靜脈表型分子COUP-TFⅡ表達降低對血管內(nèi)皮細胞衰老的影響*

賴亞宇， 周 騏， 鄭 微， 靳 鵬， 顧文竹， 武曉靜△

(1第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院全軍心血管內(nèi)科中心，重慶 400037； 2重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400010)

·論 著·

靜脈表型分子COUP-TFⅡ表達降低對血管內(nèi)皮細胞衰老的影響*

賴亞宇1， 周 騏2， 鄭 微1， 靳 鵬1， 顧文竹1， 武曉靜1△

(1第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院全軍心血管內(nèi)科中心，重慶 400037；2重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400010)

目的： 觀察靜脈表型分子雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)表達對血管內(nèi)皮細胞衰老的影響和分子機制。方法: 通過RT-qPCR檢測比較人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAEC)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中COUP-TFⅡ的表達情況。使用10-5mol/L血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)HUVEC衰老，通過COUP-TFⅡ特異性小干擾RNA(siCOUP-TFⅡ)轉(zhuǎn)染HUVEC使其COUP-TFⅡ的表達降低，利用β-半乳糖苷酶染色、Western blot、CCK-8、細胞計數(shù)等方法分別觀察siCOUP-TFⅡ?qū)ngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老及增殖的影響，通過Western blot檢測Akt信號分子的表達變化。結(jié)果: 與HCAEC相比，HUVEC中COUP-TFⅡ呈顯著高表達；用siCOUP-TFⅡ抑制HUVEC的COUP-TFⅡ表達時，能顯著促進AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老并抑制內(nèi)皮細胞增殖和p-Akt蛋白水平；加入Akt激動劑SC79 (4 mg/L)能夠部分逆轉(zhuǎn)siCOUP-TFⅡ?qū)ngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC衰老和增殖的影響。結(jié)論: COUP-TFⅡ表達降低可促進血管內(nèi)皮細胞衰老并抑制內(nèi)皮細胞增殖，其機制可能與調(diào)節(jié)Akt信號有關(guān)。

動脈粥樣硬化; 血管內(nèi)皮細胞； 細胞衰老； 細胞增殖； 雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ

動脈粥樣硬化是造成冠心病和外周血管病的重要原因，是現(xiàn)代社會致死、致殘、嚴重影響人類健康和生活質(zhì)量的主要因素之一。動脈粥樣硬化好發(fā)于動脈，雖然靜脈與動脈同處于一個血管系統(tǒng)中，卻未見靜脈粥樣硬化，這其中有部分血流動力學(xué)等因素的影響。目前尚不清楚動、靜脈對粥樣硬化易感性的差異除受血流動力學(xué)等環(huán)境因素影響外，是否還與二者不同的分子表型有關(guān)。

雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ(chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ，COUP-TFⅡ)是一種孤兒受體超家族成員，在胚胎時期對血管和淋巴管的生成起著重要調(diào)節(jié)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)COUP-TFⅡ只在靜脈內(nèi)皮表達，在胚胎血管形成時，其可通過抑制神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin， NP)-1和Notch信號分子的表達來維持血管的靜脈特征，而抑制靜脈內(nèi)皮COUP-TFⅡ表達后，靜脈就會逐漸呈現(xiàn)動脈的特征[2-3]。COUP-TFⅡ特異表達于靜脈內(nèi)皮，然而目前尚不清楚其是否參與調(diào)節(jié)了血管粥樣硬化的發(fā)生過程。血管內(nèi)皮細胞衰老是引起動脈粥樣硬化的重要發(fā)病機制之一[4]，為進一步研究動、靜脈本身分子表型差異與粥樣硬化發(fā)生的關(guān)系，本研究觀察了離體培養(yǎng)的人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(human coronary artery endothelial cells，HCAEC)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中COUP-TFⅡ表達的差異，并利用特異性COUP-TFⅡ小干擾RNA(si-COUP-TFⅡ)抑制臍靜脈內(nèi)皮細胞COUP-TFⅡ表達，觀察其對血管內(nèi)皮細胞衰老及增殖的影響，試圖從血管表型差異的角度揭示動脈粥樣硬化的發(fā)病機制。

材 料 和 方 法

1 材料及試劑

HUVEC和HCAEC購自Promocell；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購于Gibco；胰酶購于Hyclone；siRNA序列由上海吉瑪公司合成：COUP-TFⅡ siRNA正義鏈序列為5’-GGC CGU AUA UGG CAA UUC ATT-3’,反義鏈序列為5’-UGA AUU GCC AUA UAC GGC CTT-3’；對照 siRNA(control siRNA)正義鏈序列為5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’, 反義鏈序列為5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。RNA抽提試劑盒(RNAiso Kit)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit)和熒光定量PCR試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTM)均購于TaKaRa；所用引物由TaKaRa公司設(shè)計；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEI轉(zhuǎn)染稀釋液購于Invitrogen；血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)購于Sigma；β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)染色試劑盒購于碧云天生物試劑公司；CCK-8試劑盒購于Dojindo；抗COUP-TFⅡ抗體購于Abcam；抗Akt和抗p-Akt抗體購于CST；抗P53抗體購于Bioworld；ECL化學(xué)顯影液購于Millipore。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)HUVEC和HCAEC。定期換液，細胞融合度達到80%～90%時，用胰酶進行消化后傳代。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine 2000，按試劑規(guī)定操作，大致步驟如下(以6孔板為例)：用250 μL體積Opti-MEI培養(yǎng)基稀釋5 μL siRNA母液(最終干擾濃度為50 nmol/L)，輕輕混勻。使用前輕輕搖勻Lipofectamine 2000，然后取 5 μL Lipofectamine 2000在250 μL Opti-MEI培養(yǎng)基中稀釋，室溫放置5 min。將上述用Opti-MEI培養(yǎng)基稀釋的siRNA和Lipofectamine 2000混合，輕輕混勻，室溫放置20 min。將此混合物加入無血清DMEM中(終體積2 mL)，在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4～6 h后換用新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 RT-qPCR檢測細胞COUP-TFⅡ的mRNA表達 用RNAiso Kit提取細胞中總RNA，將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用COUP-TFⅡ?qū)崟r熒光定量PCR引物進行熒光定量PCR檢測。COUP-TFⅡ上游引物為5’-AAC ACA TCG AGT GCG TGG TGT-3’，下游引物為5’-TAC TGG CAC TGG TTG CGA TG-3’。采用GAPDH作為內(nèi)參照，其上游引物為5’-AAC ACA TCG AGT GCG TGG TGT-3’，下游引物為5’-GTA GAG GCA GGG ATG ATG TTC T-3’。采用實時熒光定量PCR儀(StepOne Plus)擴增上述基因，其反應(yīng)混合物為cDNA 2.0 μL， 2×SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ混合物10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，dH2O 6.0 μL。按95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s的條件進行40個循環(huán)反應(yīng)。采用2-ΔΔCt原理進行mRNA表達量計算。

2.4 CCK-8實驗檢測細胞活力 HUVEC培養(yǎng)于96孔板，每孔1×103個細胞，實驗組和對照組每種處理方式接種3～6個復(fù)孔，待細胞處于指數(shù)生長階段分別轉(zhuǎn)染COUP-TFⅡ siRNA或control siRNA，4～6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h使細胞處于同步化狀態(tài)，AngⅡ(10-5mol/L)刺激48 h，加入CCK-8 試劑10 μL，37 ℃孵育4 h，酶標儀(Molecular)檢測450 nm處的吸光度。

2.5 細胞計數(shù) 將HUVEC接種于6孔板，每孔1×105個細胞，待細胞處于指數(shù)生長階段轉(zhuǎn)染COUP-TFⅡ siRNA或control siRNA，4～6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h使細胞處于同步化狀態(tài)，AngⅡ(10-5mol/L)刺激48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，利用胰酶消化的方法收集細胞，用1 mL細胞培養(yǎng)基重懸細胞，取100 μL細胞懸液加入9.9 mL培養(yǎng)基進行稀釋，利用細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)，觀察細胞增殖情況。

2.6 Western blot分析 抽提各組細胞的蛋白，定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。蛋白在電泳分離結(jié)束后，切下目的蛋白所處的條帶區(qū)域，置于電轉(zhuǎn)裝置的海綿上，用PVDF膜覆蓋，放入電轉(zhuǎn)液中，轉(zhuǎn)膜80 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于培養(yǎng)皿，用TBST洗膜10 min×3次，之后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后，將稀釋后的 I 抗孵育在PVDF膜上，置于4 ℃過夜。用TBST洗膜10 min×3次， 加入稀釋后的 Ⅱ 抗37 ℃ 孵育1 h。用TBST洗膜10 min×3次，最后將顯影液覆蓋在膜上，在成像系統(tǒng)下進行顯影。

2.7 β-Gal細胞染色 依據(jù)β-Gal染色試劑盒說明，吸除培養(yǎng)板里的液體，用PBS洗滌接種在培養(yǎng)板上的細胞1次，每孔用1 mL β-Gal 染色固定液，室溫固定15 min。將染色固定液棄去，加入PBS，進行洗滌(3 min×3次)。清洗后，每個孔加入1 mL按說明配置好的工作液，放入37 ℃孵箱中，在無CO2條件下過夜，并用保鮮膜將6孔板進行密封以防止蒸發(fā)。倒置顯微鏡下每組樣本任意挑選3個視野，觀察胞漿被染為藍色的情況，并計算藍色細胞在總細胞數(shù)中所占的百分比。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HCAEC和HUVEC COUP-TFⅡ表達的差異

為了評估COUP-TFⅡ在離體動、靜脈內(nèi)皮細胞的表達情況，我們將HUVEC和HCAEC置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，待密度達到70%～80%時，提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，利用實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在HCAEC中幾乎測不到COUP-TFⅡ的mRNA表達，但在HUVEC中COUP-TFⅡ mRNA呈顯著高表達，2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of COUP-TFⅡ in HCAEC and HUVEC. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsHCAEC.

圖1 RT-qPCR檢測HCAEC和HUVEC中 COUP-TFⅡ mRNA的表達

2 COUP-TFⅡ siRNA 對HUVEC中COUP-TFⅡ mRNA和蛋白水平的影響

將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉(zhuǎn)染至 HUVEC，24 h后抽提其RNA，逆轉(zhuǎn)錄，經(jīng)熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h后siCOUP-TFⅡ組細胞的COUP-TFⅡ表達量明顯下降，mRNA表達量是對照組的45.63%，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；轉(zhuǎn)染48 h后抽提蛋白，經(jīng) Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，siCOUP-TFⅡ組細胞的COUP-TFⅡ蛋白表達水平較對照組明顯下降，蛋白表達量是對照組的43.32%，與對照組相比較，具有顯著差異(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Knockdown of COUP-TFⅡ expression in HUVEC by siRNA transfection. A: the relative mRNA expression of COUP-TFⅡ detected by RT-qPCR; B: the protein expression of COUP-TFⅡ determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖2 RT-qPCR及Western blot檢測COUP-TFⅡ的表達

3 抑制HUVEC COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老的影響

將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉(zhuǎn)染至HUVEC，采用AngⅡ(0 mol/L、10-5mol/L)刺激作用48 h后，利用β-Gal化學(xué)染色，染色結(jié)果顯示，AngⅡ濃度0 mol/L時，衰老相關(guān)β-Gal染色陽性率siCOUP-TFⅡ組為6.65%±1.32%，對照組為6.22%±1.92%，兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；AngⅡ濃度為10-5mol/L時，衰老相關(guān)β-Gal染色陽性率siCOUP-TFⅡ組為81.07%±4.52%，對照組β-Gal染色陽性率(43.90%±6.73%)明顯低于siCOUP-TFⅡ組(P<0.05)，見圖3。利用Western blot 檢測衰老分子標志物P53蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，AngⅡ濃度為0 mol/L時，siCOUP-TFⅡ組與對照組相比較，P53蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；AngⅡ濃度為10-5mol/L時，與對照組相比較，siCOUP-TFⅡ組P53蛋白的表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖3。結(jié)果表明抑制COUP-TFⅡ?qū)A(chǔ)狀態(tài)HUVEC衰老無顯著影響，但抑制其表達后能進一步促進AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞衰老。

Figure 3.The senescence of AngⅡ induced-HUVEC after COUP-TFⅡ siRNA transfeetion. A: the β-Gal staining of HUVEC (×200); B: the protein expression of P53 determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖3 抑制HUVEC的COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老的影響

4 抑制HUVEC COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖的影響

將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉(zhuǎn)染至HUVEC，AngⅡ (0 mol/L、10-5mol/L)刺激作用48 h后，利用CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn)，AngⅡ濃度為0 mol/L時，在450 nm處的相對吸光度siCOUP-TFⅡ組為98.39%±3.15%，對照組為100.00%±2.72%，兩者之間相對吸光度的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；而AngⅡ濃度為10-5mol/L時，在450 nm處的相對吸光度siCOUP-TFⅡ組為57.43%±5.67%，對照組為100.00%±8.08%，siCOUP-TFⅡ組的相對吸光度較對照組明顯降低，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。細胞計數(shù)結(jié)果顯示，AngⅡ濃度為0 mol/L時，對照組的細胞計數(shù)較siCOUP-TFⅡ組比較，兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；而AngⅡ濃度為10-5mol/L時，對照組的細胞計數(shù)為顯著高于siCOUP-TFⅡ組，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。結(jié)果表明抑制COUP-TFⅡ?qū)A(chǔ)狀態(tài)的HUVEC增殖無明顯影響，但抑制COUP-TFⅡ表達后能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖。

Figure 4.The proliferation of AngⅡ-induced HUVEC after COUP-TFⅡ siRNA transfection. A: comparison of theAvalues by CCK-8 assay; B: the results of the cell number counting; C: the images of HUVEC under microscope (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖4 抑制HUVEC COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖的影響

5 COUP-TFⅡ表達對HUVEC細胞衰老增殖的影響與Akt信號的關(guān)系

Akt信號是影響細胞衰老和增殖的關(guān)鍵信號通路，為了探討COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老增殖的機制，我們進一步觀察了其與Akt信號的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉(zhuǎn)染至HUVEC，在AngⅡ濃度為0 mol/L時，siCOUP-TFⅡ組與對照組相比較， Akt及p-Akt的蛋白水平并無差異。與對照組相比，在AngⅡ濃度為10-5mol/L時siCOUP-TFⅡ組的Akt蛋白水平無顯著差異，但p-Akt的蛋白水平明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The protein levels of p-Akt/Akt in the AngⅡ induced-HUVEC after COUP-TFⅡ siRNA transfection determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖5 Western blot檢測抑制COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC中p-Akt蛋白水平的影響

為進一步闡明COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)AngⅡ刺激血管內(nèi)皮衰老和增殖與Akt信號的關(guān)系，我們加入Akt激動劑SC79(4 mg/L)，利用β-Gal染色、Western blot實驗檢測P53蛋白及用CCK-8、細胞計數(shù)的方法分別觀察HUVEC衰老及增殖情況，結(jié)果顯示加入Akt激動劑SC79后，β-Gal染色陽性率明顯較siCOUP-TFⅡ組降低(P<0.05)；Western blot檢測衰老分子標志物P53蛋白表達水平也明顯降低(P<0.05)；此外，與siCOUP-TFⅡ組比較，SC79與siCOUP-TFⅡ合用組在450 nm的相對吸光度及細胞計數(shù)值均明顯升高(P<0.05)，見圖6。這提示Akt激動劑SC79能夠部分逆轉(zhuǎn)siCOUP-TFⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細胞衰老和增殖的影響。

討 論

本研究中，我們觀察了靜脈表型分子COUP-TF Ⅱ 對血管內(nèi)皮細胞衰老增殖的影響及其分子機制。我們發(fā)現(xiàn)COUP-TF Ⅱ 在離體HUVEC呈現(xiàn)顯著高表達；在無Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的基礎(chǔ)狀態(tài)下，抑制COUP-TF Ⅱ 表達后HUVEC的衰老增殖并無顯著變化；而在Ang Ⅱ (10-5mol/L)誘導(dǎo)狀態(tài)下，抑制COUP-TF Ⅱ 表達可促進HUVEC衰老并抑制其增殖，其分子機制可能與其調(diào)節(jié)Akt信號有關(guān)。

Figure 6.The effects of Akt activator SC79 on senescence and proliferation of AngⅡ-indued HUVEC after transfection with siCOUP-TFⅡ. A: the protein levels of p-Akt/Akt; B: the β-Gal staining of HUVEC (×200); C: the protein expression of P53 by Western blot; D: theAvalue of CCK-8 assay; E: the cell number counting (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vssiCOUP-TFⅡ.

圖6 Akt激動劑SC79對AngⅡ誘導(dǎo)的低表達COUP-TFⅡ的HUVEC衰老增殖的影響

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在體情況下，COUP-TFⅡ只在靜脈血管內(nèi)皮中表達，而在動脈血管內(nèi)皮中不表達[2-3]。然而，COUP-TFⅡ不僅在胚胎發(fā)育時決定動靜脈表型，還具有調(diào)節(jié)代謝功能。已有研究表明，線粒體進行β氧化和糖代謝過程相關(guān)的幾種酶都是COUP-TFⅡ的下游靶基因，COUP-TFⅡ可通過抑制或增強它們的轉(zhuǎn)錄活性從而參與代謝的調(diào)節(jié)[5]； Weatherford等[6]研究發(fā)現(xiàn)，COUP-TFⅡ可以抑制腎素的表達，而腎素在破壞內(nèi)皮細胞之間的連接、內(nèi)皮細胞與單核細胞間的相互黏附以及在一些與血小板源性相關(guān)生長因子的生成過程中均起著重要作用，而這些都是導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生的重要途徑；Okamura等[7]發(fā)現(xiàn)COUP-TFⅡ能通過Wnt途徑抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ的基因表達，從而通過影響氧化應(yīng)激過程，在粥樣硬化啟動、血管壁細胞功能和斑塊的穩(wěn)定性等過程中發(fā)揮重要作用。最近更有研究發(fā)現(xiàn)，COUP-TFⅡ表達降低后，可以上調(diào)炎癥基因的表達和下調(diào)抗血栓形成基因的表達，從而使血管內(nèi)皮細胞表型表現(xiàn)出促動脈粥樣硬化發(fā)生的趨勢[8]。因此，上述研究提示，COUP-TFⅡ不僅對動靜脈表型的分化過程起著關(guān)鍵作用，而且還可能對動脈粥樣硬化的發(fā)生有著重要的影響。

為進一步研究COUP-TFⅡ與動脈粥樣硬化易感性差異的關(guān)系，我們先在離體情況下分別培養(yǎng)了HCAEC和HUVEC，檢測了COUP-TFⅡ在兩者中mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COUP-TFⅡ在HUVEC中呈現(xiàn)出明顯的高表達，結(jié)果與在體情況下是一致的。血管內(nèi)皮細胞衰老是內(nèi)皮功能失調(diào)的病理生理機制之一，在許多血管性疾病的啟始過程中起著重要作用。Qin等[9]在前列腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，COUP-TFⅡ的過表達能夠減弱致癌基因誘導(dǎo)的癌組織衰老，而在PTEN敲除小鼠模型中，COUP-TFⅡ表達的降低可以通過激活TGF-β信號誘導(dǎo)衰老。但是COUP-TFⅡ表達降低后血管內(nèi)皮細胞的衰老情況還不清楚。以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)β-Gal活性和P53蛋白表達變化是細胞衰老的標志之一[10-11]。因此，我們通過檢測細胞衰老相關(guān)β-Gal陽性率和P53蛋白表達的方法來探討了COUP-TFⅡ表達降低后與HUVEC衰老之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過siRNA抑制HUVEC中COUP-TFⅡ的表達后，在無AngⅡ誘導(dǎo)狀態(tài)下，HUVEC在siCOUP-TFⅡ組與對照組的β-Gal染色陽性率和衰老標志分子P53蛋白表達并無顯著差異；而在一定濃度AngⅡ(10-5mol/L)的誘導(dǎo)刺激后，與對照組相比較，siCOUP-TFⅡ組衰老血管內(nèi)皮細胞比例和P53蛋白表達量明顯升高。從而表明，COUP-TFⅡ?qū)oAngⅡ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞衰老并無明顯影響，但對AngⅡ誘導(dǎo)狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞的衰老起著一定保護作用，而抑制COUP-TFⅡ表達可以促進血管內(nèi)皮細胞的衰老。

既往研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ在誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞發(fā)生衰老變化時，可下調(diào)處于S期細胞的比例，最終抑制細胞進入增殖周期而抑制其增殖[12]。Qin等[13]通過研究也發(fā)現(xiàn)，COUP-TFⅡ在控制血管生長時可以調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移功能。Zheng等[14]也研究發(fā)現(xiàn)，在腎腫瘤細胞中用siRNA抑制COUP-TFⅡ的表達后，腎腫瘤細胞的增殖能力顯著降低，而凋亡增加。Park等[15]發(fā)現(xiàn)，生長分化因子15在人動脈內(nèi)皮細胞過表達促進內(nèi)皮細胞衰老的同時，降低其增殖能力。因此，我們進一步探索了COUP-TFⅡ表達降低后，在衰老發(fā)生的同時，血管內(nèi)皮細胞的增殖變化。在本研究中，我們利用siRNA抑制HUVEC中COUP-TFⅡ的表達，在無AngⅡ誘導(dǎo)狀態(tài)下，HUVEC不受siCOUP-TFⅡ影響；而在一定濃度AngⅡ(10-5mol/L)的誘導(dǎo)刺激作用一定時間后，siCOUP-TFⅡ組細胞增殖能力明顯降低。因此，說明COUP-TFⅡ?qū)oAngⅡ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞增殖并無顯著影響，但對AngⅡ誘導(dǎo)狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞增殖能力有明顯調(diào)節(jié)作用。

近年來研究已表明，Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是調(diào)控衰老的一條重要信號途徑。在胞漿中，Akt磷酸化后可在細胞衰老、增殖的調(diào)控中表現(xiàn)出重要作用[16]，而Ser473位點在Akt磷酸化位點中作為最直接的位點，被廣泛用作Akt活化的標志。因此，我們用Western blot檢測了在抑制COUP-TFⅡ表達后，Akt Ser473位點磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無AngⅡ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)狀態(tài)時，抑制COUP-TFⅡ表達后，p-Akt/Akt的蛋白水平在siCOUP-TFⅡ組和對照組之間并無發(fā)生顯著差異；但在AngⅡ(10-5mol/L)誘導(dǎo)一定時間后，雖然siCOUP-TFⅡ組Akt蛋白與對照組相比較并無明顯變化，但磷酸化Akt蛋白的表達量較對照組相比明顯下降，提示抑制COUP-TFⅡ表達后，HUVEC衰老增殖的變化可能與Akt信號參與有關(guān)。為了進一步驗證上述結(jié)果，我們又在抑制COUP-TFⅡ表達后，加入了Akt激動劑SC79，結(jié)果表明SC79能夠部分逆轉(zhuǎn)由于抑制COUP-TFⅡ表達而引起的HUVEC衰老和增殖變化。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明靜脈表型分子COUP-TFⅡ在離體HUVEC呈現(xiàn)顯著高表達， COUP-TFⅡ?qū)A(chǔ)狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞衰老和增殖無明顯影響，但在AngⅡ誘導(dǎo)下，抑制靜脈表型分子COUP-TFⅡ的表達會促進HUVEC的衰老，抑制HUVEC的增殖，其作用機制可能與其調(diào)節(jié)Akt信號有關(guān)。COUP-TFⅡ是區(qū)別動、靜脈內(nèi)皮細胞的重要分子標志之一，其對血管內(nèi)皮細胞衰老與增殖的調(diào)節(jié)，提示其影響了動、靜脈血管對粥樣硬化發(fā)生的易感性。本研究從血管本身分子差異的角度揭示了動、靜脈粥樣硬化易感性的機制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of venous marker COUP-TFⅡ knockdown on senescence of vascular endothelial cells

LAI Ya-yu1, ZHOU Qi2, ZHENG Wei1, JIN Peng1, GU Wen-zhu1, WU Xiao-jing1

(1CardiologyCenterofPLA,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;2CardiovascularDepartmentofTheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:xiaojingwu1992@163.com)

AIM: To investigate the effect of venous marker chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ (COUP-TFⅡ) expression on vascular endothelial cell senescence and its molecular mechanism. METHODS: The mRNA expression of COUP-TFⅡ in the human coronary artery endothelial cells (HCAEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was detected by RT-qPCR. After transfection with a COUP-TFⅡ siRNA (siCOUP-TFⅡ) to inhibit COUP-TFⅡ expression in the HUVEC, the senescence and proliferation of endothelial cells were evaluated by β-galactosidase staining, Western blot， CCK-8 assay and cell counting after treatment with 10-5mol/L angiotensin Ⅱ (AngⅡ). The protein levels of Akt and p-Akt were determined by Western blot. RESULTS: Compared with the HCAEC, COUP-TFⅡ was significantly highly expressed in the HUVEC. Knockdown of COUP-TFⅡ via siCOUP-TFⅡ significantly induced endothelial cell senescence and inhibited endothelial cell proliferation and p-Akt level after treatment with AngⅡ at 10-5mol/L. Furthermore, an Akt activator SC79 at 4 mg/L partly reversed the effect of siCOUP-TFⅡ on AngⅡ-induced endothelial cell senescence and proliferation. CONCLUSION: Knockdown of COUP-TFⅡ promotes endothelial cell senescence and inhibits endothelial cell proliferation, which might be partly regulated by Akt signaling.

Atherosclerosis; Vascular endothelial cells; Cell senescence; Cell proliferation; Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ

1000- 4718(2017)08- 1345- 08

2016- 12- 12

2017- 03- 02

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81370404； No. 91539104)

R339.3+8; R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.001

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