雷公藤甲素對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞損傷的保護作用及其機制研究

劉幫慧，張瑛

（湖北省荊州市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖北 荊州 434020）

雷公藤甲素對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞損傷的保護作用及其機制研究

劉幫慧，張瑛

（湖北省荊州市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖北 荊州 434020）

目的探討雷公藤甲素對β-淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）誘導(dǎo)PC12細胞損傷的保護作用及其機制。方法通過噻唑藍（MTT）法確立Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型的工作濃度；同時利用MTT法檢測1×10-11、1×10-10和1×10-9mol/L雷公藤甲素對細胞活性的影響，以及雷公藤甲素和Aβ25-35同時處理細胞后對細胞活性的影響。PC12細胞隨機分為3組：對照組、Aβ25-35處理組、Aβ25-35和雷公藤甲素處理組。細胞處理24h后，利用免疫熒光法檢測細胞中活化Caspase-3的表達，同時采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達水平。結(jié)果Aβ25-35在10 μmol/L工作濃度下可誘導(dǎo)PC12細胞復(fù)制阿爾茨海默病體外細胞損傷模型，其細胞存活率為（58±6）%；單純雷公藤甲素在1×10-11、1×10-10和1×10-9mol/L濃度下處理細胞對細胞活性無顯著影響。Aβ25-35處理細胞后，細胞活性降低，活化Caspase-3在細胞中表達升高，同時Bax mRNA表達升高，而Bcl-2 mRNA的表達下降。然而，雷公藤甲素和Aβ25-35同時處理細胞時，前者能夠降低Aβ25-35對PC12細胞的毒性損傷，且細胞活性隨雷公藤甲素濃度的增加而升高；同時活化Caspase-3在細胞中的表達，Bcl-2和Bax mRNA表達水平也受抑制。結(jié)論雷公藤甲素可能通過調(diào)節(jié)Caspase-3、Bax及Bcl-2基因的表達以抑制細胞凋亡，從而對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞損傷發(fā)揮保護作用。

雷公藤甲素；阿爾茨海默?。沪?淀粉樣蛋白；細胞凋亡。

阿爾茨海默?。╝lzheimer’s disease，AD）是多發(fā)于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以漸進性記憶減退、認知障礙及人格改變?yōu)橹饕R床特征[1]。病理特征為全腦萎縮、腦細胞外出現(xiàn)大量淀粉樣蛋白沉積而形成的老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元顆?？张葑冃渭皢适2]。

雷公藤甲素是具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、抗類風(fēng)濕及神經(jīng)保護等功效[3-5]。本實驗用Aβ25-35復(fù)制PC12細胞損傷模型，研究雷公藤甲素對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 PC12細胞系（大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤細胞系）購自上海細胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 試劑及器材 Aβ25-35、雷公藤甲素、噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetra zolium bromide，MTT]、0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、4'，6- 二脒基 -2- 苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）均購自美國Sigma公司，無血清細胞冷凍保存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素等均購自美國Gibco公司，單克隆兔抗活化Caspase-3抗體購自英國Abcam公司，山羊抗兔熒光二抗購自美國Life Technologies公司，核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 試劑盒均購自大連寶生生物技術(shù)有限公司，Bcl-2、Bax及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因引物均由北京奧科鼎盛生物公司合成，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng) PC12細胞用含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液1次/2 d，待細胞密度達80%時，用0.05%胰蛋白酶消化細胞，加含血清培養(yǎng)液終止反應(yīng)并傳代。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力 PC12細胞接種于96孔板，24 h后進行相應(yīng)處理，處理完成后，移去培養(yǎng)液，加入0.5 mg/ml MTT 37℃孵育4 h。棄去MTT后加入150 μl DMSO，避光條件下培養(yǎng)板劇烈搖晃10 min，并利用酶標(biāo)儀測試570 nm處溶液的吸光值，每組實驗重復(fù)≥3次并收集數(shù)據(jù)，取平均值為最終數(shù)值，設(shè)定對照組吸光值為100%，其余組別以該組吸光值與對照組吸光值的百分比來表示，所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad Prism數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，記錄統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.3 細胞免疫熒光檢測 PC12細胞接種于鋪有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h后，細胞隨機分為3組：對照組、Aβ25-35處理組、Aβ25-35和雷公藤甲素處理組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3遍，加入4%預(yù)冷多聚甲醛固定細胞15 min，PBS漂洗3遍，加入0.1%Tition X-100打孔10 min，PBS漂洗3遍，加入含1%牛血清白蛋白的細胞封閉液封閉1 h，加入含有活化Caspase-3單克隆抗體（1∶200稀釋）的封閉液4℃孵育過夜，PBS漂洗3遍，加入山羊抗兔熒光二抗（1∶100）室溫避光孵育1 h，PBS漂洗3遍，DAPI進行細胞核染色，PBS漂洗3遍，細胞封片并在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染色結(jié)果。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng) PC12細胞鋪于6孔板中，37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，將細胞隨機分成3組：對照組、Aβ25-35處理組、Aβ25-35及雷公藤甲素處理組。24h后，移去培養(yǎng)液，加入Trizol裂解液，4℃、12 000 r/min離心10 min。將上清移入1.5 ml離心管中，加入裂解液0.2倍的氯仿溶液，劇烈震蕩15s，靜置3min，4℃、12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清至1.5 ml離心管中，加入等體積70%乙醇，混勻，將其加入試劑盒套管中，12 000 r/min離心1 min。棄掉離心后溶液，加入蛋白液12 000 r/min離心1 min，漂洗2次。加入洗脫液洗脫RNA；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將得到cDNA進行RT-PCR反應(yīng)，分別以Bcl-2和Bax為引物，以大鼠GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為20 μl。見附表。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件和GraphpadPrism分析軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

附表 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 Aβ25-35對PC12細胞活性的影響

PC12 細胞在 1、5、10 和 20μmol/L Aβ25-35處理下的細胞活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.440，P=0.000）。PC12細胞在不同濃度Aβ25-35處理24 h后，其細胞活性隨Aβ25-35濃度升高而下降。其中，細胞在10μmol/L Aβ25-35處理24 h后細胞活性為（58±6）%，與對照組比較，經(jīng)Dunnett-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.44，P=0.01），該條件被應(yīng)用于后續(xù)的實驗中。見圖1。

2.2 雷公藤甲素對PC12細胞活性的影響

PC12細胞分別在1×10-11、1×10-10和1×10-9mol/L雷公藤甲素處理24 h后，MTT檢測結(jié)果顯示，各組細胞活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.352，P=0.219），說明雷公藤甲素在3種濃度下對PC12細胞沒有毒性。見圖2A。

PC12 細胞在 1×10-11、1×10-10和 1×10-9mol/L雷公藤甲素和10 μmol/L Aβ25-35處理24 h后，利用MTT法檢測細胞活性，各組細胞活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.017，P=0.000）。Aβ25-35處理組的細胞活性[（59.0±5.6）%]下降。而當(dāng)細胞經(jīng)雷公藤甲素和Aβ25-35同時處理時，其活性較Aβ25-35處理組升高。雷公藤甲素濃度為1×10-10mol/L時，細胞活性達（84.7±6.8）%，與Aβ25-35處理組比較，經(jīng) Dunnett-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.245，P=0.000）。將該濃度應(yīng)用于后續(xù)實驗。見圖2。

2.3 雷公藤甲素對活化Caspase-3表達的影響

與對照組比較，Aβ25-35處理細胞24 h后，活化Caspase-3在胞漿中表達升高。而在Aβ25-35和雷公藤甲素同時處理后，與Aβ25-35處理比較，活化Caspase-3在胞漿中表達較Aβ25-35處理組下降。見圖3。

圖1 不同濃度Aβ25-35處理PC12細胞24 h后的細胞活力比較

圖2 雷公藤甲素對PC12細胞活性的影響

2.4 雷公藤甲素對Bcl-2和Bax mRNA表達的影響

處理細胞24h后，各組細胞Bcl-2和Bax mRNA相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.494，P=0.000）。Aβ25-35處理組 Bcl-2和 Bax mRNA水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.122 和 24，844，均P=0.000），Aβ25-35處理組的 Bcl-2表達降低，Bax表達升高。而在Aβ25-35和雷公藤甲素同時處理后，Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達水平與Aβ25-35處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.327和 29.842，均P=0.000）。Aβ25-35和雷公藤甲素組的Bcl-2 mRNA表達升高，Bax mRNA表達降低。見圖4。

圖3 雷公藤甲素對活化Caspase-3表達水平的影響（細胞免疫熒光，標(biāo)尺10μm）

圖4 雷公藤甲素對Bcl-2和Bax mRNA表達水平的影響

3 討論

AD又叫老年癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，其主要的病理特征是全腦萎縮，腦細胞外出現(xiàn)大量由淀粉樣蛋白沉積而形成的老年斑，tau蛋白過度磷酸化可造成細胞內(nèi)神經(jīng)元纏結(jié)、神經(jīng)元顆粒空泡變形及其大量喪失等病理變化。近年來，隨著我國人口迅速老齡化，AD困擾著越來越多的老年人，給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)。然而，AD的病因及發(fā)病機制尚不清楚。因此，深入研究AD的發(fā)病機制和尋找有效的防治措施是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)面臨的緊迫課題。其中，β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β，Aβ）在大腦組織中的異常沉積是導(dǎo)致AD發(fā)病的一個重要原因。因此，如何抑制Aβ引起的細胞凋亡也是目前的研究熱點[6-8]。本實驗利用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞復(fù)制AD體外細胞損傷模型，結(jié)果顯示，Aβ25-35的處理降低神經(jīng)元的活性并加快細胞凋亡。

雷公藤甲素，又叫雷公藤內(nèi)酯醇，是一種具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，來源于中藥雷公藤的根。研究表明，其具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護等功效[9-12]。因此，筆者推測雷公藤甲素能夠?qū)υ贏β25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷發(fā)揮保護作用。研究結(jié)果顯示，與Aβ25-35處理組比較，雷公藤甲素提高PC12細胞活性。同時，考慮到藥物安全在臨床應(yīng)用中的重要性，筆者也檢測不同濃度（1×10-11、1×10-10和 1×10-9mol/L）雷公藤甲素對PC12細胞活性的影響，結(jié)果顯示，這3種濃度的雷公藤甲素對細胞活性的影響不明顯，因此證明雷公藤甲素在該濃度下對PC12細胞的安全性。

AD與凋亡有關(guān)，神經(jīng)細胞的凋亡是AD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。在細胞凋亡過程中，Caspase-3發(fā)揮重要作用，通常以無活性的前體形式存在，一經(jīng)激活，將產(chǎn)生Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡[13]。大量研究結(jié)果證明，Caspase-3處于該級聯(lián)反應(yīng)的下游，通過降解細胞內(nèi)相應(yīng)底物使細胞死亡[15-18]。有研究表明，在腦卒中、帕金森病及AD中均可見Caspase-3的激活，說明Caspase-3在神經(jīng)退行性疾病中有重要的作用[19]。本實驗通過細胞免疫熒光檢測活化Caspase-3在細胞中的表達，結(jié)果顯示，與對照組比較，Aβ25-35能夠增加活化Caspase-3的表達，而雷公藤甲素抑制Aβ25-35所誘導(dǎo)的活化Caspase-3表達水平的升高。

Bcl-2基因在細胞凋亡過程中發(fā)揮十分重要的作用，在細胞受到外界刺激時能保護細胞免于凋亡，從而抑制細胞的凋亡。而與之相反，在腦缺血狀態(tài)下，Bax的表達可升高而促進細胞凋亡[6，19]。Bcl-2家族分為兩大類，一類是抗凋亡的，在細胞受到外界刺激時能保護細胞免于凋亡，從而抑制細胞的凋亡，Bcl-2就屬于這一類；另一類是促進細胞死亡，其中包括Bax基因[20-21]。RT-PCR結(jié)果顯示，Aβ25-35處理后PC12細胞Bax mRNA表達水平升高，而Bcl-2降低。雷公藤甲素抑制Aβ25-35所誘導(dǎo)的Bax和Bcl-2 mRNA表達。

綜上所述，本研究通過Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞制備AD體外細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細胞活性降低，活化Caspase-3表達水平升高，以及Bax和Bcl-2 mRNA表達升高。雷公藤甲素可能通過抑制細胞凋亡通路而對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷發(fā)揮保護作用，為針對細胞凋亡的阿爾茨海默病新藥研究提供線索。

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（童穎丹 編輯）

Triptolide inhibits cytotoxicity of PC12 cells induced by amyloid-β25-35via apoptosis pathway

Bang-hui Liu,Ying Zhang
(Department of Neurology,Jingzhou Central Hospital,Jingzhou,Hubei 434020,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of triptolide against amyloid β-peptide 25-35(Aβ25-35)induced injury of PC12 cells.MethodsMTT assay was conducted to determine the optimal working concentration of Aβ25-35for inducing PC12 cell injury model,and the potential protective effect of different concentrations of triptolide (1×10-11,1×10-10and 1×10-9mol/L)on the PC12 cells.PC12 cells were randomly divided into 3 groups:control group,Aβ25-35treatment group,and Aβ25-35and triptolide co-treatment group.After 24-h treatment,active caspase-3 expression was observed by cyto-immunofluorescence.Meanwhile,Bcl-2 and Bax mRNA expressions were measured by RT-PCR.ResultsThein vitroPC12 cell injury model of Alzheimer's disease could be established by Aβ25-35at a concentration of 10 μmol/L with a survival rate of(58 ± 6)%.Triptolide (1×10-11,1×10-10and 1×10-9mol/L)alone had no significant effect on cell viability.Following the Aβ25-35exposure,cell viability was significantly decreased.Furthermore,active caspase-3 protein and Bax mRNA expressions obviously increased after Aβ25-35treatment,while Bcl-2 mRNA expression decreased remarkably (P＜0.05).Triptolide,however,could significantly increase cell viability in a dosedependent manner when it was added together with Aβ25-35.Moreover,triptolide could also significantly suppress the expressions of active caspase-3 protein,Bcl-2 and Bax mRNA induced by Aβ25-35(P＜0.05).ConclusionsTriptolide may inhibit cell apoptosis through modulation of expressions of active caspase-3,Bax and Bcl-2 to protect PC12 cells from Aβ25-35-induced cytotoxicity.

triptolide;Alzheimer's disease;amyloid β-peptide;cell apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.006

1005-8982（2017）17-0029-06

2016-09-21