兩種丹參毛狀根對(duì)茉莉酸甲酯的差異響應(yīng)

方譽(yù)民，楊東風(fēng)，梁宗鎖

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

兩種丹參毛狀根對(duì)茉莉酸甲酯的差異響應(yīng)

方譽(yù)民，楊東風(fēng)，梁宗鎖

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

為了闡明紫花丹參和藏丹參對(duì)信號(hào)分子的差異響應(yīng)，選擇茉莉酸甲酯作為信號(hào)分子誘導(dǎo)兩種丹參毛狀根的代謝，對(duì)比兩者生長(zhǎng)狀態(tài)、次生代謝物積累變化和基因表達(dá)模式。結(jié)果表明：200 μmol/L茉莉酸甲酯顯著促進(jìn)藏丹參毛狀根中二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B積累，而對(duì)紫花丹參僅僅影響其毛狀根中二氫丹參酮I、隱丹參酮、咖啡酸和丹酚酸B積累；藏丹參毛狀根中參與丹參酮和丹酚酸合成的關(guān)鍵基因比紫花丹參毛狀根中相應(yīng)基因更強(qiáng)烈地響應(yīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，這可能導(dǎo)致藏丹參毛狀根產(chǎn)生更強(qiáng)烈的隱丹參酮、丹參酮IIA、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B代謝響應(yīng)。

紫花丹參；藏丹參；毛狀根；茉莉酸甲酯；次生代謝；基因表達(dá)

0 引 言

紫花丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)和藏丹參(SalviacastaneaDiels f.tomentosaStib)同屬于唇形科藥用植物，主要用于治療心腦血管疾病[1-2]。丹參酮和丹酚酸是兩種丹參的主要有效成分：丹參酮包括二氫丹參酮I(dihydrotanshinone I)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、丹參酮I(tanshinone I)和丹參酮IIA(tanshinone IIA)等，而丹酚酸包括迷迭香酸(rosmarinic acid)、咖啡酸(caffeic acid)和丹酚酸B(salvianolic acid B)等[3-4]。紫花丹參和藏丹參中次生代謝存在差異，紫花丹參積累更高含量的丹酚酸B，而藏丹參產(chǎn)生更高含量的丹參酮[3-4]。目前，關(guān)于兩種丹參中天然產(chǎn)物積累差異的形成機(jī)制尚不明確。藥用植物中天然產(chǎn)物含量較低，并且種質(zhì)退化加劇中藥資源短缺問題，通過植物組織工程可以顯著地提高有效成分的產(chǎn)生，包括培養(yǎng)條件優(yōu)化、前體添加和誘導(dǎo)子處理等[5]。誘導(dǎo)子可以誘導(dǎo)藥用植物毛狀根中關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)不同有效成分的積累，如丹參酮[2]、丹酚酸[6]和黃酮[7]。茉莉酸甲酯是與損傷響應(yīng)相關(guān)的植物激素和信號(hào)分子，廣泛用于各種藥用植物次生代謝的研究，如藏丹參[2]、黃芩(Scutellariabaicalensis)[7]和黃花蒿(Artemisiaannua)[8]，但茉莉酸甲酯在調(diào)控紫花丹參和藏丹參次生代謝中所起的作用尚不清楚。因此，本文通過茉莉酸甲酯分別誘導(dǎo)紫花丹參和藏丹參毛狀根，比較兩種丹參毛狀根的生物量、次生代謝物含量和基因表達(dá)變化。

為了分析兩種丹參次生代謝對(duì)茉莉酸甲酯的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)丹參酮和丹酚酸合成途徑中16個(gè)關(guān)鍵基因與旁支途徑中2個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。二萜化合物基因包括乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase, AACT)基因、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR)基因、1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase, DXS)基因、1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, DXR)基因、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphatesynthase, GGPPS)基因、柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase, CPS)基因、類貝殼杉烯合酶(ent-kaurene synthase like 2, KSL)基因和兩個(gè)細(xì)胞色素P450(CYP76AH1和CYP76AH3)基因。酚酸生物合成基因包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)基因、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase, C4H)基因、4-香豆素CoA連接酶(4-coumarate-CoA ligase, 4CL)基因、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(tyrosine aminotransferase,TAT)基因、對(duì)羥基苯丙酮酸雙加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD)基因、對(duì)羥基苯丙酮酸還原酶(4-hydroxyphenylpyruvate reductase, HPPR)基因、迷迭香酸合成酶(rosmarinic acid synthase, RAS)基因和細(xì)胞色素P450(CYP98A78)基因。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：紫花丹參和藏丹參毛狀根由發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834分別侵染紫花丹參和藏丹參無(wú)菌苗獲得，茉莉酸甲酯和甲醇購(gòu)自Sigma公司，多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit和熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII購(gòu)自Takara公司，熒光定量PCR引物(如表1所示)由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表1 丹參中次生代謝相關(guān)基因的特異性引物

儀器：生物樣品均質(zhì)儀(Bioprep-24，杭州奧盛儀器有限公司)；超聲洗滌器(KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Waters e2695，美國(guó)Waters公司)；分光光度計(jì)(NANODROP 2000, Thermo Scientific)；熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex, ABI)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丹參毛狀根培養(yǎng)

配制6,7-V液體培養(yǎng)基，并將pH值調(diào)為5.8；每個(gè)100 mL錐形瓶中加入50 mL培養(yǎng)基，滅菌冷卻備用。在超凈臺(tái)中向每個(gè)錐形瓶中接入0.2 g長(zhǎng)勢(shì)較好一致的新鮮丹參毛狀根，放入恒溫?fù)u床中，在25 ℃、110 r/min下黑暗培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)18 d加入茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子。

1.2.2 丹參毛狀根誘導(dǎo)和樣品采集

茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子配制按照文獻(xiàn)[2]中的方法進(jìn)行。用無(wú)水乙醇作為助溶劑，配制200 mmol/L母液，用0.22 μm無(wú)菌濾頭過濾除菌，以200 μmol/L終濃度處理繼代培養(yǎng)到第18 d的丹參毛狀根，誘導(dǎo)后12 h、1 d、3 d和 6 d分別取樣。

1.2.3 丹參酮和丹酚酸的高效液相分析

丹參酮和丹酚酸的提取和檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9]中的方法。

1.2.4 基因表達(dá)分析

首先，參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。然后，用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit配制反應(yīng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。最后，用試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII配制反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，59 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 5作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，圖中數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用SPSS軟件22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯對(duì)紫花丹參和藏丹參毛狀根生長(zhǎng)的影響

為了對(duì)比茉莉酸甲酯對(duì)兩種丹參毛狀根生長(zhǎng)的

影響，對(duì)紫花丹參和藏丹參毛狀根的生物量(鮮重和干重)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后12 h和第3 d，紫花丹參毛狀根鮮重受到抑制。紫花丹參毛狀根干重在12 h受到抑制，而在第1 d有所促進(jìn)。然而，茉莉酸甲酯對(duì)藏丹參毛狀根的生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響，如圖1所示。

圖1 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下兩種丹參毛狀根的生長(zhǎng)注：Sm：紫花丹參，Sc：藏丹參；CK：對(duì)照組，MJ：茉莉酸甲酯處理組；“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。

2.2 茉莉酸甲酯對(duì)紫花丹參和藏丹參毛狀根中次 生代謝物積累的影響

為了闡明兩種丹參毛狀根對(duì)茉莉酸甲酯的差異代謝響應(yīng)，本文對(duì)4種丹參酮(二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA)和3種丹酚酸(迷迭香酸、咖啡酸和丹酚酸B)的積累變化進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示：茉莉酸甲酯不能誘導(dǎo)兩種丹參毛狀根中丹參酮I的產(chǎn)生；茉莉酸甲酯在12 h促進(jìn)紫花丹參毛狀根中二氫丹參酮I積累，在第3 d促進(jìn)藏丹參毛狀根中二氫丹參酮I的積累；藏丹參毛狀根中隱丹參酮積累在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后第6 d提高(1.93倍)，在紫花丹參毛狀根中隱丹參酮含量在誘導(dǎo)后第1 d受到抑制；茉莉酸甲酯不能刺激紫花丹參毛狀根中丹參酮IIA積累，在誘導(dǎo)后第3 d抑制藏丹參毛狀根中丹參酮IIA含量，并在誘導(dǎo)后第6 d促進(jìn)藏丹參毛狀根中丹參酮IIA積累(1.78倍)。藏丹參毛狀根中咖啡酸積累在誘導(dǎo)后第6 d顯著提高(1.34倍)，而紫花丹參毛狀根中咖啡酸含量在誘導(dǎo)后第3 d受到促進(jìn)。茉莉酸甲酯不能誘導(dǎo)紫花丹參毛狀根中迷迭香酸的產(chǎn)生，而促進(jìn)藏丹參毛狀根中迷迭香酸積累，其迷迭香酸積累在誘導(dǎo)后第6 d顯著提高(2.49倍)。兩種丹參毛狀根中丹酚酸B的產(chǎn)生均能被茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，但茉莉酸甲酯更強(qiáng)烈地誘導(dǎo)藏丹參毛狀根中丹酚酸B積累，藏丹參毛狀根中丹酚酸B積累在誘導(dǎo)后第6 d顯著提高(3.05倍)。茉莉酸甲酯顯著促進(jìn)藏丹參毛狀根中二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的積累，而僅僅影響紫花丹參毛狀根中二氫丹參酮I、隱丹參酮、咖啡酸和丹酚酸B的產(chǎn)生。

2.3 藏丹參和紫花丹參毛狀根中關(guān)鍵基因的誘導(dǎo) 表達(dá)模式

為了進(jìn)一步闡明茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下兩種丹參毛狀根的次生代謝差異，對(duì)10個(gè)二萜化合物生物合成基因和8個(gè)酚酸生物合成基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。茉莉酸甲酯處理后兩種丹參毛狀根中7個(gè)二萜化合物生物合成基因和6個(gè)酚酸生物合成基因的表達(dá)上調(diào)，包括AACT1、HMGR1、DXS2、CPS1、KSL2、CYP76AH1、CYP76AH3、PAL1、C4H、TAT1、HPPR、RAS和CYP98A78。茉莉酸甲酯在誘導(dǎo)后6 d內(nèi)始終上調(diào)紫花丹參毛狀根中TAT1、HPPR、RAS和CYP98A78的表達(dá)，而一直上調(diào)藏丹參毛狀根中AACT1、C4H、TAT1和CYP98A78的表達(dá)。但是，兩種丹參毛狀根中一些基因的表達(dá)模式存在較大差異，這些基因包括DXS1、DXR、GGPPS1、4CL1和HPPD。茉莉酸甲酯在12 h下調(diào)紫花丹參毛狀根中DXS1的表達(dá)，而不能誘導(dǎo)藏丹參毛狀根中DXS1表達(dá)。在紫花丹參毛狀根中茉莉酸甲酯不能誘導(dǎo)DXR表達(dá)，而在藏丹參毛狀根中茉莉酸甲酯在第3 d上調(diào)DXR的表達(dá)。茉莉酸甲酯在第6 d下調(diào)紫花丹參毛狀根中GGPPS1的表達(dá)，而在12 h和第1 d分別上調(diào)和下調(diào)藏丹參毛狀根中GGPPS1的表達(dá)。茉莉酸甲酯上調(diào)紫花丹參毛狀根中4CL1的表達(dá)，但在第1 d下調(diào)藏丹參毛狀根中4CL1的表達(dá)。茉莉酸甲酯上調(diào)紫花丹參毛狀根中HPPD的表達(dá)，卻不能誘導(dǎo)藏丹參毛狀根中HPPD的表達(dá)(圖3-圖4)。此外，與紫花丹參毛狀根相比，藏丹參毛狀根中一些參與特定代謝的基因?qū)岳蛩峒柞ジ舾校ˋACT1、HMGR1、DXS2、GGPPS1、CPS1、CYP76AH3、PAL1、C4H和TAT1，可能導(dǎo)致藏丹參毛狀根產(chǎn)生更強(qiáng)烈的隱丹參酮、丹參酮IIA、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B代謝響應(yīng)(圖2，圖4)。

圖2 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下兩種丹參毛狀根的次生代謝物含量注：DW：干重；Sm：紫花丹參，Sc：藏丹參；CK：對(duì)照組，MJ：茉莉酸甲酯處理組；“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。

圖3 紫花丹參毛狀根中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式注：CK：對(duì)照組，MJ：茉莉酸甲酯處理組；“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。

圖4 藏丹參毛狀根中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式注：CK：對(duì)照組，MJ：茉莉酸甲酯處理組；“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。

3 討 論

許多生物誘導(dǎo)子可以促進(jìn)紫花丹參毛狀根的生長(zhǎng)和丹參酮積累，如內(nèi)生真菌深綠木霉(TrichodermaatrovirideD16)[10]和密旋鏈霉菌(StreptomycespactumAct12)[11]。而生物量結(jié)果表明茉莉酸甲酯在第1 d促進(jìn)紫花丹參毛狀根的生長(zhǎng)，但對(duì)藏丹參毛狀根的生長(zhǎng)沒有影響(圖1)。誘導(dǎo)子廣泛用于刺激藥用植物中次生代謝物的產(chǎn)生，并用于鑒定參與特定代謝的候選基因的功能[2,7-8,10]。茉莉酸和茉莉酸甲酯是抵抗各種脅迫的調(diào)控因子，在植物中參與生長(zhǎng)發(fā)育和防御反應(yīng)等，并且可以在不同植物中提高各種次生代謝物的積累[12-13]。兩種丹參毛狀根的代謝指標(biāo)表明，茉莉酸甲酯顯著促進(jìn)藏丹參毛狀根中二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的積累，而僅僅影響紫花丹參毛狀根中二氫丹參酮I、隱丹參酮、咖啡酸和丹酚酸B的產(chǎn)生，暗示茉莉酸甲酯在兩種丹參次生代謝的調(diào)控中起著不同的作用。除丹酚酸B以外，茉莉酸甲酯不能進(jìn)一步刺激紫花丹參毛狀根中其他幾種丹參酮和丹酚酸的積累。之前的研究表明200 μmol/L茉莉酸甲酯促進(jìn)藏丹參毛狀根中隱丹參酮和丹參酮IIA積累[2]，而本文的結(jié)果與此一致(圖2)。茉莉酸甲酯上調(diào)紫花丹參毛狀根中大多數(shù)基因的表達(dá)，但與二萜化合物生物合成基因相比，迷迭香酸生物合成基因?qū)岳蛩峒柞ジ舾?。茉莉酸甲酯?duì)紫花丹參毛狀根中迷迭香酸積累沒有影響，而提高丹酚酸B積累。這可能是由于紫花丹參毛狀根中HPPD表達(dá)的上調(diào)阻礙了酪氨酸支路中迷迭香酸合成的代謝流。HPPD催化4-羥基苯丙酮酸生成尿黑酸，和HPPR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一底物[14]。因此，HPPD的轉(zhuǎn)錄水平影響迷迭香酸生物合成的代謝流(圖2-圖3)。KSL2參與一種淚柏醚(ent-13-epi-manoyl oxide)生物合成和赤霉素(gibberellin)代謝[15]，而茉莉酸甲酯上調(diào)兩種丹參毛狀根中KSL2的表達(dá)，表明茉莉酸甲酯可能調(diào)控淚柏醚和赤霉素合成。因而，茉莉酸甲酯在兩種丹參中可能調(diào)控多種二萜化合物和酚酸類化合物的生物合成(圖2-圖4)。

研究表明，茉莉酸甲酯可以誘導(dǎo)紫花丹參中多個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)，這些基因包括丹參酮生物合成基因(AACT1、HMGR、DXS2、GGPPS1、CPS1)[16]和丹酚酸生物合成基因(PAL1、C4H、4CL1、TAT1、HPPR)[17]，而本文的結(jié)果與此一致。藏丹參毛狀根中參與丹參酮和丹酚酸合成的基因比紫花丹參毛狀根中相應(yīng)基因更強(qiáng)烈地響應(yīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，包括AACT1、HMGR1、DXS2、GGPPS1、CPS1、CYP76AH3、PAL1、C4H和TAT1(圖3-圖4)。茉莉酸甲酯可能通過誘導(dǎo)甲基赤蘚醇-4-磷酸和甲羥戊酸兩條途徑以及丹參酮下游途徑中關(guān)鍵基因(AACT1、HMGR1、DXS2、GGPPS1、CPS1、CYP76AH3)的差異上調(diào)，從而導(dǎo)致藏丹參產(chǎn)生更敏感的隱丹參酮和丹參酮IIA代謝響應(yīng)(圖2-圖4)。此外，茉莉酸甲酯差異上調(diào)苯丙氨酸途徑中PAL1和C4H的表達(dá)，可能導(dǎo)致藏丹參產(chǎn)生更強(qiáng)烈的咖啡酸代謝響應(yīng)。與紫花丹參相比，藏丹參中更強(qiáng)烈的迷迭香酸和丹酚酸B代謝響應(yīng)可能是由于苯丙氨酸途徑和酪氨酸途徑中關(guān)鍵基因(PAL1、C4H、TAT1)的差異上調(diào)(圖2-圖4)。以上結(jié)果表明，茉莉酸甲酯在兩種丹參次生代謝的調(diào)控中扮演著不同角色，導(dǎo)致兩者不同的基因表達(dá)模式和代謝響應(yīng)。

4 結(jié) 論

本文通過高效液相和熒光定量PCR對(duì)比分析了茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下藏丹參與紫花丹參毛狀根的次生代謝。結(jié)果表明：與紫花丹參毛狀根相比，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)藏丹參毛狀根產(chǎn)生更強(qiáng)烈的隱丹參酮、丹參酮IIA、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B代謝響應(yīng)；在兩種丹參中，次生代謝相關(guān)基因差異響應(yīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，可能導(dǎo)致兩者產(chǎn)生不同的丹參酮和丹酚酸代謝響應(yīng)。

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(責(zé)任編輯： 唐志榮)

Diverse Responses to Methyl Jasmonate in Hairy Roots of TwoSalviaSpecies

FANG Yumin, YANG Dongfeng, LIANG Zongsuo

(a.College of Life Science; b.Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation of Zhejiang Province, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

To elucidate diverse responses ofSalviamiltiorrhizaBunge (S.miltiorrhiza) andSalviacastaneaDiels f.tomentosaStib (S.castanea) to signal molecule, methyl jasmonate (MJ) was applied to induce the metabolism of hairy roots thereof, and comparison was made on growth, secondary metabolite accumulation and change, and gene expression pattern therebetween. The results suggest that MJ significantly promotes the accumulation of dihydrotanshinone I (DT-I), cryptotanshinone (CT), tanshinone IIA (T-IIA), caffeic acid (CA), rosmarinic acid (RA), and salvianolic acid B (SAB) inS.castaneahairy roots, while only has impact on the accumulation of DT-I, CT, CA, and SAB inS.miltiorrhizahairy roots; the key genes involved in the biosynthesis of tanshinone and phenolic acid inS.castaneahairy roots respond to the induction of MJ more actively than those inS.miltiorrhizahairy roots do, which could lead to more active responses of CT, T-IIA, CA, RA, and SAB inS.castaneahairy roots.

SalviamiltiorrhizaBunge;SalviacastaneaDiels f.tomentosaStib; hairy roots; methyl jasmonate; secondary metabolism; gene expression

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.09.018

2017-02-16 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2017-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81673536,81373908,81403033)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LZ16H280001,LQ15H280009)

方譽(yù)民(1993-)，男，安徽六安人，碩士研究生，主要從事丹參次生代謝方面的研究。

梁宗鎖，E-mail：liangzs@ms.iswc.ac.cn

Q945.78

A

1673- 3851 (2017) 05- 0712- 08