白藜三醇通過下調(diào)microRNA-21減輕快速電刺激所致心房肌細(xì)胞電重構(gòu)*

張 松， 沈冰冰， 李 飛， 朱啟仁， 王志榮， 張卓琦△

(1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 徐州 221002； 2邳州市人民醫(yī)院， 江蘇 邳州 221300)

白藜三醇通過下調(diào)microRNA-21減輕快速電刺激所致心房肌細(xì)胞電重構(gòu)*

張 松1， 沈冰冰1， 李 飛2， 朱啟仁1， 王志榮1， 張卓琦1△

(1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 徐州 221002；2邳州市人民醫(yī)院， 江蘇 邳州 221300)

目的： 研究白藜三醇(resveratrol，RSV)對快速電刺激(rapid electrical stimulation，RES)導(dǎo)致乳鼠心房肌細(xì)胞電重構(gòu)時(shí)微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)表達(dá)的影響，探討RSV通過miR-21參與電重構(gòu)的可能機(jī)制。方法: 采用胰酶、Ⅰ型膠原酶雙酶法及差速貼壁法分離培養(yǎng)乳鼠心房肌細(xì)胞。通過RES建立乳鼠心房肌細(xì)胞房顫模型，心房肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白對照(control)組、RSV組、RES組和RSV+RES組。為了證實(shí)RSV是否通過調(diào)控miR-21的表達(dá)參與電重構(gòu)，除了上述4組，另增加過表達(dá)和沉默miR-21組：RES+陰性對照組(RES+NC組)、RES+miR-21 mimics組、RES+miR-21 mimics+RSV組、RES+miR-21 inhibitor組和RES+miR-21 inhibitor+RSV組。CCK-8法檢測心房肌細(xì)胞活性以確定RSV最佳作用濃度及時(shí)間，qPCR法檢測各組細(xì)胞內(nèi)miR-21及L型鈣離子通道CACNA1C、CACNB2 mRNA的表達(dá)水平，Western blot檢測L型鈣離子通道Cav1.2和Cavβ2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 與control組相比，RES組miR-21表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，加入RSV預(yù)處理后miR-21表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。與RES+miR-21 mimics組相比,RES+miR-21 mimics+RSV組miR-21表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，而CACNA1C和CACNB2 mRNA及Cav1.2和Cavβ2蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。與RES組比，RES+miR-21 inhibitor和RES+miR-21 inhibitor+RSV組的miR-21表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，CACNA1C和CACNB2 mRNA及Cav1.2和Cavβ2蛋白表達(dá)量增加，但RES+miR-21 inhibitor組與RSV+RES組比，miR-21表達(dá)、CACNA1C和CACNB2 mRNA及Cav1.2和Cavβ2蛋白表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論: 在快速電刺激乳鼠心房肌細(xì)胞模擬房顫模型中，RSV干預(yù)可能通過下調(diào)miR-21表達(dá)而調(diào)控其下游靶基因這一途徑來減輕心房肌細(xì)胞電重構(gòu)。

白藜三醇； 微小RNA-21； 快速電刺激； 電重構(gòu)； 乳鼠心房肌細(xì)胞

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的慢性持續(xù)性心律失常，具有較高的發(fā)病率、致死率、致殘率，其發(fā)生和維持的機(jī)制非常復(fù)雜[1]。目前研究認(rèn)為AF的發(fā)生機(jī)制包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子活動(dòng)異常、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等[2-3]。其中，心房重構(gòu)是房顫發(fā)生與維持的重要機(jī)制。隨著近年來對AF發(fā)生機(jī)制研究的深入，已有越來越多的研究表明微小RNA(microRNA，miRNA，miR)參與心房重構(gòu)的調(diào)控。其中，miR-21的表達(dá)量在房顫發(fā)生中明顯上調(diào)，通過調(diào)控鈣離子通道蛋白參與心房重構(gòu)[4]。

白藜三醇(resveratrol，RSV)是主要存在于葡萄、虎杖等植物中的一種非黃酮類多酚化合物。大量研究表明，RSV具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及心律失常[5]等眾多心血管保護(hù)作用[6]。同時(shí)，研究表明RSV可通過下調(diào)miR-21減輕缺氧/復(fù)氧損傷，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[7]。為研究RSV對快速電刺激(rapid electrical stimulation，RES)導(dǎo)致乳鼠心房肌細(xì)胞電重構(gòu)時(shí)miR-21表達(dá)的影響，探討RSV通過miR-21參與電重構(gòu)的可能機(jī)制，本研究采用體外培養(yǎng)的乳鼠心房肌細(xì)胞，電刺激法建立心房細(xì)胞AF模型。通過觀察心房肌細(xì)胞miR-21及靶基因mRNA、蛋白水平變化，探討RSV通過miR-21參與電重構(gòu)的可能機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用RSV治療房顫提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生SD大鼠(1～3日齡)來源于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 藥物、試劑和儀器

RSV和Ⅰ型膠原酶均購于Sigma；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于Gibco； CCK-8試劑盒購于Dojindo；miR-21、CACNA1C和CACNB2 引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成；miR-21過表達(dá)/沉默序列(表1)由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；抗Cav1.2和Cavβ2蛋白兔源多克隆 I 抗購于Alomone Labs；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG II 抗購于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。C-Pace細(xì)胞培養(yǎng)刺激儀購于Bioprobes；倒置顯微鏡和體視顯微鏡購于Olympus。

3 主要方法

3.1 乳鼠心房肌細(xì)胞分離及培養(yǎng) 取新生SD大鼠心臟，參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行培養(yǎng)，采用雙酶法及差速貼壁法獲得乳鼠原代心房肌細(xì)胞。

3.2 CCK-8法檢測心房肌細(xì)胞活力以確定白藜三醇最佳作用濃度及時(shí)間 將原代心房肌細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，RSV分5、10、15、20和25 μmol/L 5個(gè)濃度組，CCK-8試劑盒檢測經(jīng)不同濃度梯度RSV預(yù)處理不同時(shí)間的心房肌細(xì)胞活性。檢測步驟：避光條件下每孔加入CCK-8和新鮮DMEM混合液(比例為1∶10)110 μL，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，2 h后酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度[9]，計(jì)算細(xì)胞存活率。

3.3 乳鼠心房肌細(xì)胞房顫模型制備及分組 原代心房肌細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)至第3天后予以RSV預(yù)處理，RSV的劑量是15 μmol/L。將與6孔板配套的帶有刺激電極的蓋板覆蓋于6孔板上，使電極到達(dá)培養(yǎng)基液面以下。蓋板通過導(dǎo)線連接于細(xì)胞刺激器，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[10-12]方法，將細(xì)胞刺激器設(shè)置為脈沖5 ms，頻率4 Hz，電壓15 V，持續(xù)電刺激24 h以建立心房細(xì)胞房顫模型。心房肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照(control)組、RSV組、RES組和RES+RSV組。為了證實(shí)白藜三醇是否通過調(diào)控miR-21的表達(dá)參與電重構(gòu)，除了上述4組，另增加過表達(dá)或沉默miR-21組：RES+NC組、RES+miR-21 mimics組、RES+miR-21 mimics+RSV組、RES+miR-21 inhibitor組和RES+miR-21 inhibitor+RSV組。

3.4 過表達(dá)或沉默miR-21 按上述方法培養(yǎng)的乳鼠心房肌細(xì)胞，48 h后細(xì)胞貼壁完全，狀態(tài)良好，可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按Lipofectamine 2000試劑說明，將miR-21 mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

3.5 RT-qPCR法檢測心房肌細(xì)胞miR-21及L型鈣離子通道CACNA1C、CACNB2 mRNA的表達(dá)水平 各組處理結(jié)束后，Trizol試劑一步法提取心房肌細(xì)胞總RNA。采用兩步法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。miR-21莖環(huán)引物、上下游引物，以及各靶基因及內(nèi)參照U6、GAPDH上下游引物均由上海捷瑞公司設(shè)計(jì)與合成，具體序列見表1。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

表1 引物及miR-21 mimics/inhibitor序列

3.6 Western blot檢測心房肌細(xì)胞 Cav1.2和Cavβ2蛋白的表達(dá)水平 將以上9組細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2遍后，用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min；12 000×g離心15 min，收集上清液；經(jīng)BCA法測濃度后，蛋白高溫變性，加樣，5%的濃縮膠和8%的分離膠進(jìn)行跑膠，按濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜， I 抗(Cav1.2以1∶1 000稀釋，Cavβ2以1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次， II 抗孵育1.5 h，洗膜3次，ECL法顯色。用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。蛋白質(zhì)的相對含量以目的蛋白與GAPDH條帶光密度值的比值表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示。各組間差異的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8篩選RSV最佳預(yù)處理時(shí)間及濃度

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與不同濃度RSV預(yù)處理6 h和12 h相比，不同濃度RSV預(yù)處理24 h和48 h使乳鼠心房肌細(xì)胞活力減低(P<0.05)。因此白藜三醇最佳預(yù)處理時(shí)間設(shè)定為12 h，見圖1。

Figure 1.The cell viability after 6 h, 12 h, 24 h and 48 h pretreatment with different concentrations of RSV. Mean±SD.n=5.

圖1 不同濃度的RSV預(yù)處理6、12、24和48 h后細(xì)胞活力的變化

與對照組相比，白藜三醇25 μmol/L組乳鼠心房肌細(xì)胞活性明顯減低(P<0.01)，其它的4個(gè)濃度組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與白藜三醇15 μmol/L組相比，白藜三醇20和25 μmol/L組乳鼠心房肌細(xì)胞活力減低(P<0.05)。因此白藜三醇作用于乳鼠心房肌細(xì)胞的最佳濃度設(shè)定為15 μmol/L，見圖2。

Figure 2.The cell viability after 12 h pretreatment with different concentrations of RSV. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs15 μmol/L group.

圖2 不同濃度RSV預(yù)處理12 h后細(xì)胞活力的變化

2 RT-qPCR檢測原代心房肌細(xì)胞miR-21及L型鈣離子通道CACNA1C、CACNB2 mRNA的表達(dá)

與control組比， RES組miR-21表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，RSV預(yù)處理后可明顯下調(diào)miR-21的表達(dá)(P<0.05)；沉默miR-21后，RES+miR-21 inhibitor組miR-21表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，且與RES+RSV組沒有明顯差異；過表達(dá)miR-21后，RES+miR-21 mimics組miR-21表達(dá)明顯上調(diào)，加入RSV預(yù)處理后同樣可下調(diào)miR-21的表達(dá)(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of RSV on the expression of miR-21 in primary atrial myocytes were detected by RT-qPCR. U6 was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsRES;&P<0.05vsRES+RSV;△△P<0.01vsRES+miR-21 mi-mics;▲P<0.05vsRES+RSV+miR-21 mimics.

圖3 RT-qPCR檢測RSV對原代心房肌細(xì)胞miR-21表達(dá)的影響

與control組比，RES組的CACNA1C表達(dá)量減少(P<0.05)，加入RSV干預(yù)后，CACNA1C的表達(dá)量增加(P<0.05)；沉默miR-21后，RES+miR-21 inhibitor組CACNA1C的表達(dá)量增加(P<0.05)，且與RES+RSV組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；過表達(dá)miR-21后，RES+miR-21 mimics組的CACNA1C表達(dá)量減少，加入RSV預(yù)處理CACNA1C的表達(dá)量增加(P<0.05)；CACNA1C的表達(dá)量與miR-21表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，見圖4。

RT-qPCR檢測不同分組L型鈣離子通道基因CACNB2的mRNA的表達(dá)，CACNB2的mRNA表達(dá)趨勢與CACNA1C的mRNA表達(dá)趨勢類似，見圖5。

3 Western blot檢測原代心房肌細(xì)胞 Cav1.2和Cavβ2蛋白的表達(dá)

各組Cav1.2和Cavβ2蛋白表達(dá)與CACNA1C和CACNB2 mRNA表達(dá)的趨勢一致，見圖6。

討 論

房顫的發(fā)生和發(fā)展過程中伴隨著心房電重構(gòu)，電重構(gòu)的過程又能導(dǎo)致房顫惡化，即房顫導(dǎo)致房顫[13]。

Figure 4.The effects of RSV on the mRNA expression of CACNA1C were detected by RT-qPCR. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsRES;&&P<0.01vsRES+RSV;△△P<0.01vsRES+miR-21 mimics;▲P<0.05vsRES+RSV+miR-21 mimics.

圖4 RT-qPCR檢測RSV對CACNA1C mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.The effects of RSV on the mRNA expression of CACNB2 were detected by RT-qPCR. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsRES;&&P<0.01vsRES+RSV;△△P<0.01vsRES+miR-21 mimics;▲P<0.05vsRES+RSV+miR-21 mimics.

圖5 RT-qPCR檢測RSV對CACNB2 mRNA表達(dá)的影響

心房電重構(gòu)主要表現(xiàn)為心房有效不應(yīng)期和動(dòng)作電位時(shí)程呈進(jìn)行性縮短，傳導(dǎo)速度減慢，不應(yīng)期離散度增加，以及頻率適應(yīng)性減退等[14-15]，而這些主要是通過離子通道的改變實(shí)現(xiàn)的，鉀離子通道電流、鈣離子通道電流等均參與動(dòng)作電位的形成。房顫的治療原則包括：控制心室率、抗凝治療、緩解癥狀、治療基礎(chǔ)心臟病和誘發(fā)因素、恢復(fù)并維持竇性心律。目前臨床上治療房顫的藥物療效并不十分理想，而導(dǎo)管消融術(shù)很難將多個(gè)分布的局灶全部發(fā)現(xiàn)，且復(fù)發(fā)率高，兩者均有明顯的局限性[16-17]，因此探尋新的治療方法尤為重要。電重構(gòu)發(fā)生在房顫的早期階段，在此階段針對房顫發(fā)生機(jī)制的上游治療正越來越得到重視。

Figure 6.The effects of RSV on the protein expression of Cav1.2 and Cavβ2were detected by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsRES;&&P<0.01vsRES+RSV;△△P<0.01vsRES+miR-21 mimics;▲▲P<0.01vsRES+RSV+miR-21 mimics.

圖6 Western blot檢測RSV對Cav1.2和Cavβ2蛋白表達(dá)的影響

miRNA是一類長約22個(gè)核苷酸的單鏈、內(nèi)源性、非編碼的小分子RNA。近年來隨著對房顫發(fā)生機(jī)制研究的深入，越來越多研究表明miRNA參與心房重構(gòu)的調(diào)控。Luo等[18]通過研究證實(shí)miRNA參與心臟電重構(gòu)，他們結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)了生物信息學(xué)分析，來證實(shí)miRNA具有調(diào)節(jié)編碼人類心臟離子通道蛋白基因的潛能。房顫的發(fā)生涉及多個(gè)離子通道蛋白的改變，而 miRNA參與調(diào)控多個(gè)心臟電重構(gòu)相關(guān)蛋白的表達(dá)[19]，因此miRNA表達(dá)失衡引起離子通道蛋白功能失調(diào)可能是房顫發(fā)生的電生理基礎(chǔ)，也可能成為抗心律失常藥物的作用靶點(diǎn)[20]。同時(shí)也有研究認(rèn)為，miRNA可能通過調(diào)控離子通道蛋白的表達(dá)，從而表現(xiàn)出促房顫或抗房顫的作用[21]。

RSV一種非黃酮類多酚化合物。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)RSV可以通過減輕心房纖維化[22]、抑制心房重構(gòu)[23]、減少氧化應(yīng)激損傷[24]等發(fā)揮抗心律失常作用。同時(shí)有研究表明，RSV可調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮其保護(hù)作用[25]。在本研究中，我們通過體外培養(yǎng)的乳鼠心房肌細(xì)胞，電刺激法建立心房細(xì)胞AF模型，課題組前期已證實(shí)miR-21在此模型中明顯上調(diào)[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RSV預(yù)處理可以下調(diào)miR-21的表達(dá)，并且編碼L型鈣離子通道的基因CACNA1C、CACNB2 的mRNA及Cav1.2、Cavβ2的蛋白表達(dá)量均增加，與miR-21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果表明CACNA1C和CACNB2 可能是miR-21的靶基因，這與Barana等[4]使用螢光素酶報(bào)告分析結(jié)果一致。為進(jìn)一步探討白藜三醇是否通過調(diào)控miR-21的表達(dá)參與電重構(gòu)，另增加過表達(dá)或沉默miR-21組,結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-21后，與RES+miR-21 mimics組相比，加入RSV干預(yù)可下調(diào)miR-21表達(dá)，且CACNA1C、CACNB2的mRNA及Cav1.2、Cavβ2的蛋白表達(dá)量增加。沉默miR-21后，RES+miR-21inhibitor及RES+miR-21inhibitor+RSV組miR-21表達(dá)均下調(diào)，同時(shí)CACNA1C、CACNB2 mRNA及Cav1.2、Cavβ2蛋白表達(dá)量增加，且與RES+RSV組相比無明顯差異。本研究結(jié)果顯示，RSV可能通過下調(diào)miR-21表達(dá)而調(diào)控其下游靶基因CACNA1C、CACNB2 及其編碼的Cav1.2、Cavβ2蛋白水平來減輕快速電刺激所致心房肌細(xì)胞電重構(gòu)，為房顫的上游治療提供了新的方向，為臨床應(yīng)用白藜三醇治療房顫提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Resveratrol reduces electrical remodeling in atrial fibrillation by down-regulating microRNA-21 in neonatal rat atrial myocytes

ZHANG Song1, SHEN Bing-bing1, LI Fei2, ZHU Qi-ren1, WANG Zhi-rong1, ZHANG Zhuo-qi1

(1DepartmentofCardiology,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China;2PizhouPeople’sHospital,Pizhou221300,China.E-mail:zhuoqizhang@sina.com)

AIM: To detect the effects of resveratrol (RSV) on the expression of microRNA-21 (miR-21) in primarily cultured neonatal rat atrial myocytes with electric remodeling induced by rapid electrical stimulation (RES). Furthermore, to find out the possible mechanism of miR-21 regulating electrical remodeling. METHODS: The neonatal rat atrial myocytes were isolated by double-enzyme (trypsin and collagenase I) digestion and differential adhesion method. The atrial fibrillation (AF) model was induced by RES. Atrial myocytes were randomly divided into 4 groups: control group, RSV group, RES group, and RSV+RES group. To further detect whether RSV regulated electric remodeling by miR-21, except the 4 groups, we add miR-21 over-expression group and miR-21 inhibitor group: RES+negative control (NC) group, RES+miR-21 mimics group, RES+miR-21 mimics+RSV group, RES+miR-21 inhibitor group, and RES+miR-21 inhibitor+RSV group. The optimal concentration and pretreatment time of resveratrol were determined by CCK-8 assay. The expression of miR-21 and the mRNA expression of L-type calcium channels CACNA1C and CACNB2 in atrial myocytes were detected by qPCR. The protein expression of L-type calcium channels Cav1.2 and Cavβ2in the atrial myocytes was analyzed by Western blot. RESULTS: The expression of miR-21 in RES group was significantly increased compared with control group， while preconditioning with RSV decreased the expression of miR-21. Compared with RES+miR-21 mimics group, the expression of miR-21 in RES+miR-21 mimics+RSV group was significantly decreased. Meanwhile, the mRNA expression of CACNA1C and CACNB2, and the protein levels of Cav1.2 and Cavβ2were increased (P<0.05). Compared with RES group, the expression of miR-21 in RES+miR-21 inhibitor group and RES+miR-21 inhibitor+RSV group was decreased, while the mRNA expression of CACNA1C and CACNB2, and the protein levels of Cav1.2 and Cavβ2were increased. However, no difference of the expression of miR-21, the mRNA expression of CACNA1C and CACNB2, and the protein levels of Cav1.2 and Cavβ2among RSV+RES, RES+miR-21 inhibitor and RES+miR-21 inhibitor+RSV groups was observed (P<0.05).CONCLUSION: In AF model induced by RES, RSV may reduce electric remodeling by inhibiting the expression of miR-21 and regulating the downstream target genes.

Resveratrol; MicroRNA-21; Rapid electrical stimulation; Electric remodeling; Neonatal rat atrial myocytes

1000- 4718(2017)08- 1353- 06

2017- 03- 07

2017- 03- 17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30800219)；徐州市醫(yī)學(xué)青年后備人才項(xiàng)目

R541.7； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.002

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