胰島素抵抗及脂聯(lián)素缺乏對小鼠心肌重構(gòu)的影響

徐璐，劉雅娟，張青，秦毅，張娜，任永康，楊銳英

胰島素抵抗及脂聯(lián)素缺乏對小鼠心肌重構(gòu)的影響

徐璐，劉雅娟，張青，秦毅，張娜，任永康，楊銳英

目的:研究胰島素抵抗（IR）及脂聯(lián)素（APN）缺乏對小鼠心肌重構(gòu)的影響。

方法:選擇16只野生C57小鼠隨機分為對照組和IR組，每組8只；16只APN基因敲除（APNKO）C57小鼠隨機分為APNKO組和APNKO+IR組，每組各8只。對照組和APNKO組給予普通飼料，IR組和APNKO+IR組給予高脂飼料誘導(dǎo)產(chǎn)生IR。喂養(yǎng)12周后取血測定總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖和空腹胰島素水平，取心臟測量心臟重量和左心室重量。取左心室心肌做蘇木素伊紅（HE）染色和馬松（Masson）染色，觀察各組心肌結(jié)構(gòu)改變及纖維化的程度；用免疫組化法和蛋白免疫印跡法檢測心肌中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和APN表達量的差異。

結(jié)果:與對照組比較，IR組、APNKO組和APNKO+IR組中小鼠的總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖和空腹胰島素、心臟重量和左心室重量均有增加（P＜0.05）；HE染色及Masson染色結(jié)果顯示：與對照組比較，IR組、APNKO組和APNKO+IR組中小鼠的心肌肥大程度更高；免疫組化及蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：與對照組相比，IR組、APNKO組和APNKO+IR組中小鼠心肌APN表達明顯減低，心肌MMP-9表達明顯增加（P＜0.05）。

結(jié)論: APN缺乏和IR導(dǎo)致心肌重構(gòu)，且兩者起協(xié)同促進作用。

胰島素抗藥性；脂聯(lián)素；心室重構(gòu)

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:808.)

心肌重構(gòu)是指心臟功能受損，心腔擴大，心肌肥厚的代償過程中，心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)性的變化，是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本病理機制[1，2]。早期干預(yù)和針對誘因的預(yù)防是治療心肌重構(gòu)的關(guān)鍵。以往研究顯示，低脂聯(lián)素（APN）血癥及胰島素抵抗（IR）有可能是參與左心室心肌重構(gòu)的重要因素[3,4]。體內(nèi)低表達APN并伴IR時是否會進一步加重心肌重構(gòu)，此類研究鮮有報道。為此，本研究采用野生C57小鼠和同品系A(chǔ)PN基因敲除（APNKO）C57小鼠為觀察對象，用高脂飼料誘導(dǎo)IR，通過析因分析，探討IR與APNKO對心肌重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

實驗動物與試劑:野生雄性C57小鼠32只以及同品系A(chǔ)PNKO純合子雄性小鼠均購自上海南方模式生物研究中心，合格證書為SCXK（滬）2009-0023；蛋白免疫印跡（Western blot）法相關(guān)試劑均購自南京生物科技發(fā)展有限公司；酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒購自美國R&D公司；普通飼料購自寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心；高脂飼料購自美國Research Diets公司，脂肪供能比占60%。

實驗分組：（1）對照組：普通飼料喂養(yǎng)的野生小鼠；（2）IR組：高脂飼料喂養(yǎng)的野生小鼠，誘導(dǎo)IR模型[5]；（3）APNKO組：普通飼料喂養(yǎng)的APNKO小鼠；（4）APNKO+IR組：高脂飼料喂養(yǎng)的APNKO小鼠。每組各8只。

標(biāo)本采集：喂養(yǎng)12周后測體重，禁食8 h后測空腹血糖，4%水合氯醛腹腔麻醉后，眼球取血，用生化分析儀檢測血清總膽固醇、甘油三酯，用ELISA試劑盒測空腹胰島素。解剖分離心臟后稱取心臟重量，分離左心室后稱取左心室重量。

標(biāo)本處理：將左心室心肌標(biāo)本脫水、浸蠟，用石蠟包埋切片，分別進行蘇木素伊紅（HE）染色和馬松（Masson）染色。用計算機軟件Image-Pro plus 6.0測定HE染色中心肌細(xì)胞橫切面的橫截面積以觀察心肌細(xì)胞肥大的程度，并且測定Masson染色中心肌膠原容積分?jǐn)?shù)和血管周圍膠原面積的含量以評價血管周圍纖維化程度[6]。免疫組化測定基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及APN的分布及表達，對陽性表達進行光密度半定量分析。Western blot檢測MMP-9及APN的表達。將心肌組織置于加有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，研磨至勻漿，提取總蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取50μg蛋白勻漿進行凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，對膜敷育一抗MMP-9、APN及內(nèi)參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），4℃過夜后，常溫孵育二抗，并用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（BIORAD ChemiDoc XRS+）進行化學(xué)曝光，對目的蛋白及GAPDH條帶進行灰度值半定量分析。

指標(biāo)計算:胰島素抵抗指數(shù)[空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（mmol/L）/22.5]；心肌肥厚指標(biāo)包括心臟重量指數(shù)（心臟重量/體重）和左心室重量指數(shù)（左心室重量/體重）、心肌細(xì)胞膠原容積分?jǐn)?shù)（心肌細(xì)胞膠原面積/視野總面積）、心肌細(xì)胞膠原面積（不包括血管周圍膠原面積）、血管周圍膠原面積與管腔面積的比值（心肌內(nèi)小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積）。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

四組小鼠觀察指標(biāo)的比較（表1）：與對照組比，IR組所有觀察指標(biāo)均增加，除左心室重量指數(shù)外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；APNKO組總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、空腹胰島素、心臟重量、心臟重量指數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；APNKO+IR組所有觀察指標(biāo)均增加，除總膽固醇外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與IR組比，APNKO組甘油三酯增加，體重、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、心臟重量明顯減少（P＜0.05）；APNKO+IR組甘油三酯、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、左心室重量指數(shù)明顯增加（P＜0.05）。與APNKO組相比，APNKO+IR組體重、空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、心臟重量、左心室重量、左心室重量指數(shù)進一步增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

HE染色結(jié)果（圖1）：對照組小鼠可觀察到排列整齊、形態(tài)正常、界限清晰的心肌細(xì)胞及胞間結(jié)構(gòu)。IR組和APNKO組小鼠心肌細(xì)胞胞間結(jié)構(gòu)界限模糊，排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大。而APNKO+IR組心肌細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解、消失，胞間界限更加模糊，心肌細(xì)胞排列更加紊亂，心肌細(xì)胞進一步肥大，并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。

Masson染色結(jié)果（圖1）：心肌膠原纖維和血管顯示藍色，心肌細(xì)胞顯示粉紅色，紅細(xì)胞顯示紫色。與對照組比較，藍色心肌纖維在APNKO組增加；與IR組和APNKO組比較，藍色心肌纖維在APNKO+IR組進一步增加。

表1 四組小鼠觀察指標(biāo)的比較（n=8,±s）

圖1 四組小鼠心肌HE染色縱切面（×400）和Masson染色(×400)

四組小鼠心肌組織病理分析比較（表2）：與對照組比，IR組、APNKO組、APNKO+IR組橫截面積、心肌細(xì)胞膠原容積分?jǐn)?shù)、血管周圍膠原面積與管腔面積的比值逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

免疫組化檢測（圖2）：與對照組比，IR組、APNKO組和APNKO+IR組心肌APN表達明顯減低，心肌MMP-9表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與IR組相比，APNKO組和APNKO+IR組心肌APN表達明顯減低，心肌MMP-9表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與APNKO組相比，APNKO+IR組心肌APN表達進一步減低，心肌MMP-9表達進一步增加，差異均有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。

表2 四組小鼠心肌組織病理分析比較（n=8,±s）

圖2 四組小鼠心肌脂聯(lián)素和基質(zhì)金屬蛋白酶-9免疫組化檢測結(jié)果(×400)

四組小鼠心肌脂聯(lián)素和基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白表達的比較（表3）：免疫組化和Western blot檢測可見，與對照組比IR組、APNKO組和APNKO+IR組的APN光密度和灰度值依次遞減，而MMP-9 光密度和灰度值依次遞增，差異均有統(tǒng)計差異（P＜0.05）。

表3 四組小鼠心肌脂聯(lián)素和基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白表達比較（n=8，±s）

3 討論

IR是正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，主要表現(xiàn)為外周組織對葡萄糖的利用障礙和對胰島素敏感性下降，尤其是肌肉、肝臟、脂肪組織和下丘腦。IR又是2型糖尿病重要病理基礎(chǔ)，當(dāng)大量分泌的胰島素不能克服血糖的升高時，血糖開始升高，最終成為2型糖尿病。APN在機體內(nèi)主要由白色和棕色脂肪細(xì)胞合成，并通過自分泌、旁分泌等多種方式作用于靶器官，是一種具有胰島素增敏、抗動脈粥樣硬化及抗炎等作用的特異性細(xì)胞因子[7]。MMP-9是反應(yīng)心肌重構(gòu)程度的因子之一，參與心肌梗死后心肌重構(gòu)、慢性心力衰竭進展等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[8]。相關(guān)研究表明：高血壓患者心肌纖維化，并存在低APN血癥[9]。而心肌重構(gòu)是糖尿病主要的晚期嚴(yán)重并發(fā)癥之一，心肌重構(gòu)患者空腹胰島素水平增高[10]，有研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病大鼠左心室心肌組織膠原含量明顯高于正常大鼠，心肌間質(zhì)發(fā)生了纖維化，左心室發(fā)生重構(gòu)[11]。

目前的研究中，IR和APN缺乏均是心肌重構(gòu)的重要影響因子，但關(guān)于IR和APN對心肌重構(gòu)的協(xié)同作用，少見報道。本次研究主要通過高脂飼料誘導(dǎo)APN基因敲除小鼠的糖脂代謝紊亂，探討IR對APN基因敲除小鼠心肌重構(gòu)的影響。其結(jié)果顯示：APN基因敲除和IR均增加心臟重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)的大小。APN基因敲除和IR對總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖和空腹胰島素及心肌重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)有交互效應(yīng)，且均為正效應(yīng)，APN基因敲除和IR對心肌APN有交互效應(yīng)，但為負(fù)效應(yīng)。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的機制可能與APN的抗炎及胰島素增敏作用有關(guān)。APN水平降低，引起脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌大量的白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等炎性細(xì)胞因子，APN的抗炎作用不能抗衡體內(nèi)炎癥時，進一步促進炎性細(xì)胞因子的釋放，降低胰島素的敏感性，加重IR的程度。低水平APN抑制腺苷酸活化蛋白激酶AMPK的激活，促進成纖維細(xì)胞向心肌中遷移，增加細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進心肌纖維化[12]。另外低水平的APN可以激活外周血管緊張素，增加心臟負(fù)荷，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達，進而促進心肌與間質(zhì)細(xì)胞的代償性肥大及增生[13]。低水平APN降低胰島素敏感性，發(fā)生IR時，出現(xiàn)一系列糖脂代謝紊亂，表現(xiàn)為過氧化物激活增值受體被激活，游離脂肪酸增多，心肌細(xì)胞過度依賴脂肪酸β氧化，葡萄糖利用功能減低，脂肪酸供能增多，心肌能量轉(zhuǎn)換率下降，耗氧量增加，心肌負(fù)荷增加，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[14]。同時，IR使磷酸化絲氨酸胰島素受體底物-1增加，蛋白激酶B激活，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡并發(fā)生心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變[15]。

綜上所述，APN缺乏及IR均可以導(dǎo)致心肌重構(gòu)，并且二者在心肌重構(gòu)的發(fā)生過程中起協(xié)同促進作用。體內(nèi)低水平APN伴IR是心肌重構(gòu)發(fā)生的高危因素。增加體內(nèi)外源性APN的攝入的同時控制IR的進展將是延緩心肌重構(gòu)進程的重要方法。

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Impact of Insulin Resistance and Adiponectin Lacking on Myocardial Remodeling in Experimental Mice

XU Lu, LIU Ya-juan, ZHANG Qing, QIN Yi, ZHANG Na, REN Yong-kang, YANG Rui-ying.
Department of Cardiology, Ningxia Medical University, Yinchuan (750004), Ningxia, China

YANG Rui-ying, Email: yangruiying@medmail.com

Objective: To explore the impact of insulin resistance (IR) and adiponectin (APN) lacking on myocardial remodeling in experimental mice.

Methods:16 normal C57 mice were divided into 2 groups: Control group and IR group; in addition, 16 APN gene knockout(APNKO) mice were divided into another 2 groups: APNKO group and APNKO+IR group. n=8 in each group. The mice in Control group and APNKO group were fed with normal diet, in IR group and APNKO+IR group were fed with high fat diet to create the IR model. All animals were treated for 12 weeks. Blood levels of total cholesterol(TC), triglycerides(TG),fasting plasma glucose(FPG) and fasting insulin(FINS) were examined; heart weight and left ventricular weight were measured; left ventricular myocardial morphological changes and the degree of fibrosis were assessed by HE staining and Masson staining; protein expressions of myocardial matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and APN were detected by immunehistochemistry and Western blot analysis.

Results: Compared with Control group, IR group, APNKO group and APNKO+IR group showed elevated blood levels of TC, TG, FPG and FINS; increased heart weight and left ventricular weight, all P＜0.05; IR group, APNKO group and APNKO+IR group presented more myocardial hypertrophy, decreased protein expression of APN and increased protein expression of MMP-9, all P＜0.05.

Conclusion: IR and APN lacking could incur myocardial remodeling in experimental mice and they had synergistically facilitated effect.

Insulin resistance;Adiponectin; Ventricular remodeling

book=808,ebook=84

2016-08-25）

（編輯：漆利萍）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81360026）

750004 寧夏回族自治區(qū)銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué) 心血管內(nèi)科（徐璐、張青、張娜、任永康）；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 心臟中心干部病房（劉雅娟、楊銳英）；寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（秦毅）

徐璐 碩士研究生 主要從事冠心病與代謝綜合征的研究 Email:3051406099@qq.com 通訊作者：楊銳英 Email：yangruiying@medmail.com.cn

R54

A

1000-3614（2017）08-0808-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.018