茯苓多糖對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Th17/Treg平衡的影響

王慧蓮， 孟慶良， 李松偉， 王濟華

(1河南省中醫(yī)院風濕病科， 2河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕病科， 河南 鄭州 450000)

茯苓多糖對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Th17/Treg平衡的影響

王慧蓮1△， 孟慶良1， 李松偉2， 王濟華2

(1河南省中醫(yī)院風濕病科，2河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕病科， 河南 鄭州 450000)

目的： 研究茯苓多糖對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血輔助性T細胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)平衡的免疫調(diào)節(jié)作用。方法: 選取45例SLE患者和35例健康對照者，應用磁珠分選法分離外周血CD4+T細胞，流式細胞術檢測CD4+T 細胞中Th17和Treg細胞的比例。用茯苓多糖分別處理健康對照者及患者的CD4+T 細胞，MTT法檢測細胞活力以測定茯苓多糖毒性，ELISA檢測細胞中白細胞介素17(IL-17)、IL-6、IL-10及轉化生長因子β(TGF-β)的含量，RT-qPCR和Western blot法分別測定維甲酸相關孤兒受體γt(RORγt)與叉頭框蛋白P3(Foxp3)的mRNA和蛋白表達水平。結果: 與健康對照組相比，SLE患者的Th17細胞比例顯著升高，Treg細胞比例明顯降低(P<0.05)。用100 μg/L的茯苓多糖處理SLE患者CD4+T 細胞，與空白對照組相比，IL-17和IL-6的含量顯著降低，IL-10 和TGF-β的含量明顯上升(P<0.05)；RORγt的mRNA和蛋白表達顯著下降，同時Foxp3的表達在mRNA和蛋白水平上明顯增加(P<0.05)；并且Th17/Treg的比值降低(P<0.05)。結論: 茯苓多糖可以通過升高Treg并降低Th17細胞的比例，對SLE起到一定的治療作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 輔助性T細胞17； 調(diào)節(jié)性T細胞； 茯苓多糖

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種臨床常見的多因素多環(huán)境影響的自身免疫疾病[1]。SLE的特征為機體對自身的抗原免疫耐受出現(xiàn)缺失，導致多種自身抗體的產(chǎn)生以及T、B淋巴細胞的異常活化和增殖，其中輔助性T細胞的功能異常在SLE的發(fā)病中起到重要作用[2]。輔助性T細胞17(T helper 17 cells， Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulator T cells，Treg)的功能絮亂可導致多種免疫相關疾病的發(fā)生。有報道表明，在SLE的發(fā)病進程中觀察到明顯的Th17/Treg平衡失調(diào)，提示Th17/Treg可能影響SLE的發(fā)生和發(fā)展[3]。茯苓多糖(pachyman polysaccharides，PPS)是中藥茯苓(Poriacocos)的主要活性成分，具有抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性作用[4]。最新報道表明茯苓可以在炎性疾病中激活T細胞向Treg分化，調(diào)節(jié)機體的免疫失衡[5-6]。目前關于茯苓多糖在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用尚少見文獻報道。因此，本實驗從體外實驗出發(fā)，觀察茯苓多糖對SLE患者外周血Th17和Treg細胞的影響，初步探討茯苓對SLE的免疫調(diào)節(jié)作用及其作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 研究對象 選取2010～2015年在河南省中醫(yī)院風濕科就診的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者45例，其中男23例，女22例，年齡22～50歲。SLE診斷符合由美國風濕學會修訂的分類標準。健康對照35例，選自本院健康獻血者，男18例，女17例，年齡20～50歲。SLE患者與健康對照之間性別、年齡差異無統(tǒng)計學顯著性，具有可比性。本研究獲得河南省中醫(yī)院倫理委員會批準，所有參與人經(jīng)過知情同意后獲得其外周血標本。

1.2 主要試劑 AIM-V Medium CTS培養(yǎng)基購于Gibco； CD4+T細胞分選試劑盒購于Miltenyi；流式檢測試劑盒購于eBioScience；茯苓多糖購于寧波德康生物制品有限公司；人白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)、IL-6、IL-10和轉化生長因子β(transforming growth factor，TGF-β) ELISA 試劑盒購自R&D Systems；抗維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor γt，RORγt)、叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3)和β-actin的 I 抗，以及HRP標記的II 抗購于Santa Cruz Biotechnology。

2 方法

2.1 標本采集 在清晨空腹狀態(tài)下采集靜脈血10 mL，放置于肝素鈉抗凝管中。按照試劑盒說明，用免疫磁珠法分離出外周血中的CD4+T細胞，并用流式細胞術檢測 CD4+T細胞的純度在90%以上。分離出的CD4+T細胞中加入AIM-V Medium CTS培養(yǎng)基放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 流式細胞術檢測Th17與Treg細胞 流式細胞術檢測外周血分離出的CD4+T細胞中Th17與Treg細胞的比例。在分離出的CD4+T細胞中分別加入表面染色FITC-IL-17或FITC-IL-10，細胞固定、破膜后，加入染色PE-RORγt或PE-Foxp3，4 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，并將細胞懸浮于PBS中，通過流式細胞儀檢測Th17和Treg細胞的比例。

2.3 細胞處理及分組 分離出的CD4+T 細胞中分別加入濃度為10、100、500、1 000 μg/L的PPS培養(yǎng)72 h，不加PPS處理的CD4+T細胞為對照組。

2.4 MTT法檢測細胞活力 在待測細胞中加入5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃恒溫箱中孵育4 h。上清吸棄后，加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，震蕩15 min使藍色結晶充分溶解，用酶標儀讀取在490 nm處的吸光度(optical density，A)。

2.5 ELISA實驗 使用ELISA檢測IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β的含量。詳細步驟按照ELISA試劑合說明書進行。反應完成后，結果使用酶標儀檢測波長450 nm處的A值，并根據(jù)標準品的濃度及對應A值計算出樣品濃度。

2.6 RT-qPCR檢測mRNA的表達 待測細胞用Trizol法提取總RNA，測定RNA的濃度及純度，逆轉錄后提取cDNA，PCR擴增RORγt和Foxp3。 RORγt 上游引物： 5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’；下游引物：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’。Foxp3上游引物：5’-GCTGGTCGGGAGAAGAGGAAAA-3’；下游引物：5’-CAGTATCCCACGGAAATAACC-3’。擴增條件為： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 1 min， 64 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min， 30個循環(huán)； 72 ℃ 10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，自動凝膠成像分析儀分析。

2.7 Western blot實驗 待測細胞中加入0.05%胰蛋白酶消化3 min，用PBS洗滌3次。加入65 μL的細胞蛋白裂解液RIPA裂解細胞，提取總蛋白，隨后使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白。電泳結束后，進行電轉膜，接著用5%脫脂奶粉在室溫下?lián)u晃封閉60 min。加入RORγt、Foxp3和β-actin的抗體，4 ℃過夜。PBS洗滌3次后，加入HRP標記的II 抗，室溫搖晃孵育120 min。結果用X線膠片曝光分析，Image-Pro Plus軟件處理。蛋白的相對表達量用目的蛋白與內(nèi)參照的灰度值比值表示。

3 統(tǒng)計學處理

所有計量資料數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行t檢驗及單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SLE患者外周血中Th17細胞水平升高，Treg水平降低

用磁珠分選出SLE患者和健康對照者外周血中的CD4+T細胞，并用流式細胞儀檢測CD4+T細胞中Th17與Treg的比例。結果如圖1所示，與健康對照組相比，SLE患者外周血中的Th17細胞比例明顯升高，Treg細胞的比例顯著下降,同時Th17/Treg顯著升高。

Figure 1.The Th17 and Treg cells from the SLE patients or healthy controls. Mean±SD.n=3.*P<0.05vshealthy control group.

圖1 SLE患者與健康對照外周血中的Th17和Treg細胞

2 PPS毒性篩選實驗

磁珠分選出SLE病患和健康對照的外周血CD4+T細胞，分別用不同濃度的PPS處理72 h，MTT檢測細胞的活力。如圖2所示，與未加入藥物處理的對照組相比，CD4+T細胞在10、100和500 μg/L的PPS處理下，細胞活力沒有發(fā)生明顯改變。當藥物濃度增大后，細胞活力顯著降低(P<0.05)，說明濃度大于1 000 μg/L的PPS對CD4+T細胞有毒性作用。因此本實驗選擇沒有毒性作用的500 μg/L作為PPS的藥物處理濃度。

Figure 2.The effect of PPS on the viability of CD4+T cells isolated from the SLE patients and healthy controls. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group.

圖2 PPS對SLE患者與健康對照者CD4+T細胞活力的影響

3 PPS影響SLE患者外周血中Th17和Treg細胞因子的分泌

磁珠分選出SLE患者外周血的CD4+T細胞中加入500 μg/L的PPS處理，用未加入PPS的SLE患者CD4+T細胞作為空白對照組，ELISA檢測細胞中Th17相關細胞因子(IL-17和IL-6)及Treg相關細胞因子(IL-10和TGF-β)的含量。結果如圖3所示，PPS處理后IL-17和IL-6的含量顯著降低，IL-10和TGF-β的含量明顯上升(P<0.05)。

4 PPS影響SLE患者外周血中Th17和Treg細胞特異轉錄因子的表達

分選出的CD4+T 細胞經(jīng)過PPS處理后，RT-qPCR 檢測Th17細胞特征性轉錄因子RORγt與Treg細胞特征性轉錄因子Foxp3的mRNA表達水平。結果顯示，PPS處理使RORγt的mRNA表達顯著降低，F(xiàn)oxp3的表達明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖4A。Wes-tern blot檢測RORγt和Foxp3的蛋白表達水平，結果與mRNA表達一致，見圖4B。

Figure 3.The effect of PPS on the cytokine production by Th17 and Treg cells from SLE patients. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 PPS對SLE患者外周血中Th17和Treg細胞相關細胞因子分泌的影響

Figure 4.The effect of PPS on the mRNA (A) and protein (B) expression of transcription factors in Th17 and Treg cells from SLE patients. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 PPS對SLE患者外周血中Th17和Treg細胞特異轉錄因子表達的影響

5 PPS影響SLE患者外周血中Th17/Treg細胞的平衡

流式細胞術檢測PPS處理的CD4+T 細胞中Th17與Treg細胞的比例。結果表明，與control組相比，PPS組的Th17細胞比例降低，Treg細胞比例增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。統(tǒng)計Th17/Treg的比值在PPS處理后的變化，結果顯示，Th17/Treg在PPS處理后降低，表明PPS處理使CD4+T細胞向Th17分化降低，Treg分化增多，平衡發(fā)生轉移，見圖5。

Figure 5.The effect of PPS on Th17/Treg balance in peripheral blood from the SLE patients. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 PPS對SLE患者外周血中Th17/Treg細胞平衡的影響

討 論

SLE是一種由自身免疫調(diào)節(jié)紊亂引起，并累及多器官損傷的疾病[7-8]。該病的突出特征為骨骼肌肉、皮膚黏膜、腎、中樞神經(jīng)等多個系統(tǒng)出現(xiàn)免疫性炎癥[9]。T淋巴細胞調(diào)節(jié)的自身免疫反應在SLE的發(fā)病進程中發(fā)揮了重要的作用[10]。在不同的細胞環(huán)境下，T淋巴細胞可分化成為不同的淋巴細胞亞群，包括Th1、Th2、Th17、Treg等細胞[10]。其中Th17和Treg細胞在SLE的病程中尤為重要，在SLE疾病發(fā)病機制和治療的研究中受到重視[11]。

初始T淋巴細胞分化為不同T細胞亞群后，各亞群之間發(fā)揮各自的功能，同時又相互制約，維持免疫的穩(wěn)定與平衡。初始的T淋巴細胞在TGF-β和IL-6的共同刺激下分化為Th17細胞，參與炎癥反應和自身免疫疾病[12]。但在僅存TGF-β時，初始T淋巴細胞不會分化為Th17細胞而是向Treg細胞轉發(fā)并分泌TGF-β，對機體的免疫應答發(fā)揮負調(diào)控作用[13]。已有研究證實SLE患者的體內(nèi)具有Treg細胞缺陷，從而導致SLE患者免疫調(diào)節(jié)功能失常，無法產(chǎn)生對正常組織的免疫耐受，進而促進疾病的發(fā)生[14]。Th17與Treg細胞的發(fā)育分化相互制約，當二者平衡打破時會導致包括SLE在內(nèi)的自身免疫疾病的發(fā)生[15]。本研究顯示SLE患者的Th17細胞比例較正常人升高，Treg細胞比例降低，Th17/Treg的平衡失調(diào)，同國內(nèi)外研究一致[16-17]。

目前中藥在免疫性疾病中的治療受到越來越多的關注，主要原因是其具有副作用低、價廉、效果良好等優(yōu)點。報道表明中藥多糖對巨噬細胞、B細胞、NK細胞以及T細胞均有明顯的調(diào)節(jié)作用[18]。茯苓是我國一種傳統(tǒng)經(jīng)典的中藥，生于松根之上并成長分布在我國大部分地區(qū)。現(xiàn)代藥理學研究表明，茯苓具有抗衰老、抗感染、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的功效，尤其是抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，具有良好的疾病治療和臨床應用價值[19]。PPS，即茯苓多糖，是中藥茯苓的主要活性成分。早前在茯苓多糖對腫瘤細胞作用的研究中，吳波等[20]報道1 000 μg/L的PPS對腫瘤細胞有殺傷作用。為了篩選出不具有細胞毒性的茯苓多糖，我們首先用不同濃度PPS刺激培養(yǎng)外周血CD4+T細胞(患者組和健康組)72 h，通過MTT檢測來觀察細胞活力，分析PPS對細胞的毒性作用。結果表明在PPS濃度1～500 μg/L時，藥物對患者和健康人的CD4+T細胞沒有毒性作用；當PPS濃度為1000 μg/L時，細胞的生長受到抑制，當濃度繼續(xù)增大其抑制作用的增加并不明顯。此結果與在腫瘤細胞中的研究一致，因此我們選用500 μg/L作為無細胞毒性的濃度來研究PPS對SLE疾病的免疫調(diào)節(jié)作用。

Th17細胞在機體中主要合成并分泌細胞因子IL-17。IL-17通過誘導IL-6表達調(diào)節(jié)炎癥細胞到組織局部的浸潤，從而導致系統(tǒng)損傷。研究表明，IL-17和IL-6在炎癥相關疾病如銀屑病、骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等中表達顯著升高，參與炎癥疾病的發(fā)病進程[21-22]。RORγt為Th17細胞的特異性轉錄因子，常用來作為Th17細胞檢測的靶標[23]。本研究中PPS抑制SLE患者外周血分離的CD4+T細胞中IL-17和IL-6的表達，并且抑制RORγt的mRNA和蛋白表達，表明PPS處理對SLE的Th17細胞功能有一定的抑制作用。進一步流式檢測表明，PPS降低分離出的CD4+T細胞中Th17細胞的比例，證實了PPS對Th17細胞的抑制作用。TGF-β和IL-10為Treg細胞分泌的細胞因子，可抑制淋巴和巨噬細胞等免疫細胞的功能，從而使Treg發(fā)揮免疫負調(diào)控作用，維持體內(nèi)的免疫耐受穩(wěn)態(tài)[24]。Foxp3為Treg細胞特異性表達的轉錄因子，在Treg細胞的發(fā)育和功能中起重要作用[25]。在Bae等[5]的報導中，過敏性皮炎小鼠在經(jīng)過口服藥物茯苓后，體內(nèi)的免疫平衡受到調(diào)節(jié)，Treg細胞的比例增加，且Foxp3的表達顯著增大。與其結果一致，PPS提升了SLE的CD4+T細胞中TGF-β、IL-10與 Foxp3的表達，增加了Treg細胞的比例。進一步分析細胞中Th17/Treg的平衡，結果證實PPS對該免疫細胞平衡有顯著的調(diào)節(jié)作用，改善SLE患者外周血中Th17/Treg的細胞比例失調(diào)。

綜上所述，我們的實驗結果證實了Th17/Treg的免疫平衡參與SLE的病理生理進程，并發(fā)現(xiàn)茯苓多糖可以通過減少Th17、增加Treg細胞而調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡，為統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療提供了一個新的方法與切入點。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of pachyman polysaccharides on Th17/Treg balance in systemic lupus erythematosus patients

WANG Hui-lian1, MENG Qing-liang1, LI Song-wei2, WANG Ji-hua2

(1DepartmentofRheumatology,HenanProvinceHospitalofTCM，2DepartmentofRheumatology,TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTCM,Zhengzhou450000,China.E-mail:huilianwangzz@163.com)

AIM: To investigate the immunomodulatory effect of pachyman polysaccharides (PPS) on T helper 17 cell (Th17)/regulatory T cell (Treg) balance in the peripheral blood of systemic lupus erythematosus (SLE) patients. METHODS: The CD4+T cells were isolated from the peripheral blood samples obtained from 45 SLE patients and 35 healthy controls enrolled in our study using magnetic bead separation method. The proportions of Th17 and Treg cells were measured by flow cytometry. The CD4+T cells from SLE patients and healthy controls were treated with PPS. The cytoto-xicity of PPS was evaluated by detecting cell viability with MTT assay. The contents of interleukin-17 (IL-17), IL-6, IL-10 and transforming growth factor-β (TGF-β) were measured by ELISA. The expression of retinoid-related orphan receptor γt (RORγt) and forkhead box protein P3 (Foxp3) at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively. RESULTS: The Th17 cells were significantly elevated， while Treg cells were obviously decreased in the SLE patients compared with the healthy control group (P<0.05). Compare with control group, the contents of IL-17 and IL-6 were decreased, while the contents of IL-10 and TGF-β were increased (P<0.05). The expression of RORγt at mRNA and protein levels was down-regulated and the expression of Foxp3 was up-regulated (P<0.05). The ratio of Th17/Treg was decreased in 100 μg/L nontoxic PPS-treated CD4+T cells isolated from the SLE patients (P<0.05). CONCLUSION: PPS treatment inhibits Th17 cells and elevates Treg cells in the CD4+T cells isolated from SLE patients, which may have a therapeutic effect on SLE patients.

Systemic lupus erythematosus; T helper 17 cells; Regulatory T cells; Pachyman polysaccharides

1000- 4718(2017)08- 1514- 06

2016- 12- 12

2017- 03- 22

R961.1； R392.32

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.027

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△通訊作者 Tel： 0371-53312126； E-mail： huilianwangzz@163.com