皂莢實(shí)生苗與嫁接苗皂刺單株質(zhì)量及藥用成分含量比較

李建軍，尚星晨，任美玲，連笑雅，張光田，陳 冰

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.四川秦巴中藥科技有限公司，四川 巴中 636600； 3.博愛縣武兵皂刺皂角專業(yè)合作社，河南 博愛 454450)

皂莢實(shí)生苗與嫁接苗皂刺單株質(zhì)量及藥用成分含量比較

李建軍1，尚星晨1，任美玲1，連笑雅1，張光田2，陳 冰3

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.四川秦巴中藥科技有限公司，四川 巴中 636600； 3.博愛縣武兵皂刺皂角專業(yè)合作社，河南 博愛 454450)

為了比較皂莢實(shí)生苗、皂莢砧木嫁接苗、野皂莢砧木嫁接苗皂刺單株質(zhì)量及藥用成分的差異，采用天平測(cè)量3種苗木皂刺單株質(zhì)量，并分別利用HPLC法和比色法測(cè)定其藥用成分槲皮素和多酚含量。結(jié)果表明，3種苗木皂刺單株質(zhì)量分別為516、872、335 g，皂莢砧木嫁接苗最高，皂莢實(shí)生苗次之，野皂莢砧木嫁接苗最低，相互之間均呈極顯著差異；3種皂刺槲皮素含量分別為0.002%、0.001%、0.005%，野皂莢砧木嫁接苗最高，實(shí)生苗次之，皂莢砧木嫁接苗最低，相互之間均呈極顯著差異；多酚含量分別為0.844%、0.595%、0.859%，野皂莢砧木嫁接苗最高，實(shí)生苗次之，二者不存在顯著差異，但二者與皂莢砧木嫁接苗相比均呈極顯著差異。野皂莢砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量均最高但產(chǎn)量最低；皂莢砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量均最低但產(chǎn)量最高；皂莢實(shí)生苗槲皮素和多酚含量居中，產(chǎn)量亦居中。

皂刺； 實(shí)生苗； 嫁接苗； 單株質(zhì)量； 藥用成分

皂莢(GleditsiasinensisLam.)，又名皂角，系豆科蘇木亞科皂莢屬[1]，是我國(guó)分布最廣泛的特有樹種[2]。皂刺為皂莢的干燥棘刺，又稱天丁、皂針等。據(jù)藥典記載，皂刺有消腫脫毒、破堅(jiān)削積、排膿、殺蟲之功效， 用于癰疽初起或膿成不潰，外治疥癬麻風(fēng)[3]。皂刺作為傳統(tǒng)中草藥，在臨床上應(yīng)用十分廣泛，常用于治療闌尾炎、結(jié)腸炎、陰道炎等疾病[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，皂刺內(nèi)含有黃酮、酚類、皂苷以及三萜等化合物成分[5]，可作為治療多種腫瘤的常用配藥，例如乳腺癌[6]、宮頸癌[7]、前列腺癌[8]、肺癌[9]、肝癌等[10]，被廣譽(yù)為十大抗癌中草藥之一[11]。

近年來(lái)，皂莢資源日趨減少，種質(zhì)資源丟失嚴(yán)重，皂莢天然林片段化極為嚴(yán)重，大部分地區(qū)僅剩下少數(shù)散生個(gè)體[12]。皂莢莢果、種子、皂刺均可入藥，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，隨著人們對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷提高，現(xiàn)已有大規(guī)模的人工種植。皂莢生長(zhǎng)速度慢，需6～8 a才能開花結(jié)果[1]，直接限制了皂莢育種工作的推進(jìn)。嫁接作為植物無(wú)性繁殖的重要方法，不僅可以保持親本優(yōu)良品種的優(yōu)良基因，提高皂莢小苗對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，還可以縮短開花結(jié)果的年限，甚至可以改良品種達(dá)到豐產(chǎn)的效果[13]。目前，國(guó)內(nèi)外用HPLC法測(cè)定皂刺藥用成分已有文獻(xiàn)報(bào)道，但嫁接對(duì)皂刺單株質(zhì)量及藥用成分的影響研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以皂莢實(shí)生苗以及皂莢和野皂莢為砧木的2種嫁接苗為樣品，比較3種苗木皂刺的單株質(zhì)量，并分別采用HPLC法和比色法測(cè)定3種皂刺的槲皮素和多酚含量，旨在探討嫁接對(duì)皂刺產(chǎn)量及藥用成分含量的影響，為皂莢資源評(píng)價(jià)和新品種選育提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

儀器：FA2204B電子分析天平、Agilent高效液相色譜儀、KH-250D型超聲波清洗器、DHY-300超微粉碎機(jī)、索式提取器、ZRD-A5110電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

試劑：超純水，乙腈、甲醇(色譜純，天津市科密歐試劑有限公司)，磷酸(分析純，天津市北辰方正試劑廠)，碳酸鈉(天津市北辰方正試劑廠)，槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

Folin-Ciocalteu 試劑(簡(jiǎn)稱 FC 試劑)：于 1 000 mL磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉 50 g、鉬酸鈉 12.5 g、蒸餾水 350 mL、濃磷酸(14 mol/L)25 mL、濃鹽酸(12 mol/L)50 mL，充分混勻，微沸回流 10 h，稱取Li2SO4·H2O 87.29 g，少量多次加入到圓底燒瓶?jī)?nèi)，滴加溴水?dāng)?shù)滴，開口沸騰，使溴水完全揮發(fā)為止，冷卻，定容至500 mL，過(guò)濾，置于棕色瓶中保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用1倍蒸餾水稀釋[3]。

1.2 供試材料

供試材料皂刺采自河南省博愛縣。實(shí)生苗樹齡4 a；嫁接苗樹齡：砧木2 a，嫁接4 a。皂莢砧木嫁接苗、野皂莢砧木嫁接苗接穗均為實(shí)生苗接穗。采集時(shí)間為2016年10月26日，把相同編號(hào)的樣品均勻混在一起，烘干，粉碎，過(guò)孔徑0.3 mm的篩。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 皂刺單株質(zhì)量的測(cè)定 每一類苗木隨機(jī)選取30株皂莢樹，用電子天平測(cè)定其皂刺單株質(zhì)量。

1.3.2 槲皮素含量的測(cè)定(HPLC法)

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ODS C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比為30∶70)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL[14]。

1.3.2.2 槲皮素對(duì)照品溶液的制備 精密稱取10 mg槲皮素對(duì)照品，加甲醇定容至25 mL容量瓶，得到0.4 g/L的對(duì)照品母液，再分別配制0.003 2、0.006 4、0.009 6、0.012 8、0.001 6、0.019 2 g/L的對(duì)照品溶液。

1.3.2.3 槲皮素對(duì)照品線性關(guān)系的考察 取各個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，按照1.3.2.1色譜條件進(jìn)行分析，以槲皮素的質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.4 皂刺槲皮素樣品溶液的制備 精密稱取5 g皂刺粉末，置于索式提取器中，加入40 mL甲醇，浸泡過(guò)夜，再加入100 mL甲醇，加熱至沸，提取4 h，放冷，過(guò)濾，蒸干濾液，加甲醇定容于25 mL容量瓶中，經(jīng) 0.45 μm有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)后測(cè)定。

1.3.3 多酚含量的測(cè)定(比色法)

1.3.3.1 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品18 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.18 g/L的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取5 g皂刺粉，置250 mL棕色容量瓶中，加水150 mL，放置過(guò)夜，超聲處理15 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置(使固體物沉淀)，濾過(guò)，棄去初濾液50 mL。精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得[3]。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，將其放入25 mL的棕色容量瓶中,各加入FC試劑1 mL，再分別加入11.9、11.8、11.6、11.4、11.2、11.0 mL水，用29%碳酸鈉溶液稀釋到刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，測(cè)定A760值，以沒(méi)食子酸的質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)(x)、A760值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.4 樣品含量的測(cè)定 吸取供試品溶液2.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入FC 試劑1 mL，再加入10 mL水，用29%碳酸鈉溶液稀釋到刻度，搖勻，在上述相同的顯色條件下測(cè)定其A760值，計(jì)算其質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素、沒(méi)食子酸2種對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，其回歸方程為y=31 003x-4.370，R2=0.998，表明槲皮素質(zhì)量濃度在0.003 2～0.019 2 g/L時(shí)與峰面積呈良好線性關(guān)系。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，其回歸方程為y=103.9x+0.046，R2=0.998，表明沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度在0.000 72～0.007 20 g/L時(shí)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2 3種不同類型皂莢苗木皂刺單株質(zhì)量比較

3種皂莢皂刺單株質(zhì)量的差異見圖3。由圖3可知，皂莢砧木嫁接苗皂刺單株質(zhì)量最高，為872 g，實(shí)生苗次之，為516 g，野皂莢砧木嫁接苗皂刺單株質(zhì)量最低，為335 g，3種皂莢苗木皂刺單株質(zhì)量間均差異極顯著。野皂莢砧木嫁接苗生長(zhǎng)在太行山上，環(huán)境惡劣，水肥不足，生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)量較低；實(shí)生苗和皂莢砧木嫁接苗生長(zhǎng)在農(nóng)戶家，由農(nóng)戶悉心照顧，水肥充足，生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)量相對(duì)較高。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平差異顯著，下同

2.3 3種不同類型皂莢苗木皂刺2種藥用成分含量比較

由表1可知，野皂莢砧木嫁接苗槲皮素含量最高，實(shí)生苗次之，皂莢砧木嫁接苗含量最低，3種皂莢嫁接苗皂刺中槲皮素含量均呈現(xiàn)極顯著差異；多酚含量以野皂莢砧木嫁接苗最高，實(shí)生苗次之，皂莢砧木嫁接苗最低，實(shí)生苗與野皂莢砧木嫁接苗差異不顯著，但二者與皂莢砧木嫁接苗之間差異極顯著。野皂莢砧木嫁接苗生長(zhǎng)在太行山上，環(huán)境惡劣，水肥不足，生長(zhǎng)緩慢，藥用成分積累較多；實(shí)生苗和皂莢砧木嫁接苗生長(zhǎng)在農(nóng)戶家，由農(nóng)戶悉心照顧，水肥充足，生長(zhǎng)速度較快，藥用成分積累較少。

表1 皂莢實(shí)生苗與嫁接苗皂刺藥用成分含量比較

3 結(jié)論與討論

參閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[15-17]，我國(guó)對(duì)皂莢的研究主要集中在其藥用部位的生藥學(xué)鑒定、藥理學(xué)及臨床應(yīng)用，關(guān)于其有效成分的分離、含量測(cè)定方法及指紋圖譜建立的研究相對(duì)較少，也有部分關(guān)于皂莢嫁接技術(shù)研究的文獻(xiàn)報(bào)道，但針對(duì)嫁接對(duì)皂刺產(chǎn)量及藥用成分的影響方面的研究尚未見報(bào)道。

通過(guò)對(duì)3種皂莢苗木皂刺單株質(zhì)量的比較分析發(fā)現(xiàn)，皂莢砧木嫁接苗皂刺單株質(zhì)量最高，實(shí)生苗次之，野皂莢砧木嫁接苗最低，3種皂莢苗木皂刺單株質(zhì)量彼此間均呈現(xiàn)極顯著差異。皂刺的產(chǎn)量可以作為皂莢資源評(píng)價(jià)的依據(jù)之一。

劉艷明等[15]采用HPLC法對(duì)皂刺的各類成分進(jìn)行研究，得出皂刺含有黃酮、多酚、三萜皂苷、香豆素、甾醇、內(nèi)脂、三萜等成分。黃酮類中的槲皮素和黃顏木素是皂刺抗腫瘤的重要活性成分[16]，我國(guó)藥典未規(guī)定其含量的測(cè)定方法。多酚具有清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)氧化、延緩機(jī)體衰老、防癌、抗輻射等功效，我國(guó)藥典以沒(méi)食子酸為對(duì)照品采用比色法測(cè)定其含量。本課題組選取皂刺中槲皮素和多酚2種有效成分，分別采用HPLC法和比色法對(duì)3種苗木進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，野皂莢砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量最高，實(shí)生苗次之，皂莢砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量均最低。三者槲皮素含量均呈極顯著差異；實(shí)生苗與野皂莢砧木嫁接苗多酚含量差異不顯著，二者與皂莢砧木嫁接苗差異極顯著。

野皂莢砧木嫁接苗生長(zhǎng)在太行山上，環(huán)境惡劣，水肥不足，導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢，藥用成分積累較多，但產(chǎn)量較低；實(shí)生苗和皂莢砧木嫁接苗生長(zhǎng)在農(nóng)戶家，由農(nóng)戶悉心照顧，水肥充足，生長(zhǎng)速度較快，藥用成分積累較少，但產(chǎn)量相對(duì)較高；嫁接不僅很好地保持了親本的特性，提高了皂莢小苗對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，也縮短了皂莢開花結(jié)果的年限，但相同環(huán)境條件下皂莢砧木嫁接苗次生代謝產(chǎn)物槲皮素和多酚低于實(shí)生苗，深層次的生理機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，野皂莢砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量較高，為野生皂莢殘次林通過(guò)嫁接改造成藥用經(jīng)濟(jì)林提供了理論支撐，實(shí)生苗藥用成分槲皮素和多酚含量高于同環(huán)境條件下嫁接苗，為嫁接繁育和生產(chǎn)及資源評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)。

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Comparative Research on Individual Plant Quality and Medicinal Ingredients Content of the Spines ofGleditsiasinensisLam.Stock Seedlings and Grafted Seedlings

LI Jianjun1,SHANG Xingchen1,REN Meiling1,LIAN Xiaoya1,ZHANG Guangtian2,CHEN Bing3

(1.College of Life Science,Henan Normal University/Henan Engineering Laboratory of Green Medicine Biotechnology,Xinxiang 453007,China; 2.Sichuan Qinba Traditional Chinese Medicine Technology Co.,Ltd.,Bazhong 636600,China; 3.Boai County Wubing Gleditsia Sinensis Cooperatives,Boai 454450，China)

In order to compare the individual plant quality and medicinal ingredients content of the spines,the spine mass ofGleditsiasinensisLam.stock seedlings,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.andGleditsiamicrophyllawere measured by balance,and polyphenols and quercetin contents were calibrated through HPLC and colorimetric method.The results showed that the individual plant qualities of the three kinds ofGleditsiasinensisLam.spines were 516 g,872 g and 335 g,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.were the highest among them,the second were stock seedlings,grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere the lowest,and they had significant difference respectively.The quercetin contents of the three kinds ofGleditsiasinensisLam.spines were 0.002%,0.001%,0.005%,grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere the highest,the second were stock seedlings,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.were the lowest,and they had significant difference respectively.The total polyphenol contents were 0.844%,0.595%,0.859%,grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere the highest,the second were stock seedlings,there was no significant difference between them,but the two had extremely significant difference compared with grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.In conclusion,quercetin and total polyphenol contents of grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere highest but the production was lowest,the second were stock seedlings and so was its production,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.were lowest but had the highest production.

the spines ofGleditsiasinensisLam.; stock seedlings; grafted seedlings; individual plant quality; medicinal ingredients

2017-02-22

中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項(xiàng) (財(cái)社 [2011]76 號(hào))；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201207002);河南省教育廳重點(diǎn)研究應(yīng)用項(xiàng)目 (15A180043)；橫向項(xiàng)目：聯(lián)合開發(fā)藥用資源皂莢

李建軍(1964-)，男，河南延津人，副教授，碩士，主要從事藥用植物育種與資源開發(fā)方面的研究。 E-mail:043081@htu.cn

S792.99

A

1004-3268(2017)08-0107-04