厄洛替尼減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型大鼠的腎損傷

黃 恬， 蔡 稀， 鐘 玲

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科， 重慶 400010)

厄洛替尼減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型大鼠的腎損傷

黃 恬， 蔡 稀， 鐘 玲△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科， 重慶 400010)

目的： 研究表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑厄洛替尼(erlotinib)對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。方法: 采用大劑量(55 mg/kg)鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型，以1周后血糖值>16.7 mmol/L的大鼠為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為2組[STZ組和STZ+erlotinib(100 mg·kg-1·d-1)組]，并以正常大鼠為對(duì)照組 (control 組)。Erlotinib處理4周后，檢測(cè)大鼠空腹血糖、血清肌酐和24 h尿蛋白含量的變化；HE染色和Masson染色觀察腎臟組織病理學(xué)改變；Western blot檢測(cè)各組腎臟組織中EGFR、p-EGFR、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)、Smad2/3、p-Smad2/3、Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)和纖連蛋白(fibronectin)的蛋白水平；活性氧簇(ROS)和丙二醛(MDA)試劑盒分別檢測(cè)各組腎臟組織中ROS和MDA水平。結(jié)果: 與control組相比，STZ組血糖、24 h尿蛋白和血清肌酐水平均顯著升高(P<0.01)，腎組織形態(tài)學(xué)出現(xiàn)異常變化；與STZ組相比，STZ+erlotinib組的血糖、24 h尿蛋白水平和血清肌酐水平顯著降低(P<0.05)，腎小球結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，腎小球系膜細(xì)胞增生程度明顯減弱。厄洛替尼明顯抑制了STZ大鼠腎組織中p-EGFR、TGFβ1、p-Smad2/3、ColⅣ和fibronectin蛋白水平，也明顯抑制了STZ大鼠腎組織中ROS和MDA水平。結(jié)論: 厄洛替尼可能通過(guò)抑制EGFR/TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的激活來(lái)抑制糖尿病腎病腎組織的纖維化和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕腎損傷。

糖尿病腎??； 厄洛替尼； 表皮生長(zhǎng)因子受體； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病的主要并發(fā)癥，繼發(fā)于糖尿病并呈進(jìn)行性加重，是糖尿病患者的主要死因[1]，也是導(dǎo)致腎臟相關(guān)疾病發(fā)病率及死亡率升高的主要原因[2]。糖尿病腎病的主要病理特征表現(xiàn)為腎小管及腎小球基底膜增厚、腎小管腎小球肥大、系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性聚集和腎小管間質(zhì)纖維化等[2]。臨床上DN初期表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率減小，后期出現(xiàn)蛋白尿、動(dòng)脈血壓升高、體液潴留等，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[3]。目前，我國(guó)糖尿病發(fā)病率快速增長(zhǎng)，隨之而來(lái)的社會(huì)問題也日趨嚴(yán)重。因此，探索糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，尋求防治措施，顯得尤為迫切。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)屬于受體酪氨酸激酶ErB家族成員之一，包含一個(gè)細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)、一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶區(qū)以及一個(gè)具有多個(gè)磷酸化結(jié)合位點(diǎn)的C末端。EGFR廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物腎臟組織中，包括腎小球、腎小管、腎皮質(zhì)及腎髓質(zhì)集合管等[4]。越來(lái)越多的研究表明EGFR是細(xì)胞增殖、分化、遷移及死亡等細(xì)胞生理病理變化的重要調(diào)節(jié)因子[5-6]。也有研究證實(shí)EGFR活化與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor，TGFβ)信號(hào)通路相互作用是腎組織纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，TGFβ信號(hào)通路的激活能促進(jìn)膠原蛋白、纖連蛋白和層黏連蛋白的形成，并且能抑制由基質(zhì)金屬蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積累增加，從而促進(jìn)了糖尿病腎病的進(jìn)展[4,7-9]。此外，TGFβ信號(hào)通路的激活可促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激是糖尿病腎損傷的重要原因之一[10]。因此，在糖尿病腎病進(jìn)展過(guò)程中調(diào)控EGFR的活性具有重要的意義。厄洛替尼(erlotinib)是一種新型的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酪氨酸激酶催化區(qū)結(jié)合位點(diǎn)來(lái)阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。有文獻(xiàn)報(bào)道在糖尿病腎病模型中EGFR處于活化狀態(tài)，EGFR抑制劑厄洛替尼能夠激活A(yù)MPK、抑制mTOR信號(hào)通路，而mTOR信號(hào)通路的抑制則增加了自噬反應(yīng)，減弱了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終減慢了糖尿病腎病的發(fā)展[11]。然而該報(bào)道未闡明厄洛替尼對(duì)與EGFR活化密切相關(guān)的TGFβ信號(hào)通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

本研究通過(guò)對(duì)糖尿病腎病模型大鼠進(jìn)行厄洛替尼干預(yù)，從生化指標(biāo)、腎臟病理水平來(lái)證實(shí)其對(duì)糖尿病腎病模型大鼠腎臟的保護(hù)作用，并通過(guò)闡明厄洛替尼對(duì)TGFβ信號(hào)通路的影響解析其發(fā)揮保護(hù)作用的分子機(jī)制，以初步探討厄洛替尼治療糖尿病腎病的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

46只健康成年SD大鼠，體重200～220 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)，合格證號(hào)為0020392。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購(gòu)于Sigma；厄洛替尼購(gòu)自Selleck；尿蛋白定量測(cè)試盒、血清肌酐(serum creatinine，Scr)測(cè)定試劑盒、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 檢測(cè)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；抗EGFR抗體、抗p-EGFR抗體、抗TGFβ1抗體、抗Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ，ColⅣ)抗體、抗纖連蛋白(fibronectin)抗體和抗β-actin抗體均購(gòu)于Bioworld；抗Smad2/3和抗p-Smad2/3抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；抗兔Ⅱ抗購(gòu)于中衫金橋公司。

激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica)；照相系統(tǒng)(OLYMPUS)；分光光度計(jì)(Thermo)；TC2323型恒溫箱(SHEL LAB)；高速臺(tái)式離心機(jī)(Beckman)；血糖儀及配套試紙(愛樂芬)。

2 主要方法

2.1 動(dòng)物模型的建立及分組 46只健康SD大鼠給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，尾靜脈取血測(cè)定血糖未見異常(第0周)。選取40只大鼠禁食后，給予大劑量(55 mg/kg)STZ腹腔注射，1周后(第1周末)，禁食3 h，血糖值>16.7 mmol/L的大鼠視為糖尿病模型建模成功。選擇18只造模成功的大鼠，隨機(jī)分為6組，灌胃給予厄洛替尼，每組劑量分別為0、25、50、75、100和125 mg·kg-1·d-1，連續(xù)灌胃3周(第2～4周)后檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平，以空腹血糖水平下降最明顯時(shí)的厄洛替尼劑量(100 mg·kg-1·d-1)為實(shí)驗(yàn)處理劑量。另選取6只糖尿病大鼠設(shè)為厄洛替尼組(STZ+erlotinib組)，通過(guò)灌胃給予厄洛替尼(100 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥4周(第5～8周)；同時(shí)，分別選取6只健康大鼠設(shè)為對(duì)照組(control組)和6只糖尿病大鼠設(shè)為STZ組，灌胃給予等體積生理鹽水。

2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用愛樂芬血糖儀及配套試紙測(cè)定大鼠FBG水平，記錄各組大鼠的血糖變化。第0周、第4周、第6周、第8周末，將大鼠放入代謝籠中，收集24 h尿標(biāo)本，離心取上清，測(cè)定尿蛋白含量；同時(shí)于相同時(shí)點(diǎn)收集大鼠血液測(cè)定各組大鼠血肌酐的含量。

2.3 收集腎組織標(biāo)本 采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，解剖、分離出雙側(cè)腎臟，去除包膜，用生理鹽水沖洗后，液氮保存，備用。

2.4 HE染色 取實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟組織，置于冰臺(tái)用 PBS 沖洗干凈，除去包膜，濾紙吸干，取左腎沿冠狀面剖開，置于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡400倍下觀察大鼠腎組織腎小球、腎小管、間質(zhì)等的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并進(jìn)行圖像采集。

2.5 Masson染色觀察腎臟纖維化 腎臟組織切片經(jīng)蘇木精染色1 min，沖洗液沖洗30 s；麗春紅酸性品紅液染色30～60 s，沖洗液清洗30 s；磷鉬酸分色6～8 min，棄分色液；亮綠藍(lán)染色5 min，用無(wú)水乙醇清洗；無(wú)水乙醇基本揮發(fā)完后加入中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡400倍下觀察，對(duì)腎臟膠原纖維的分布和纖維化程度進(jìn)行分析。

2.6 Western blot檢測(cè)蛋白水平 取米粒大小的腎臟組織于流式管中，加入1 mL 含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液，用組織勻漿機(jī)破碎組織，后將流式管置于冰中15 min，轉(zhuǎn)移樣本至EP管中，16 000 ×g離心5 min，吸取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，稀釋 I 抗(抗EGFR抗體1∶1 000、抗p-EGFR抗體1∶800、抗TGFβ1抗體 1∶1 000、抗Smad2/3、p-Smad2/3抗體 1∶2 000、抗ColⅣ抗體1∶500、抗fibronectin抗體1∶500、抗β-actin抗體1∶2 000)，4 ℃搖床中孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫下?lián)u床孵育2 h，ECL顯影。以β-actin為內(nèi)參照。

2.7 活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取大鼠腎臟組織，按重量(g)∶體積(mL)=1∶20的比例加入勻漿介質(zhì)(100 mmol/L PBS緩沖液)，用組織勻漿機(jī)破碎組織， 1 000×g離心10 min，取上清待測(cè)，另取部分上清用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制1 mmol/L DCFH-DA工作液，在10 μL樣本中加入190 μL DCFH-DA工作液作為測(cè)定孔，在10 μL PBS中加入190 μL DCFH-DA工作液作為對(duì)照孔，混勻后，37 ℃孵育30 min，于熒光顯微鏡下(激發(fā)波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm)觀察測(cè)量熒光強(qiáng)度，計(jì)算每毫克蛋白熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度的百分比。

2.8 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的檢測(cè) 按2.7所述方法獲得腎臟組織勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書加入待測(cè)樣本、標(biāo)準(zhǔn)品及試劑，混勻后95 ℃沸水浴40 min， 4 000 r/min離心10 min，取上清于532 nm處讀取各標(biāo)本吸光度，根據(jù)說(shuō)明書上MDA含量計(jì)算公式計(jì)算每毫克蛋白中MDA的含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同劑量厄洛替尼作用效果檢測(cè)

不同劑量的厄洛替尼均能降低STZ大鼠的空腹血糖水平，其中100 mg·kg-1·d-1和125 mg·kg-1·d-1灌胃劑量的作用效果最明顯，見圖1。因此后續(xù)我們選擇100 mg·kg-1·d-1作為厄洛替尼的實(shí)驗(yàn)劑量。

Figure 1.The STZ-induced DN rats were treated by different doses of erlotinib for 3 weeks, and then FBG levels were measured by glucometer. Mean±SD.n= 3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg·kg-1·d-1group.

圖1 不同劑量厄洛替尼處理DN大鼠3周后的FBG水平

2 厄洛替尼對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病模型大鼠血糖的影響

我們檢測(cè)了經(jīng)STZ造模及erlotinib (100 mg·kg-1·d-1)處理的大鼠空腹血糖水平，結(jié)果顯示STZ誘導(dǎo)的第6周和第8周，STZ組空腹血糖水平均顯著高于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而STZ+erlotinib組空腹血糖水平與STZ組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。說(shuō)明erlotinib能明顯改善糖尿病腎病大鼠的血糖水平。

3 厄洛替尼對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病模型大鼠24 h尿蛋白和血清肌酐的影響

表1 厄洛替尼(100 mg·kg-1·d-1)處理DN大鼠后各組FBG水平

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSTZ group. Week 0 was the time at the beginning of STZ treatment.

我們也檢測(cè)了經(jīng)STZ造模及erlotinib (100 mg·kg-1·d-1)處理的大鼠尿24 h蛋白含量，結(jié)果顯示STZ誘導(dǎo)的第6周和第8周，STZ組24 h尿蛋白水平明顯較control組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而相比于STZ組，STZ+erlotinib組尿蛋白水平明顯下降(P<0.01)，見表2。另外，在第STZ誘導(dǎo)的6周和第8周檢測(cè)大鼠血清肌酐水平發(fā)現(xiàn)，相比于control組，STZ組血清肌酐明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而相比于STZ組，STZ+erloti-nib組血清肌酐明顯下降(P<0.05)，見表3。這說(shuō)明erlotinib能明顯降低糖尿病腎病大鼠的24 h尿蛋白含量及血清肌酐濃度。

表2 厄洛替尼(100 mg·kg-1·d-1)處理DN大鼠后各組24 h尿蛋白水平

Table 2.The 24 h urine protein levels in DN rats treated with erlotinib were measured by automatic biochemical analyzer (mg. Mean±SD.n=6)

GroupWeek0Week4Week6Week8Control5．13±1．115．05±1．085．27±1．335．33±1．35STZ5．25±1．5222．37±3．91??23．10±5．20??22．88±6．10??STZ+erlotinib5．40±1．4223．89±4．7915．78±1．83##8．38±1．67##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSTZ group. Week 0 was the time at the beginning of STZ treatment.

表3 厄洛替尼(100 mg·kg-1·d-1)處理DN大鼠后各組血清肌酐水平

Table 3.The serum creatinine levels in DN rats treated with erlotinib were measured by automatic biochemical analyzer (μmol/L. Mean±SD.n=6)

GroupWeek0Week4Week6 Week8Control74．49±6．4475．08±5．0877．32±10．9976．61±8．78STZ69．36±7．33210．33±33．49??208．02±35．85??213．87±55．42??STZ+erlotinib72．53±8．91205．53±38．63168．21±13．80#138．86±16．53#

*P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsSTZ group. Week 0 was the time at the beginning of STZ treatment.

4 厄洛替尼對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病模型大鼠腎臟組織病理學(xué)變化的影響

在erlotinib處理4周后(即STZ誘導(dǎo)第8周)，HE染色結(jié)果顯示，control組腎小球結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，小管間質(zhì)、腎血管未見明顯異常，而STZ組出現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞增多，毛細(xì)血管基底膜增厚，上皮細(xì)胞排列不整齊，結(jié)構(gòu)紊亂，提示STZ誘導(dǎo)大鼠腎臟組織出現(xiàn)了病理性損傷。STZ+erlotinib組較STZ組比，大鼠腎臟病理改變程度明顯減輕，見圖2。

另外，Masson染色結(jié)果顯示，control組大鼠腎小球僅基底膜及腎小管間質(zhì)可見少量的膠原纖維(藍(lán)色)，而STZ組大鼠腎小球和腎小管間質(zhì)中可見大量藍(lán)色深染的膠原纖維，并且明顯多于control組，說(shuō)明有膠原纖維沉積。而STZ+erlotinib組大鼠腎小球和腎小管間質(zhì)中膠原纖維較STZ組明顯減少，見圖2。以上研究結(jié)果說(shuō)明erlotinib可明顯減輕糖尿病腎病大鼠的腎損傷。

5 厄洛替尼對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織中EGFR蛋白水平及磷酸化的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示control組、STZ組和STZ+erlotinib組大鼠腎組織中EGFR的蛋白水平?jīng)]有明顯差異；而與control組相比，STZ組大鼠腎組織中EGFR的磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；STZ+erlotinib組與STZ組相比，大鼠腎組織中EGFR的磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，見圖3。這一結(jié)果說(shuō)明厄洛替尼抑制了STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎組織中EGFR的激活。

6 厄洛替尼對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織中TGFβ信號(hào)通路的影響

我們也檢測(cè)了control組、STZ組和STZ+erlotinib組大鼠腎組織中TGFβ信號(hào)分子及其下游信號(hào)分子水平的差異。與control組相比，STZ組大鼠腎組織中TGFβ1和p-Smad2/3的蛋白水平明顯升高(P<0.01)；STZ+erlotinib組與STZ組相比，大鼠腎組織中TGFβ1和p-Smad2/3的蛋白水平顯著降低(P<0.01)；而各組大鼠腎組織中Smad2/3的蛋白水平無(wú)明顯差異。此外，與control組相比，STZ組大鼠腎組織中Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白的水平明顯升高(P<0.01)；STZ+erlotinib組與STZ組相比，大鼠腎組織中Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。以上結(jié)果說(shuō)明厄洛替尼抑制了STZ組腎組織中TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的激活，從而減少了腎組織中Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白的產(chǎn)生，減輕了腎損傷，見圖4。

Figure 2.The DN rats were treated with erlotinib (100 mg·kg-1·d-1) for 4 weeks, and then the renal tissues in all groups were stained by HE and Masson staining (×400).

圖2 厄洛替尼處理DN大鼠4周后腎組織的HE和Masson染色結(jié)果

Figure 3.The DN rats were treated with erlotinib (100 mg·kg-1·d-1) for 4 weeks, and then the EGFR and p-EGFR levels in rat kidney tissues were measured by Western blot.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSTZ group.

圖3 厄洛替尼處理DN大鼠4周后各組大鼠腎組織中EGFR和p-EGFR的水平

7 厄洛替尼對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織中氧化應(yīng)激水平的影響

與control組相比，STZ組大鼠腎組織中ROS的水平明顯升高，而STZ+erlotinib組大鼠腎組織中ROS的水平相比于STZ組明顯降低(P<0.01)。此外，與control組相比，STZ組大鼠腎組織中的MDA含量明顯升高，而STZ+erlotinib組大鼠腎組織中的MDA含量相比于模型組明顯降低(P<0.05)，見圖5。

討 論

糖尿病腎病是威脅人類生命的糖尿病并發(fā)癥之一，盡管已有較多的手段用于控制糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，然而許多糖尿病患者仍然有較高的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展為糖尿病腎病。因此，鑒定糖尿病腎病的危險(xiǎn)因子，闡明其抑制因素在糖尿病腎病發(fā)生過(guò)程中的作用具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病腎組織中EGFR的活化水平較高，抑制EGFR信號(hào)通路的活化具有潛在的治療糖尿病腎病的作用[11-12]。Erlotinib是EGFR的抑制劑，目前較少的研究關(guān)注其是否對(duì)糖尿病腎病腎組織具有保護(hù)作用。在本研究中，我們成功構(gòu)建了STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病模型，STZ組大鼠血糖、24 h尿蛋白、血清肌酐水平均顯著升高，并且出現(xiàn)異常的腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化，膠原纖維的產(chǎn)生也明顯增多。而erlotinib作用后，大鼠的血糖、24 h尿蛋白、血清肌酐水平均明顯降低，腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)異常變化明顯改善，膠原纖維的產(chǎn)生也明顯減少，表明腎組織的損傷程度明顯減輕，揭示erlotinib對(duì)糖尿病腎病腎組織具有保護(hù)作用。

Figure 4.The DN rats were treated with erlotinib (100 mg·kg-1·d-1) for 4 weeks, and then the TGF β1, Smad2/3, p-Smad2/3, ColⅣ and fibronectin levels in rat kidney tissues were measured by Western blot.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSTZ group.

圖4 厄洛替尼處理DN大鼠4周后各組大鼠腎組織中TGFβ1、Smad2/3、p-Smad2/3、ColⅣ和fibronectin的水平

Figure 5.The DN rats were treated with erlotinib (100 mg·kg-1·d-1) for 4 weeks, and then the levels of ROS and MDA in the rats kidney tissues of each group were detected by ROS assay and MDA assay, respectively. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsSTZ group.

圖5 厄洛替尼處理DN大鼠4周后各組大鼠腎組織中的ROS水平和MDA水平

TGFβ1是導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)的形成，促進(jìn)了糖尿病腎病的腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化過(guò)程[13-15]，TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的活化能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原和纖連蛋白的產(chǎn)生[16-17]。而EGFR的活化能介導(dǎo)TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的激活[4, 18]。本課題組研究證實(shí)，STZ組大鼠腎組織中EGFR的活化水及TGFβ1的蛋白水平明顯增高，Smad2/3的磷酸化水平也顯著增加，表明EGFR的活化介導(dǎo)了TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的激活。進(jìn)一步的研究證實(shí)TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的激活導(dǎo)致了STZ組大鼠腎組織中膠原和纖連蛋白水平增加。與STZ組相比，STZ+erlotinib組大鼠腎組織中EGFR和TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的活化水平明顯降低，膠原和纖連蛋白的表達(dá)水平也顯著降低，揭示erlotinib通過(guò)抑制EGFR/TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的活化減弱了糖尿病腎病腎組織的纖維化過(guò)程。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ROS水平的增加是糖尿病腎病腎組織損傷的重要原因[19]，并且EGFR的活化及TGF β1信號(hào)通路的激活均能促進(jìn)ROS水平的增加[10,20]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)STZ組大鼠腎組織中的ROS及MDA水平顯著升高，而與STZ組相比，STZ+erlotinib組大鼠腎組織中的ROS及MDA水平明顯降低，表明erlotinib減弱了糖尿病腎病腎組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，erlotinib通過(guò)抑制STZ所誘導(dǎo)的糖尿病腎病腎組織EGFR/TGFβ1-Smad2/3信號(hào)通路的激活，減弱了腎組織的纖維化和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕了腎損傷，揭示了其保護(hù)糖尿病腎病大鼠腎組織的作用。本研究的發(fā)現(xiàn)為將erlotinib用于臨床治療糖尿病腎病提供了初步的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Effect of erlotinib on renal injury in rats with STZ-induced diabetic nephropathy

HUANG Tian, CAI Xi, ZHONG Ling

(DepartmentofNephrology,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail: 536576113@qq.com)

AIM: To investigate the effect of epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor erlotinib on kidney injury in diabetic nephropathy (DN) rat and the underlying mechanism. METHODS: The rat model of DN was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) at dose of 55 mg/kg. One week after STZ injection, the rats with blood glucose level exceeding 16.7 mmol/L were identified as diabetic. Diabetic rats were randomly divided into 2 groups: STZ group and STZ+erlotinib group. In addition, the normal rats were used as control group. The rats in STZ+erlotinib group were treated with erlotinib at 100 mg·kg-1·d-1for 4 weeks(5th～8th week). The fasting blood glucose (FBG), serum creatinine (SCr) and 24 h urine protein were measured. The pathological changes of the kidney were observed by HE staining and Masson staining. The protein levels of EGFR, p-EGFR, transforming growth factor β1 (TGFβ1), Smad2/3, p-Smad2/3, collagen Ⅳ (ColⅣ) and fibronectin in the kidney tissues were determined by Western blot. The reactive oxygen species (ROS) level and malondialdehyde (MDA) content in the renal tissues were futher analyzed. RESULTS: Compared with control group, the levels of FBG, 24 h urine protein and Scr were significantly increased in STZ group (P<0.01). Compared with STZ group, the levels of FBG, 24 h urine protein and SCr in STZ+erlotinib group were markedly decreased (P<0.05). In additon, the glomerular structure was restored to normal, the proliferative degree of mesangial cells markedly attenuated, and the epithelial cells were in alignment in STZ+erlotinib group. Moreover, erlotinib significantly inhibited the protein levels of p-EGFR, TGFβ1, p-Smad2/3, ColⅣ and fibronectin in the kidney tissues of STZ rats. In addition, erlotinib also significantly inhibited the levels of ROS and MDA in the kidney tissues of STZ rats. CONCLUSION: Erlotinib ameliorates STZ-induced diabetic nephropathy possibly through inhibiting the activation of EGFR/TGFβ1-Smad2/3 signaling pathway in association with suppression of fibrosis and oxidative stress.

Diabetic nephropathy; Erlotinib; Epidermal growth factor receptor; Transforming growth factor β1

1000- 4718(2017)08- 1460- 07

2016- 12- 12

2017- 04- 01

R587.1； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.019

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