MicroRNA-224靶向CNNM1抑制前列腺癌血管生成的實(shí)驗(yàn)研究*

黃亞強(qiáng)，黃紅星，麥智鵬，黎衛(wèi)，鄭軼群，袁潤(rùn)強(qiáng)

（中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院 泌尿外科，廣東 中山 528403）

MicroRNA-224靶向CNNM1抑制前列腺癌血管生成的實(shí)驗(yàn)研究*

黃亞強(qiáng)，黃紅星，麥智鵬，黎衛(wèi)，鄭軼群，袁潤(rùn)強(qiáng)

（中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院 泌尿外科，廣東 中山 528403）

目的研究microRNA-224（miR-224）對(duì)前列腺癌生化復(fù)發(fā)及血管生成的影響。方法生物信息學(xué)分析及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白1（CNNM1）受miR-224負(fù)性調(diào)控。Taylor前列腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)分析、驗(yàn)證CNNM1、miR-224的表達(dá)關(guān)系及其與前列腺癌生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性。前列腺癌PC3細(xì)胞體外培養(yǎng)及動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)研究CNNM1、miR-224表達(dá)對(duì)前列腺癌微血管生成標(biāo)志物CD31的影響。結(jié)果CNNM1表達(dá)受miR-224靶向調(diào)節(jié)，前列腺癌組織中CNNM1與miR-224的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。miR-224與前列腺癌的生化復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），CNNM1與前列腺的生化復(fù)發(fā)呈正相關(guān)（P＜0.05）；在過(guò)表達(dá)miR-224的PC3細(xì)胞株內(nèi)，CNNM1和CD31的表達(dá)量下降；CNNM1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)CD31的生成。前列腺癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤組織免疫組織化學(xué)法染色提示，miR-224過(guò)表達(dá)能抑制前列腺癌組織內(nèi)微血管形成。結(jié)論miR-224通過(guò)靶向調(diào)控CNNM1表達(dá)，抑制前列腺癌微血管形成，控制前列腺癌生化復(fù)發(fā)。

前列腺癌；microRNA-224；細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白1；生化復(fù)發(fā)；血管生成

血管生成為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？寡苌莎煼槟[瘤治療，特別是晚期惡性腫瘤的治療提供一種有效的方法[1]。MicroRNA（miRNAs）的主要生物學(xué)功能是通過(guò)抑制翻譯起始和/或降解信使RNA的途徑，來(lái)調(diào)控編碼基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-224（miR-224）過(guò)表達(dá)能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，起抑癌基因作用[3]。本研究旨在探索miR-224調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白1（cyclin and CBS domain divalent metal cation transport mediator 1，CNNM1）抑制前列腺癌微血管形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

PC3細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司），改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（北京塞默飛世爾生物），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）（浙江天杭生物科技），過(guò)表達(dá)miRNA-224質(zhì)粒/過(guò)表達(dá)CNNM1質(zhì)粒（長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司，haslet-7e），裸鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），雙熒光報(bào)告分析系統(tǒng)（美國(guó)Promega公司），免疫組織化學(xué)法試劑盒PK-6100（美國(guó)Vector公司），Western blot試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），CNNM1、CD31抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)篩選及靶基因預(yù)測(cè)

Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)公用的數(shù)據(jù)平臺(tái)，其中包含139例原發(fā)性前列腺癌組織的miRNAs、mRNA表達(dá)譜及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)[4]。在SPSS 17中采用Pearson相關(guān)性分析篩選Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)中與miR-224呈負(fù)相關(guān)的基因（r＜-0.32，P＜0.05），再用 miRNAs靶基因預(yù)測(cè)軟件 Targetscan、PicTar、miRanda及 miRwalk 共同對(duì)miR-224下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，選4個(gè)預(yù)測(cè)軟件共有的交集靶基因進(jìn)一步研究。

1.3 過(guò)表達(dá)miR-224的PC3細(xì)胞構(gòu)建及細(xì)胞保存、培養(yǎng)

用has-let-7e包裝質(zhì)?；旌弦恨D(zhuǎn)染miR-224/miR-NC到293TN細(xì)胞株，3 d后根據(jù)包裝的說(shuō)明書用Lenti-Concentin病毒沉淀溶液（LV810A-1，美國(guó)SBI公司）提取收集病毒顆粒。然后用Trans Dux病毒轉(zhuǎn)染試劑（LV850A-1，美國(guó)SBI公司）轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞株。流式細(xì)胞儀分選miR-224過(guò)表達(dá)及空白對(duì)照細(xì)胞株并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和 Western blot檢測(cè)驗(yàn)證。用10%二甲基亞砜+90%FBS懸浮PC3細(xì)胞，冷凍保存于液氮中。使用時(shí)，取出冷凍的PC3細(xì)胞，置于37℃溫水中致其融化，1000r/min離心5min，棄上清液，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使其成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

含有miR-224結(jié)合靶位點(diǎn)的野生型和突變型序列的CNNM1 3’UTR分別克隆到psi-CHECK2熒光素酶報(bào)告載體，3’UTR序列載體分別與miR-224模擬物（miR-224）或?qū)φ招蛄校╩iR-NC）共轉(zhuǎn)染到PC3細(xì)胞株中，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測(cè)定PC3細(xì)胞熒光素酶的活性以判斷miR-224對(duì)CNNM1 3’UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)的作用。

1.5 Western blot檢測(cè)

提取PC3細(xì)胞蛋白，灌膠上樣蛋白20μg/孔，濃縮膠電泳條件為80 V、30 min，分離膠電泳條件為90 V、90 min，轉(zhuǎn)膜條件為 120 V、90 min。一抗 4℃過(guò)夜，二抗孵育2 h。選擇合適的曝光底片，將底片進(jìn)行高清掃描，通過(guò)Image J軟件進(jìn)行灰度值的分析。

1.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)及免疫組織化學(xué)法染色

取過(guò)表達(dá)miR-224和對(duì)照組PC3細(xì)胞，分別注射到同裸鼠背部左右對(duì)稱部位的皮下，接種細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)/側(cè)，共接種4只裸鼠。每4天測(cè)量1次腫瘤長(zhǎng)度和寬度，并計(jì)算腫瘤體積（mm3）=寬2（mm2）×長(zhǎng)（mm）/2。接種后第32天處死裸鼠獲取移植瘤組織，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。

裸鼠成瘤組織進(jìn)行石蠟切片，常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)及內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，加一抗4℃孵育過(guò)夜。次日依次加入生物素化二抗、二氨基聯(lián)苯氨避光顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水及二甲苯透明，中性樹膠封片。染色結(jié)果判斷：顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，以微血管著色為基準(zhǔn)，無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；400倍顯微鏡下無(wú)微血管染色為0分，1～5條微血管著色為1分，6～10條微血管著色為2分，＞10條微血管著色為3分。2項(xiàng)結(jié)果相乘為染色總評(píng)分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson法，生存率的比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織miR-224、CNNM1表達(dá)與疾病生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性

從Talyor數(shù)據(jù)庫(kù)得到139例前列腺癌根治術(shù)患者的資料，其中133例患者有miR-224表達(dá)數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier法分析miR-224、CNNM1與前列腺癌生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性。miR-224高表達(dá)組的無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率與低表達(dá)組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.593，P=0.018），高表達(dá)組的無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率高于低表達(dá)組。CNNM1高表達(dá)組的無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率與低表達(dá)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.528，P=0.033），高表達(dá)組低于低表達(dá)組。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-224的下游靶基因CNNM1

Pearson相關(guān)性分析提示，Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)中與miR-224呈負(fù)相關(guān)的基因共39個(gè)，再經(jīng)軟件Targetscan、Pic Tar、miRanda及 miRwalk共同對(duì) miR-224下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CNNM1為miR-224的下游靶基因（r=-0.378，P=0.010）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-224過(guò)表達(dá)對(duì)CNNM1野生型和突變型3’UTR序列的熒光載體活性影響比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.926，P=0.007）。與對(duì)照組比較，miR-224過(guò)表達(dá)降低CNNM1野生型3’UTR區(qū)的熒光載體活性，而對(duì)CNNM1突變型3’UTR區(qū)的熒光載體活性無(wú)影響；在miR-224過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，與CNNM1突變型 3’UTR區(qū)相比，miR-224降低CNNM1野生型3’UTR區(qū)的熒光載體活性，表明miR-244能與CNNM1基因的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合，影響CNNM1基因的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線分析

圖2 miR-224與CNNM1的相關(guān)性及調(diào)控關(guān)系

2.3 miR-224通過(guò)CNNM1抑制前列腺癌細(xì)胞CD31的表達(dá)

前列腺癌PC3細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-224，經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)，提取細(xì)胞miRNA。經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證miR-224過(guò)表達(dá)成功，提取細(xì)胞蛋白用Western-blot檢測(cè)CNNM1和CD31蛋白表達(dá)情況。結(jié)果提示，miR-224過(guò)表達(dá)與對(duì)照組的CNNM1表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.905，P=0.008）；miR-224 過(guò)表 達(dá)與對(duì) 照組CD31表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.658，P=0.009）。miR-224過(guò)表達(dá)的PC3細(xì)胞CNNM1和CD31表達(dá)量較對(duì)照組減少。見(jiàn)圖3。

為進(jìn)一步明確前列腺癌細(xì)胞中CD31與CNNM1表達(dá)的關(guān)系，構(gòu)建過(guò)表達(dá)CNNM1的PC3細(xì)胞，并經(jīng)PCR驗(yàn)證，提取細(xì)胞蛋白檢測(cè)CD31的變化，結(jié)果提示CNNM1表達(dá)增加能促進(jìn)CD31的表達(dá)（t=3.303，P=0.030）。見(jiàn)圖 4。

2.4 miR-224抑制前列腺癌生長(zhǎng)及腫瘤微血管形成

將miR-224過(guò)表達(dá)和對(duì)照組PC3細(xì)胞株注射到裸鼠皮下，復(fù)制異體移植瘤模型。miR-224組與對(duì)照組細(xì)胞注射到皮下 8、12、16、20、24、28 和 32 d 后，測(cè)量移植瘤的體積，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的移植瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.302，P=0.003）；②miR-224 組與對(duì)照組在相同生長(zhǎng)時(shí)間的移植瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.620，P=0.004），miR-224組與對(duì)照組比較，在相同生長(zhǎng)時(shí)間下其移植瘤的體積較小，miR-224能抑制腫瘤的生長(zhǎng)；③miR-224組與對(duì)照組的移植瘤生長(zhǎng)的變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.347，P=0.002）。見(jiàn)附表和圖 5。

圖3 miR-224對(duì)CNNM1和CD31表達(dá)的影響

圖4 CNNM1對(duì)CD31表達(dá)的影響

附表 兩組不同時(shí)間的腫瘤生長(zhǎng)情況 （n=4，cm3，±s）

附表 兩組不同時(shí)間的腫瘤生長(zhǎng)情況 （n=4，cm3，±s）

組別 8 d 12 d 16 d 20 d 24 d 28 d 32 d miR-224 組 0.06±0.01 0.11±0.03 0.18±0.07 0.23±0.07 0.33±0.07 0.38±0.10 0.42±0.16對(duì)照組 0.12±0.02 0.21±0.06 0.31±0.07 0.46±0.07 0.54±0.09 0.63±0.12 0.76±0.19

圖5 PC3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型生長(zhǎng)曲線圖

將裸鼠腫瘤組織石蠟切片，用CD31抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色以評(píng)估微血管的形成，結(jié)果提示，對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量為（5.65±1.36）條，過(guò)表達(dá)miR-224腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量為（3.42±1.15）條，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.067，P=0.012），過(guò)表達(dá)miR-224腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量減少。見(jiàn)圖6。

圖6 miR-224對(duì)前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤標(biāo)本血管形成的影響

3 討論

miRNAs對(duì)基因的調(diào)節(jié)方式復(fù)雜，1個(gè)microRNA能調(diào)節(jié)不同的基因，不同的microRNA能調(diào)節(jié)同個(gè)基因，這樣復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成microRNAs對(duì)基因功能的精確調(diào)節(jié)。miR-224與腫瘤的關(guān)系存在腫瘤異質(zhì)性，即miR-224在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用。有報(bào)道稱，miR-224在肝癌中高表達(dá)，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷徙及侵襲，另外在乳腺癌、結(jié)腸癌中也有類似作用[5-7]。在前列腺癌中，miR-224通過(guò)靶向負(fù)性調(diào)控CAMKK2，抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲及增殖[8]。

本研究首先通過(guò)Taylor前列腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，發(fā)現(xiàn)miR-224、CNNM1與前列腺癌的生化復(fù)發(fā)相關(guān)。再通過(guò)多種軟件共同預(yù)測(cè)提示，CNNM1是miR-224所調(diào)控的潛在下游靶基因，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CNNM1與miR-224呈負(fù)相關(guān)，miR-224降低攜帶CNNM1野生型3’UTR序列的熒光報(bào)告載體的活性，這符合miRNAs對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)機(jī)制。CNNM1作為一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，與人類腫瘤的關(guān)系尚不明確。有研究報(bào)道，在小鼠精原細(xì)胞中，CNNM1與腫瘤細(xì)胞分化有關(guān)，低表達(dá)的CNNM1能促發(fā)精原細(xì)胞的惡性分化[9]。FURUTA等[10]研究認(rèn)為，CNNM1啟動(dòng)子的甲基化與人類惡性黑色素瘤的形成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3中，miR-224過(guò)表達(dá)能使CNNM1和CD31表達(dá)下調(diào)，CNNM1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)CD31的生成。裸鼠成瘤免疫組織化學(xué)法染色進(jìn)一步證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-224能抑制腫瘤組織內(nèi)微血管數(shù)量形成。CD31又稱為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，主要用于證明內(nèi)皮細(xì)胞組織的存在，是常用于評(píng)估腫瘤新生血管形成的標(biāo)志物，CD31表達(dá)升高意味著腫瘤微血管生成增加[11]。微血管的形成能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部遷徙和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]。因此筆者推測(cè)，在前列腺癌中，miR-224與生化復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)可能與miR-224抑制前列腺癌微血管生成有關(guān)。

上世紀(jì)70年代，F(xiàn)OLKMAN[13]首次提出，腫瘤生長(zhǎng)依賴于新血管生成，并逐漸使該領(lǐng)域成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。新生血管使腫瘤能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是促成腫瘤從無(wú)血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段的關(guān)鍵；抗血管治療有望阻斷腫瘤血管的生成，從而最終達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用[14]。由于miRNAs功能的多樣性，人們對(duì)miRNAs在腫瘤血管生成方面的作用也進(jìn)行廣泛研究，發(fā)現(xiàn)miR-494可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的血管生成，miR-21可以通過(guò)蛋白激B/缺氧誘導(dǎo)因子1a/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通路，誘導(dǎo)前列腺癌新生血管形成[15-16]?？梢?jiàn)miRNAs本身就是重要的腫瘤抗血管治療靶標(biāo)。本研究結(jié)果提示，miR-224靶向CNNM1，抑制前列腺癌生化復(fù)發(fā)及微血管生成，為研究miRNAs與前列腺癌血管生成的關(guān)系提供更多理論依據(jù)。

綜上所述，本研究首次提出，miR-224靶向調(diào)控前列腺癌細(xì)胞CNNM1的表達(dá)，抑制腫瘤微血管的形成，減少前列腺癌生化復(fù)發(fā)。對(duì)miR-224-CNNM1軸的進(jìn)一步研究能更深入了解前列腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制，并使miR-224成為前列腺癌治療的潛在靶標(biāo)。

[1]吳培培,邢力剛.腫瘤抗血管生成靶向藥物耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志,2012,20(19):1593-1596.

[2]FARH K K,GRIMSON A,JAN C,et al.The widespread impact of mammalian microRNAs on mRNA repression and evolution[J].Science,2005,310(5755):1817-1821.

[3]韓兆冬,林卓遠(yuǎn),梁應(yīng)科,等.微小RNA-224靶向Tribbles同源蛋白1調(diào)控前列腺癌細(xì)胞DU145的遷移和侵襲[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2015,12(32):2939-2942.

[4]TAYLOR B S,SCHULTZ N,HIERONYMUS H,et al.Integrative genomic profiling of human prostate cancer[J].Cancer Cell,2010,18(1):11-22.

[5]LIN L,LU B,YU J,et al.Serum miR-224 as a biomarker for detection of hepatocellular carcinoma at early stage[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2016,40(4):397-404.

[6]LIU F,LIU Y,SHEN J,et al.MicroRNA-224 inhibits proliferation and migration of breast cancer cells by down-regulating fizzled 5 expression[J].Oncotarget,2016,7(31):49130-49142.

[7]ZHU Y,XU A,LI J,et al.Fecal miR-29a and miR-224 as the noninvasive biomarkers for colorectal cancer[J].Cancer Biomark,2016,16(2):259-264.

[8]FU H,HE H C,HAN Z D,et al.MicroRNA-224 and its target CAMKK2 synergistically influence tumor progression and patient prognosis in prostate cancer[J].Tumour Biol,2015,36(3):1983-1991.

[9]CHANDRAN U,INDU S,KUMAR A T,et al.Expression of cnnm1 and its association with stemness,cell cycle,and differentiation in spermatogenic cells in mouse testis[J].Biol Reprod,2016,95(1):7.

[10]FURUTA J,NOBEYAMA Y,UMEBAYASHI Y,et al.Silencing of peroxiredoxin 2 and aberrant methylation of 33 CpG islands in putative promoter regions in human malignant melanomas[J].Cancer Res,2006,66(12):6080-6086.

[11]LERTKIATMONGKOL P,LIAO D,MEI H,et al.Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1(CD31)[J].Curr Opin Hematol,2016,23(3):253-259.

[12]李海民,趙愛(ài)志,竇科峰,等.肝癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中的微血管生成機(jī)制[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002(6):559-562.

[13]FOLKMAN J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.

[14]WEIS S M,CHERESH D A.Tumor angiogenesis:molecular pathways and therapeutic targets[J].Nat Med,2011,17(11):1359-1370.

[15]MAO G,LIU Y,FANG X,et al.Tumor-derived microRNA-494 promotes angiogenesis in non-small cell lung cancer[J].Angiogenesis,2015,18(3):373-382.

[16]LIU L Z,LI C,CHEN Q,et al.MiR-21 induced angiogenesis through AKT and ERK activation and HIF-1α expression[J].PLoS One,2011,6(4):DOI:10.1371/journal.pone.0019139.

（童穎丹 編輯）

miR-224 inhibits angiogenesis of prostate cancer by targeting cyclin protein M1*

Ya-qiang Huang,Hong-xing Huang,Zhi-peng Mai,Wei Li,Yi-qun Zheng,Run-qiang Yuan
(Department of Urology,Zhongshan Hospital of Sun Yat-sen University,Zhongshan,Guangdong 528403,China)

ObjectiveTo investigate the impacts of miR-224 on biochemical recurrence and angiogenesis of prostate cancer.MethodsBioinformatics analysis and luciferase reporter assay were performed to predict the gene that can be directly inhibited by miR-224.Taylor database was used for confirming the expressions of CNNM1 and miR-224,and their correlations with biochemical recurrence of prostate cancer.Finally,the impacts of CNNM1 and miR-224 on angiogenesis of prostate cancer were explored by PC3 cellin vitroandin vivo.ResultsCNNM1 was directly regulated by miR-224,and their expression levels were negatively correlated in prostate cancer tissue(r=-0.378,P＜0.05).miR-224 was negatively correlated to,while CNNM1 was positively correlated to biochemical recurrence of prostate cancer (P＜0.05).The expressions of CNNM1 and CD31 decreased in the PC3 cells overexpressing miR-224 (P＜0.05).However,CNNM1 enhanced the expression level of CD31 (P＜0.05).The immunochemical staining of the transplantation tumor in the nude mice displayed that miR-224 overexpression could suppress angiogenesis in the prostate cancer tissue.ConclusionsmiR-224 suppresses angiogenesis and biochemical recurrence of prostate cancer by targeting CNNM1.

prostate cancer;miR-224;CNNM1;biochemical recurrence;angiogenesis

R737.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.004

1005-8982（2017）17-0019-06

2017-02-06

中國(guó)博士后科學(xué)基金（No：2016M590842）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（No：A2016052）；廣東省中山市科技計(jì)劃（No：2016B1028）

黃紅星，E-mail：hhxzs@21cn.com