥厚相關(guān)基因β-MHC的表達(dá)也是顯著增高的。生理狀態(tài)下，組蛋白去乙?；且种苹虻霓D(zhuǎn)錄表達(dá)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDAC及其亞型HDAC5的表達(dá)水平是顯著升高的，理論上應(yīng)該是抑制β-MHC基因的表達(dá)（β-MHC呈低表達(dá)），而我們的結(jié)果正好與此相反（β-MHC呈高表達(dá)），表明該實驗結(jié)果與生理狀態(tài)下組蛋白乙?；揎椧?guī)律并不完全相同，這可能提示HDAC在調(diào)控小鼠心肌肥厚中并不是直接作用于小鼠心肌肥厚相關(guān)基因β-MHC，而有可能是通過調(diào)控其他基因進(jìn)而間接導(dǎo)致心肌肥厚相關(guān)基因β-MHC的過表達(dá)，引發(fā)小鼠體內(nèi)心臟發(fā)育相關(guān)基因之間的穩(wěn)態(tài)失衡從而導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生。這也與國外報道相類似[17]。

本課題組前期研究證實，組蛋白乙酰化酶參與了小鼠心肌肥厚的調(diào)控，并證實組蛋白乙?；敢种苿┢針渌崮軌虿糠指纳菩∈笮募》屎馵18]。而在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑SAHA能夠顯著降低HDAC5過表達(dá)，且小鼠肥大的心肌細(xì)胞及心功能在SAHA處理組均較心肌肥厚組有顯著改善，這些結(jié)果表明組蛋白去乙?；{(diào)控也參與了心肌肥厚這一病理過程，也提示HDAC抑制劑SAHA可以作為心肌肥厚防治的候選藥物。但是對于SAHA能否用于臨床防治心肌肥厚尚需更多的相關(guān)研究證實。

綜上所述，HDAC參與了小鼠心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，且HDAC抑制劑SAHA能夠部分逆轉(zhuǎn)小鼠心肌肥厚，然而組蛋白乙酰化酶和HDAC均參與了小鼠心肌肥厚的調(diào)控，聯(lián)合運用二者的抑制劑能否完全逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，徹底改善心肌肥厚及心功能尚有待進(jìn)一步研究證實。

[1] Jin H, Hadri L, Palomeque J, et al. KChIP2 attenuates cardiac hypertrophy through regulation of Ito and intracellular calcium signaling. J Mol Cell Cardiol, 2010, 48: 1169-1179.

[2] 王詩才, 陳太軍, 黃美松, 等. 丹參酮ⅡA對自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌肥厚及心肌細(xì)胞凋亡的影響. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 694-698.

[3] Wang Y, Miao X, Liu Y, et al. Dysregulation of histone acetyltransferases and deacetylases in cardiovascular diseases. Oxid Med Cell Longev, 2014, 2014: 641979.

[4] Wei JQ, Shehadeh LA, Mitrani JM, et al. Quantitative control of adaptive cardiac hypertrophy by acetyltransferase p300. Circulation, 2008, 118: 934-946.

[5] Whayne TF. Epigenetics in the development, modification, and prevention of cardiovascular disease. Mol Biol Rep, 2015, 42: 765-776.

[6] Toussirot E, Abbas W, Khan KA, et al. Imbalance between HAT and HDAC activities in the PBMCs of patients with ankylosing spondylitis or rheumatoid arthritis and influence of HDAC inhibitors on TNF alpha production. PLoS One, 2013, 8: e70939.

[7] Heinzel FR, Hohendanner F, Jin G, et al. Myocardial hypertrophy and its role in heart failure with preserved ejection fraction. J Appl Physiol, 2015, 119: 1233-1242.

[8] Hamada M, Ikeda S, Shigematsu Y. Advances in medical treatment of hypertrophic cardiomyopathy. J Cardiol, 2014, 64: 1-10.

[9] 竇夢怡, 秦富忠, 李保. 缺氧誘導(dǎo)因子在心臟重構(gòu)和心力衰竭中的作用. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 1125-1127.

[10] Cao Y, Lu L, Liu M, et al. Impact of epigenetics in the management of cardiovascular disease: a review. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18: 3097-3104.

[11] Kang SH, Seok YM, Song MJ, et al. Histone deacetylase inhibition attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis through acetylation of mineralocorticoid receptor in spontaneously hypertensive rats. Mol Pharmacol, 2015, 87: 782-791.

[12] Ma J, Luo T, Zeng Z, et al. Histone Deacetylase Inhibitor Phenylbutyrate Exaggerates Heart Failure in Pressure Overloaded Mice independently of HDAC inhibition. Sci Rep, 2016, 6: 34036.

[13] Lee E, Song MJ, Lee HA, et al. Histone deacetylase inhibitor, CG200745, attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis in DOCA-induced hypertensive rats. Korean J Physiol Pharmacol, 2016, 20: 477-485.

[14] 彭昌, 羅孝美, 謝新星, 等. 探討組蛋白乙酰化酶對心臟發(fā)育基因NKX2. 5的動態(tài)調(diào)控作用. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 1008-1012.

[15] Eom GH, Nam YS, Oh JG, et al. Regulation of acetylation of histone deacetylase 2 by p300/CBP-associated factor/histone deacetylase 5 in the development of cardiac hypertrophy. Circ Res, 2014, 114: 1133-1143.

[16] Clayton AL, Hazzalin CA, Mahadevan LC. Enhanced histone acetylation and transcription: a dynamic perspective. Mol Cell, 2006, 23: 289-296.

[17] Morales CR, Li DL, Pedrozo Z, et al. Inhibition of class I histone deacetylases blunts cardiac hypertrophy through TSC2-dependent mTOR repression. Sci Signal, 2016, 9: ra34.

[18] Peng C, Zhang W, Zhao W, et al. Alcohol-induced histone H3K9 hyperacetylation and cardiac hypertrophy are reversed by a histone acetylases inhibitor anacardic acid in developing murine hearts. Biochimie, 2015, 113: 1-9.

Suberoylanilide Hydroxamic Acid Improves Cardiac Hypertrophy via Inhibiting Histone Deacetylase in Experimental Mice

PENG Chang, LI Shuo, LUO Xiao-mei, XIE Xin-xing, XIAO Ming-chen.
Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi (563000), Guizhou, China

PENG Chang, Email: pengchang_2006@126.com

Objective: To explore the effect of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) improving cardiac hypertrophy via inhibiting histone deacetylases (HDAC) in experimental mice and to provide a new idea for prevention and treatment of cardiac hypertrophy.

Methods: Cardiac hypertrophy mice model was established by thoracic aorta ligation. A total of 60 Kunming mice were randomly divided into 4 groups: Normal control group, Sham operation group, Cardiac hypertrophy (CH) group and CH+SAHA group. There were 6 mice used in each group. Myocardial cell morphology was observed by HE staining, cardiac function was assessed by echocardiography, mRNA and protein expressions of HDAC5 (the isoform of HDAC) and β-MHC were examined by RT-PCR and Western blot analysis.

Results: The mice in CH group had myocardial cell hypertrophy, disordered arrangement and hyperchromatic nucleus. Compared with Sham operation group, CH group showed decreased left ventricular end diastolic diameter (LVEDD), left ventricular end diastolic volume (LVEDV) and increased thickness of inter-ventricular septum (IVS), all P＜0.05; CH group presented elevated mRNA and protein expressions of HDAC5 and β-MHC, P＜0.05. SAHA obviously decreased HDAC5 expression, down regulated cardiac hypertrophy related β-MHC gene expression, improved cardiac function and hypertrophy, all P＜0.05.

Conclusion: HDAC were involved in myocardial hypertrophy; SAHA could inhibit HDAC expression and therefore,improved myocardial hypertrophy in experimental mice.

Histone deacetylasel l; Cardiomegaly; Treatment Outcome

book=803,ebook=79

2016-10-05）

（編輯：王寶茹）

國家自然科學(xué)基金項目（81560040）；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動基金項目[院字（2015）4號]；遵義醫(yī)學(xué)院與科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目[遵醫(yī)科院（2015）3108]

563000貴州省遵義市，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 兒內(nèi)科（彭昌、李碩、謝新星、肖明晨）；遵義醫(yī)學(xué)院 生理教研室（羅孝美）

彭昌 副主任醫(yī)師 博士 主要從事心血管疾病研究 Email：pengchang_2006@126.com 通訊作者：彭昌

R54

A

1000-3614（2017）08-0803-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.017