CCNB2過(guò)表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌不良預(yù)后的預(yù)測(cè)效果研究*

王杰，陳大興，郭寧，陶立軒

（湖北省武漢市普仁醫(yī)院 心胸外科，湖北 武漢 430081）

CCNB2過(guò)表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌不良預(yù)后的預(yù)測(cè)效果研究*

王杰，陳大興，郭寧，陶立軒

（湖北省武漢市普仁醫(yī)院 心胸外科，湖北 武漢 430081）

目的探討細(xì)胞周期蛋白B2（CCNB2）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響。方法

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)法測(cè)定CCNB2 mRNA和蛋白在NSCLC腫瘤組織及臨近非腫瘤組織中的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果腫瘤組織中CCNB2 mRNA和蛋白表達(dá)量高于非腫瘤組織（P＜0.05），且其表達(dá)水平與腫瘤分化等級(jí)、直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)（P＜0.05），同時(shí)CCNB2高表達(dá)是患者生存率預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。結(jié)論腫瘤組織中CCNB2高表達(dá)與NSCLC不良預(yù)后密切相關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞周期蛋白B2；生物標(biāo)志物；預(yù)后

肺癌是病死率極高的一種惡性腫瘤[1-2]，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的80%～85%，發(fā)病率高[3]。臨床上大多數(shù)NSCLC患者確診時(shí)已為晚期，5年生存率僅為16%[4-5]，因此成為臨床面臨的一個(gè)難題，也為相關(guān)預(yù)后研究提出挑戰(zhàn)。細(xì)胞周期蛋白B2（cyclin B2，CCNB2）在不同部位和細(xì)胞周期中發(fā)揮作用[6-8]。近年來(lái)有研究提示，其在多種人類腫瘤組織和外周血中表達(dá)增高[9-13]，且與腫瘤臨床分期和轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)[14]。本研究就CCNB2在NSCLC組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月-2011年12月湖北省武漢市普仁醫(yī)院腫瘤科收治的NSCLC患者186例，均為臨床原發(fā)灶，入組前未接受任何治療。收集同期體檢健康對(duì)照組31例。將收集的NSCLC樣本和鄰近非腫瘤組織樣本共217例石蠟包埋，液氮保存。診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)制定的第7版腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[15]；術(shù)后隨訪5～60個(gè)月。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 核糖核酸提取與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

提取組織樣本總RNA，使用Trizol（大連寶生生物工程公司有限公司），通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生生物工程公司有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)/孔，以β-actin基因作為內(nèi)參，取5μl血清與5 μl準(zhǔn)備液（2.5%Tween 20、50 mmol/L 三羥甲氨基甲烷和1mmol乙二胺四乙酸二鈉混合，加入10μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含2 μl 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.8 μl 25×脫氧核糖核苷三磷酸混合液（100 nmol/L）、2μl 10×隨機(jī)引物、1 μl Multi ScribeTMReverse Transcriptase 試劑、1 μl RNA 抑制劑和3.2μl焦碳酸二乙酯水。反應(yīng)條件：25℃預(yù)變性，10 min，37℃變性 120 min，85℃退火 5 min。反應(yīng)液140 000 r/min離心5 min，取上清液，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物序列見表 1。CCNB2基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 免疫組織化學(xué)染色

組織樣本石蠟包埋后切片，分別用二甲苯和無(wú)水乙醇脫石蠟和水，在檸檬酸鈉溶液煮沸10 min介導(dǎo)抗原復(fù)性。3%過(guò)氧化氫和1%牛血清白蛋白封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性和非特異性位點(diǎn)，采用1∶200稀釋的CCNB2一抗（英國(guó)Abcam公司）孵育，4℃過(guò)夜。磷酸鹽緩沖溶液洗滌后加入生物素標(biāo)記的二抗及親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）復(fù)合物，每步均室溫孵育 20 min，加入發(fā)光液后顯色。染色結(jié)果由2位病理學(xué)家參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)觀察判斷[9]，總分0～7分，0～5分判為低表達(dá)，6和7分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法制作生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，影響因素的分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織樣本中CCNB2的表達(dá)

20對(duì)NSCLC及鄰近非腫瘤組織CCNB2 mRNA表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45.961，P=0.001），NSCLC 樣本中 CCNB2 mRNA 表達(dá)量為鄰近非腫瘤組織的3.02倍（見圖1）。186例石蠟包埋NSCLC樣本中62.4%（116/186）為CCNB2高表達(dá)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.089，P=0.001），CCNB2高表達(dá)率在NSCLC樣本中高于正常組（見圖 2）。

2.2 不同特征CCNB2高表達(dá)率的比較

不同特征CCNB2高表達(dá)率的比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.541，P=0.000），CCNB2高表達(dá)與腫瘤分化等級(jí)增加有關(guān)，CCNB2高表達(dá)率越低，腫瘤分化等級(jí)越高。CCNB2高表達(dá)與腫瘤大小的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)（P＜0.05），提示腫瘤越大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越嚴(yán)重,以及出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床癥狀越嚴(yán)重，則腫瘤分化等級(jí)越高。CCNB2高表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙史及病理學(xué)分化類型無(wú)關(guān)。見表2。

圖1 20對(duì)NSCLC和鄰近非腫瘤組織CCNB2 mRNA表達(dá)的比較

2.3 CCNB2高表達(dá)與NSCLC患者疾病預(yù)后關(guān)系

CCNB2低表達(dá)NSCLC患者疾病預(yù)后較好，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=33.251，P=0.000），CCNB2表達(dá)與NSCLC患者疾病總生存率相關(guān)（見圖3）。CCNB2是NSCLC患者疾病預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；但其與患者腫瘤臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。Cox回歸分析提示，CCNB2蛋白高表達(dá)是NSCLC患者疾病預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（HR=2.272，P=0.001）。見表3和圖3。

圖2 NSCLC組織CCNB2蛋白表達(dá) （免疫組織化學(xué)法）

表2 不同特征CCNB2高表達(dá)率的比較

表3 NSCLC患者總生存率的單一和多重變量分析

圖3 CCNB2不同表達(dá)患者生存率曲線

3 討論

細(xì)胞周期蛋白B2是B類細(xì)胞周期蛋白家族的成員，在分裂間期CCNB1會(huì)持續(xù)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間穿梭，在分裂間期末CCNB1快速進(jìn)入細(xì)胞核并與有絲分裂體結(jié)合[16-17]。與之相反，在分裂間期和有絲分裂期CCNB2會(huì)穿出細(xì)胞核，逐漸靠近高爾基體[18]。盡管兩者在細(xì)胞內(nèi)定位不同，但是CCNB1和CCNB2共同完成促發(fā)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期中的重要功能[19]。此外，CCNB1和CCNB2在氨基末端結(jié)構(gòu)上有一定差異，其同源性為57%[20]。目前已經(jīng)比較明確CCNB1在NSCLC中的作用，但關(guān)于CCNB2還在摸索中，YOSHIDA等[21]研究表明，CCNB2與腫瘤細(xì)胞分化、血管侵入、Ki-67增長(zhǎng)指數(shù)及增殖細(xì)胞核抗原標(biāo)記指數(shù)密切相關(guān)。研究提示，CCNB1過(guò)表達(dá)是NSCLC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[22-23]。然而CCNB2在NSCLC中的表達(dá)情況及作用研究尚不多。

基因芯片研究提示，胃癌患者的胃黏膜組織中CCNB2存在過(guò)表達(dá)狀態(tài)[13]。此外，CCNB2是HPV16陽(yáng)性宮頸癌患者表達(dá)上調(diào)的6種基因之一[24]。本研究結(jié)果提示，與非腫瘤肺臟組織相比，NSCLC樣本中CCNB2 mRNA和蛋白高表達(dá)。進(jìn)一步研究CCNB2在NSCLC組織中表達(dá)的臨床意義，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB2表達(dá)與NSCLC患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)，CCNB2過(guò)表達(dá)可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和加速腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致NSCLC腫瘤發(fā)展。與TAKASHIMA等[25]報(bào)道的結(jié)果近似。

國(guó)內(nèi)外不少研究均提示，在多種人類腫瘤組織中檢測(cè)到CCNB2過(guò)表達(dá)，且與疾病預(yù)后不良密切相關(guān)。SHUBBAR等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CCNB2過(guò)表達(dá)與乳腺癌患者DSS預(yù)后有關(guān)，是其獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。此外，TAKASHIMA等[25]也報(bào)道，肺腺癌患者腫瘤組織中CCNB2 mRNA過(guò)表達(dá)，且其表達(dá)與疾病總生存率密切相關(guān)。為進(jìn)一步探討CCNB2表達(dá)在NSCLC中的預(yù)后價(jià)值，本研究探討CCNB2表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)兩者呈負(fù)相關(guān)，多重變量分析提示，CCNB2過(guò)表達(dá)是NSCLC患者疾病預(yù)后不良的獨(dú)立標(biāo)志物。總之，NSCLC組織中CCNB2蛋白表達(dá)升高，且與腫瘤的臨床分期和預(yù)后不良密切相關(guān)。

[1]KANEMATSU T,HANIBUCHI M,TOMIMOTO H,et al.Epidemiological and clinical features of lung cancer patients from 1999 to 2009 in Tokushima Prefecture of Japan[J].Journal of Medical Investigation Jmi,2010,57(3/4):326-333.

[2]AKGüN K M,CROTHERS K,PISANI M.Epidemiology and management of common pulmonary diseases in older persons[J].Journals of Gerontology,2012,67(3):276-291.

[3]KAMANGAR F,DORES G M,ANDERSON W F.Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world[J].Journal of the American Society of Clinical Oncology,2006,24(14):2137-2150.

[4]SORIA J C,MASSARD C,LE C T.Should progression-free survival be the primary measure of efficacy for advanced NSCLC therapy[J].Annals of Oncology,2010,21(12):2324-2332.

[5]CHU Z,YANG Z,SHAO H,et al.Small peripheral lung adenocarcinoma:CT and histopathologic characteristics and prognostic implications[J].Cancer Imaging,2011,11(1):237-246.

[6]VERMEULEN K,van BOCKSTAELE D R,BERNEMAN Z N.The cell cycle:a review of regulation,deregulation and therapeutic targets in cancer[J].Cell Proliferation,2003,36(3):131-149.

[7]PETRI E T,ERRICO A,ESCOBEDO L,et al.The crystal structure of human cyclin B[J].Cell Cycle,2007,6(11):1342-1349.

[8]WU T,ZHANG X,HUANG X,et al.Regulation of cyclin B2 expression and cell cycle G2/M transition by menin[J].Journal of Biological Chemistry,2010,285(24):18291-18300.

[9]FERNANDEZ-RANVIER G G,WENG J,YEH R F,et al.Identification of biomarkers of adrenocortical carcinoma using genomewide gene expression profiling[J].ArchivesofSurgery,2008,143(9):841-846.

[10]SHUBBAR E,KOVáCS A,HAJIZADEH S,et al.Elevated cyclin B2 expression in invasive breast carcinoma is associated with unfavorable clinical outcome[J].BMC Cancer,2013,13(1):1-10.

[11]PARK S H,YU G R,KIM W H,et al.NF-Y-dependent cyclin B2 expression in colorectal adenocarcinoma[J].Clinical CancerResearch an Official Journal of the American Association for Cancer Research,2007,13(3):858-867.

[12]DE-MARTINO I,VISONE R,WIERINCKX A,et al.HMGA proteins up-regulate CCNB2 gene in mouse and human pituitary adenomas[J].Cancer Research,2009,69(5):1844-1850.

[13]WANG D G,CHEN G,WEN X Y,et al.Identification of biomarkers for diagnosis of gastric cancer by bioinformatics[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp,2015,16(4):1361-1365.

[14]MO M L,CHEN Z,LI J,et al.Use of serum circulating CCNB2 in cancersurveillance[J].InternationalJournalofBiological Markers,2010,25(4):236-242.

[15]方子文.電視胸腔鏡下解剖性肺段切除聯(lián)合系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃在ⅠB期老年高危非小細(xì)胞肺癌患者切除術(shù)后生存及預(yù)后因素的研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué),2016.

[16]HAGTING A,JACKMAN M,SIMPSON K,et al.Translocation of cyclin B1 to the nucleus at prophase requires a phosphorylation-dependent nuclear import signal[J].Current Biology,1999,9(13):680-689.

[17]CLUTE P,PINES J.Temporal and spatial control of cyclin B1 destruction in metaphase[J].Nature Cell Biology,1999,1(2):82-87.

[18]JACKMAN M,FIRTH M,PINES J.Human cyclins B1 and B2 are localized to strikingly different structures:B1 to microtubules,B2 primarily to the Golgi apparatus[J].Embo Journal,1995,14(8):1646-1654.

[19]LIU J H,WEI S,BURNETTE P K,et al.Functional association of TGF-beta receptorⅡwith cyclin B[J].Oncogene,1999,18(1):269-275.

[20]BRANDEIS M,HUNT T.The proteolysis of mitotic cyclins in mammalian cells persists from the end of mitosis until the onset of S phase[J].Embo Journal,1996,15(19):5280-5289.

[21]YOSHIDA T,TANAKA S,MOGI A,et al.The clinical significance of cyclin B1 and wee 1 expression in non-small-cell lung cancer[J].Annals of Oncology,2004,15(2):252-256.

[22]SORIA J C,JANG S J,KHURI F R,et al.Overexpression of cyclin B1 in early-stage non-small cell lung cancer and its clinical implication[J].Cancer Research,2000,60(15):4000-4004.

[23]COOPER W A,KOHONENCORISH M R,MCCAUGHAN B,et al.Expression and prognostic significance of cyclin B1 and cyclin A in non-small cell lung cancer[J].Histopathology,2009,55(1):28-36.

[24]ESPINOSA A M,ALFARO A,ROMAN-BASAURE E,et al.Mitosis is a source of potential markers for screening and survival and therapeutic targets in cervical cancer[J].PLoS One,2013,8(2):142.

[25]TAKASHIMA S,SAITO H,TAKAHASHI N,et al.Strong expression of cyclin B2 mRNA correlates with a poor prognosis in patients with non-small cell lung cancer[J].Tumor Biology,2014,35(5):4257-4265.

（童穎丹 編輯）

Cyclin B2 overexpression is a poor prognostic biomarker in NSCLC patients*

Jie Wang,Da-xing Chen,Ning Guo,Li-xuan Tao
(Department of Cardiothoracic Surgery,Wuhan Puren Hospital,Wuhan,Hubei 430081,China)

ObjectiveTo identify the role of cyclin B2 (CCNB2)in patients with NSCLC.MethodsCCNB2 mRNA and protein expressions were detected in NSCLC and paracancerous tissues.Immunohistochemistry was used to detect the expression of CCNB2 protein in 186 NSCLC patients.The relationships between the expression of CCNB2 and clinicopathological features were analyzed.ResultsIn this study,the expressions of CCNB2 mRNA and protein in the tumor tissues were higher than those in the nontumor tissues(P＜0.05).The expression levels of CCNB2 mRNA and protein were positively correlated with tumor differentiation grade,tumor diameter,lymph node metastasis,distant metastasis and clinical stage (P＜0.05),while CCNB2 overexpression was a risk factor for low survival rate and poor prognosis of the patients.ConclusionsThe overexpression of CCNB2 in NSCLC is closely related to disease progression and poor prognosis,and CCNB2 could be severed as a marker of prognosis in patients with NSCLC.

CCNB2;NSCLC;biomarker;prognosis

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.009

1005-8982（2017）17-0045-05

2016-05-06

湖北省武漢市科技基金（No：WX12D26）