白蛋白納米t-PA基因涂層支架的研制及其抗血栓作用*

何霞，季軍，陳小玲，胡偉

（廣東省深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院 1.病理科，2.心內(nèi)科，廣東 深圳 518020）

白蛋白納米t-PA基因涂層支架的研制及其抗血栓作用*

何霞1，季軍1，陳小玲1，胡偉2

（廣東省深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院 1.病理科，2.心內(nèi)科，廣東 深圳 518020）

目的制備白蛋白納米組織型纖溶酶原激活物（t-PA）基因涂層支架，觀察其預(yù)防實驗兔支架內(nèi)血栓形成和內(nèi)膜增生的效果。方法用不銹鋼支架為龍骨模擬血管基底膜主要成分（透明質(zhì)酸+Ⅳ型膠原蛋白+層粘連蛋白+纖維連接蛋白），配制涂層液涂于金屬支架表面；制備t-PA基因質(zhì)粒白蛋白納米粒，并將其連接于涂層表面，制備成白蛋白納米t-PA基因涂層支架。用球囊導(dǎo)管損傷兔髂動脈內(nèi)膜制備血管內(nèi)膜增生模型，將上述涂層支架植入局部血管，并用治療性超聲輔助轉(zhuǎn)染。分別于術(shù)前，以及術(shù)后1、2和4周取血檢測t-PA、D-二聚體含量及凝血酶原時間的變化。體視鏡和常規(guī)病理觀察支架植入血管堵塞及血栓形成情況。形態(tài)測量法測量內(nèi)膜厚度及面積，判斷內(nèi)膜增生。用免疫組織化學(xué)法檢測血管壁t-PA和增殖細胞核抗原的表達。結(jié)果成功制備納米t-PA基因涂層支架。涂層支架植入血管后可見血管壁高效表達t-PA，減少支架內(nèi)血栓形成和內(nèi)膜增生，伴隨t-PA及D-二聚體含量的增加，凝血酶原時間無明顯變化。結(jié)論t-PA基因涂層支架可減少兔支架內(nèi)血栓形成和內(nèi)膜增生，而未影響全身凝血。將支架術(shù)與基因治療同步完成，為該納米基因涂層支架的研制及支架內(nèi)血栓形成的防治提供實驗基礎(chǔ)。

基因涂層支架；組織型纖溶酶原激活物；白蛋白納米粒；血栓形成

經(jīng)皮冠狀動脈成形和支架術(shù)是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病急性心肌梗死的主要方法[1]。支架內(nèi)血栓形成和內(nèi)膜增生是主要副作用。藥物洗脫支架可明顯減少內(nèi)膜增生，但導(dǎo)致靶血管再內(nèi)皮化延遲，炎癥反應(yīng)增加支架內(nèi)晚期和超晚期血栓形成，明顯延長抗血栓治療時間[2-4]。組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，t-PA）是誘導(dǎo)纖溶激活、促進血栓溶解的重要因子[5]。本實驗制備白蛋白納米t-PA基因涂層支架和兔髂動脈內(nèi)膜增生模型，觀察該支架植入對局部血栓形成和內(nèi)膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物 新西蘭純種兔30只，雄性，體重2.3～2.5 kg，由南方醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 pSecTag 2B-t-PA重組質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存，兔抗人t-PA多克隆抗體由深圳晶美生物工程有限公司提供，鼠抗平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin，SMA）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，t-PA酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，牛血清白蛋白購自廣州翔博生物科技有限公司，透明質(zhì)酸購自上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，Ⅳ型膠原蛋白和纖維連接蛋白購自美國Sigma-Aldrich有限公司，層粘連蛋白購自美國Gibco公司。超聲波發(fā)生器系寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品，超聲波治療儀US-700系日本ITO有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 一步法制備白蛋白納米t-PA基因 200 mg牛血清白蛋白加入10ml雙蒸水溶解，用2μl鹽酸調(diào)整pH值至5.5。將2 mg純化pSecTag 2B-t-PA重組質(zhì)粒，加入上述白蛋白溶液中孵育30 min，在超聲場中緩慢滴入20 ml乙醇（乙醇∶水=2∶1），直至溶液出現(xiàn)乳白色并逐滴滴入0.5%戊二醛溶液60 μl，適當(dāng)攪拌，室溫下靜置2 h。減壓使殘余的乙醇揮發(fā)后，所得溶液17 000 r/min離心30 min以除去游離的白蛋白和多余的交聯(lián)劑。雙蒸水重懸沉淀，并用超聲波（180 W，固定頻率 20 kHz，30 s）分散成乳膠狀，置于4℃儲存?zhèn)溆?。? ml制備掃描電鏡標(biāo)本，觀察納米粒形態(tài)、包封率檢測及凝膠阻滯實驗。用Zetasizer 3000粒度分析儀測定粒徑大小。紫外分光光度計檢測并計算納米質(zhì)粒DNA的包封率。首先測量加入的總質(zhì)粒DNA含量，再將納米包裹基因后的溶液離心并測量上清液中游離質(zhì)粒DNA。包封率（%）=（W總-W游）/W總×100%（W總為總加入量；W游為上清液中質(zhì)粒DNA測得量）。

1.2.2 白蛋白納米t-PA基因涂層支架制備方法①無菌配制血管基底膜涂層液：按每毫升透明質(zhì)酸各（0.5%）含Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白50、100和50μg配制支架表面涂層液；②常規(guī)316 L不銹鋼支架網(wǎng)經(jīng)無菌處理后，置于經(jīng)超聲波震蕩處理的血管基底膜涂層液中，室溫（25℃）下孵育1 h，將涂層鋼網(wǎng)無菌常溫風(fēng)干，4℃保存?zhèn)溆茫虎蹖⑸鲜鐾繉又Ъ茉谥睆? mm的球囊上壓模成型；④無菌下將壓模成型支架浸于制備的白蛋白納米t-PA基因液中孵育30 min進行表面連接涂層，經(jīng)室溫晾干后浸于血管基底膜涂層液中孵育30 min。再次用白蛋白納米t-PA基因交替涂層（見圖1）。每個支架用含1 mg質(zhì)粒的白蛋白納米液涂層；⑤外表用含5%胎牛血清的培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）薄層封涂并自然晾干待用。

圖1 涂層支架模式圖

1.2.3 動物模型和支架術(shù) 將30只兔隨機分成3組：實驗組、對照組及陽性對照組，每組10只。實驗兔用25 mg/kg戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈全身麻醉后，暴露一側(cè)髂外動脈，將直徑2.5 mm球囊導(dǎo)管插入至腹主動脈，充氣[5～8個大氣壓（1個大氣壓=101.325 kPa）]后回拉將髂外動脈內(nèi)膜剝脫；繼續(xù)插入直徑3mm球囊支架行髂動脈支架術(shù)，植入支架為的白蛋白納米t-PA基因涂層支架，經(jīng)皮膚表面對應(yīng)損傷血管和周圍大腿內(nèi)側(cè)肌群局部超聲治療（頻率：1 kHz，強度：1.5 w/cm2，時間：10 min）；對照組和陽性對照組植入相同材料和規(guī)格的裸金屬支架。實驗組和對照組術(shù)后不用抗凝劑，陽性對照組術(shù)后給予阿司匹林50 mg/（kg·d），觀察4周。各組動物分別于術(shù)前，以及術(shù)后1、2和4周抽取靜脈血檢測t-PA和D-二聚體（D-dimer）含量、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）及國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（international normalized ratio，INR）觀察全身凝血狀態(tài)。

1.2.4 標(biāo)本復(fù)制和檢測 實驗動物觀察期結(jié)束后處死，取出髂動脈在大體及體視顯微鏡下觀察動脈腔通暢及支架內(nèi)血栓形成情況，計算血栓形成率。支架動脈段、血管周圍組織及心、肺、肝、腎用多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片和病理學(xué)檢查。應(yīng)用病理圖像分析儀直接測量支架動脈橫切面內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜面積，判斷血管內(nèi)膜增生；采用免疫組織化學(xué)法Max VisionTM試劑盒檢測動脈壁t-PA的表達；采用抗SMA單抗和抗PCNA單抗免疫組織化學(xué)法判斷平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）及其增生，計數(shù) 200 個內(nèi)膜細胞，計算PCNA陽性細胞百分?jǐn)?shù)。取其他重要臟器包括心、肺、肝、腎組織檢測t-PA的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析；計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1t-PA基因白蛋白納米粒的表征分析

掃描電鏡結(jié)果顯示，白蛋白納米粒呈球形，大小較均勻且分散良好。Zetasizer 3000粒度分析儀顯示，白蛋白納米粒粒徑大小呈正態(tài)分布，有效粒徑大小為229.0 nm（見圖2），包封率平均為81.40%，符合實驗要求。凝膠阻滯實驗顯示，白蛋白納米粒對t-PA質(zhì)粒DNA具有保護作用。

2.2 支架血管病理改變和體內(nèi)t-PA的表達

術(shù)后4周所有實驗動物健康存活。肉眼及體視顯微鏡觀察各組實驗血管，對照組10例血管支架內(nèi)均可見血栓（見圖3），血栓形成率為100%，管壁亦較厚，高低不平。陽性對照組中3例肉眼及體視顯微鏡可見血栓，血栓形成率為30%。實驗組中2例肉眼及體視顯微鏡可見血栓，其余見管壁光滑，無明顯狹窄，血栓形成率為20%。實驗組與對照組血栓形成率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。顯微鏡下，對照組和陽性對照組血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜中增生的細胞呈梭形或不規(guī)則形，排列多層且紊亂，細胞間基質(zhì)堆積較多，可見散在炎癥細胞，管腔內(nèi)可見血栓形成（見圖4）。SMA抗體染色顯示，增生的細胞多為SMC（見圖5）；PCNA抗體染色顯示，其中較多細胞呈陽性反應(yīng)。實驗組內(nèi)膜較薄，內(nèi)膜細胞多為長梭形并與管腔平行（見圖6），PCNA陽性細胞較少。3組支架動脈內(nèi)膜厚度和面積、PCNA陽性細胞計數(shù)及血栓形成率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。實驗組與對照組、陽性對照組比較，內(nèi)膜厚度、面積及PCNA陽性細胞計數(shù)降低，可見t-PA納米基因支架通過減緩內(nèi)膜SMC增殖，限制血管內(nèi)膜增生。免疫組織化學(xué)法顯示，實驗組t-PA陽性表達主要分布在增生的血管內(nèi)膜，在血管中膜亦可見散在和較弱陽性表達（見圖7）；對照組血管壁t-PA陰性表達。此外，其他組織包括肝臟、心臟、腎臟和肺臟等病理大體及蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)明顯異常，免疫組織化學(xué)法也未發(fā)現(xiàn)t-PA陽性表達。

圖2 制備的白蛋白納米粒

圖3 對照組血管支架內(nèi)血栓形成

圖4 對照組支架血管 （HE×200）

圖5 對照組增生的內(nèi)膜（免疫組織化學(xué)法×200）

圖6 實驗組支架血管 （HE×200）

圖7 實驗組支架血管內(nèi)膜（免疫組織化學(xué)法×200）

表1 3組支架植入動脈的內(nèi)膜厚度、面積、內(nèi)膜PCNA陽性細胞計數(shù)及血栓形成率比較 （n=10）

2.3 t-PA、D-dimer含量及PT、INR

2.3.1 t-PA、D-dimer含量 實驗組、對照組及陽性對照組支架術(shù)前，以及術(shù)后1、2和4周t-PA和D-dimer含量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間t-PA和D-dimer含量有差異（F=322.450和814.236，均P=0.000）。②3組t-PA和D-dimer含量有差異（F=539.373 和 864.755，均P=0.000）；實驗組與對照組、陽性對照組比較，術(shù)后t-PA和D-dimer含量較高。③3組t-PA和D-dimer含量變化趨勢有差異（F=138.507和 452.177，均P=0.000）。與術(shù)前比較，實驗組于術(shù)后1周血t-PA和D-dimer含量增高，并一直持續(xù)至第4周觀察結(jié)束；而對照組和陽性對照組于術(shù)后1周血t-PA和D-dimer含量雖有增高，但之后降低并維持在正常水平。見表2和圖 8、9。

2.3.2 PT、INR 實驗組與對照組、陽性對照組術(shù)前，以及術(shù)后1周、2周、4周PT值和INR比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間PT值和INR 無差異（F=0.725和 0.814，P=0.402和 0.375）。②3組PT值和INR無差異（F=0.464和0.461，P=0.634和0.636）。③3組PT值和INR變化趨勢無差異（F=0.269和0.243，P=0.766和0.786）。3組PT值和INR于支架術(shù)前，以及術(shù)后1、2和4周未見顯著改變。見表3和圖10、11。

表2 3組支架術(shù)前后t-PA和D-dimer含量變化（n=10，μg/L，±s）

表2 3組支架術(shù)前后t-PA和D-dimer含量變化（n=10，μg/L，±s）

組別 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后4周對照組t-PA 0.20±0.03 0.43±0.05 0.22±0.04 0.22± 0.06 D-dimer 32.3± 10.63 107.5± 9.38 34.10±11.02 34.6±10.8陽性對照組t-PA 0.21±0.03 0.45±0.06 0.24±0.05 0.23±0.04 D-dimer33.6±11.63 157.7±16.04 34.4±11.32 35.3±11.86實驗組t-PA 0.21±0.04 0.74±0.06 0.79±0.05 0.83±0.04 D-dimer33.9±10.15 320.60±23.48 346.40±29.27 359.9±29.95

圖8 3組不同時間t-PA含量變化趨勢

圖9 3組不同時間D-dimer含量變化趨勢

表3 3組支架術(shù)前后PT和INR變化 （n=10，±s）

表3 3組支架術(shù)前后PT和INR變化 （n=10，±s）

組別 術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后4周對照組PT/s 9.68±0.50 9.47±0.39 9.48±0.52 9.41±0.59 INR 0.80±0.04 0.79±0.03 0.79±0.04 0.78±0.05陽性對照組PT/s 9.38±0.51 9.28±0.48 9.25±0.61 9.43±0.41 INR 0.78±0.04 0.77±0.04 0.77±0.05 0.78±0.03實驗組PT/s INR 9.43±0.63 0.79±0.05 9.35±0.62 0.78±0.05 9.30±0.51 0.77±0.04 9.33±1.01 0.78±0.09

圖10 3組不同時間PT變化趨勢

圖11 3組不同時間INR變化趨勢

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病經(jīng)皮冠狀動脈介入治療經(jīng)歷3個發(fā)展階段：第一階段為單純球囊擴張時代，第二階段為金屬裸支架時代，第三階段為藥物支架時代[6]。單純球囊擴張會導(dǎo)致血管彈性回縮、負性重塑、血栓形成及內(nèi)膜增生[7]。金屬裸支架克服血管彈性回縮，但由于血管壁損傷、血栓形成，激活的血小板釋放促進SMC增殖的各種細胞因子，SMC從收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型進行增殖并從中層向內(nèi)膜遷移，形成新生內(nèi)膜[8]。因此，抑制早期血栓形成可能抑制內(nèi)膜增生。藥物洗脫支架雖然減少內(nèi)膜增生，但是其抗增殖藥物在抑制平滑肌細胞增殖的同時，抑制內(nèi)皮細胞再生導(dǎo)致內(nèi)皮愈合延遲，增加后期支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險，導(dǎo)致抗凝治療的時間明顯延長[9-13]。而長期抗凝治療會導(dǎo)致出血等并發(fā)癥，一旦停藥可能出現(xiàn)血栓再生。t-PA是一種新型的血栓溶解劑，其是由527個氨基酸構(gòu)成的絲氨酸蛋白酶，在各種刺激尤其是纖維蛋白的作用下釋放入血，與血栓基質(zhì)有很高的特異性親和力，可選擇性激活血栓中與纖維蛋白結(jié)合的纖溶酶原促進纖維蛋白降解。其功能具有血凝塊相對特異性，而在沒有纖維蛋白時活性相對較低[14]。本實驗室曾構(gòu)建t-PA基因質(zhì)粒載體，用外科縫線或納米粒包裹，獲得基因的有效轉(zhuǎn)染并成功預(yù)防實驗性冠狀動脈搭橋術(shù)吻合口血栓形成和再狹窄及心瓣膜置換術(shù)后血栓形成。血管基底膜是維持血管壁結(jié)構(gòu)完整和功能正常的必要保證，對血管起支持、保護作用，并與血管壁細胞相互作用，影響其黏附、增殖、遷移、分化等功能。透明質(zhì)酸是血管基底膜的一種成分，與細胞和細胞基質(zhì)高度相容，不僅維持血管壁的完整性，而且抑制血小板黏附，間接抑制平滑肌細胞的遷移并增強血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[15]。本實驗中，針對上述支架的不足，筆者設(shè)計t-PA基因涂層支架，模擬血管基底膜主要成分（透明質(zhì)酸+Ⅳ型膠原蛋白+層粘連蛋白+纖維連接蛋白），制備涂層液并涂到支架表面，促進支架植入血管的內(nèi)皮愈合，用白蛋白納米粒攜帶t-PA基因質(zhì)粒，并連接于涂層表面促進基因的轉(zhuǎn)染，從而發(fā)揮t-PA的抗凝等功能[16-17]。將t-PA基因涂層支架植入兔髂動脈后4周，與金屬裸支架組相比，免疫組織化學(xué)法證實支架置入血管壁及周圍組織t-PA表達增強，血液t-PA和D-二聚體含量也增高，涂層支架成功地抑制支架術(shù)后血栓形成及內(nèi)膜增生。而血液凝血酶原時間和INR沒有明顯改變，表明涂在支架表面的基因質(zhì)粒釋放并轉(zhuǎn)染到周圍血管壁組織產(chǎn)生的活性t-PA僅僅是激活局部的纖溶系統(tǒng)導(dǎo)致血栓溶解，而未對全身凝血系統(tǒng)產(chǎn)生明顯影響。與常規(guī)支架術(shù)后長期應(yīng)用抗凝藥物相比，t-PA基因涂層支架大大降低出血風(fēng)險。免疫組織化學(xué)法檢測在肝臟、心臟、腎臟及肺臟等，均未發(fā)現(xiàn)t-PA陽性表達，對該臟器進行病理大體及顯微鏡下觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯異常，表明t-PA涂層支架未對全身臟器造成明顯的毒性。

本實驗成功制備t-PA基因涂層支架，并證實該支架能夠抑制兔早期支架內(nèi)血栓形成及內(nèi)膜增生。將支架術(shù)與基因治療同步完成，方便可行，為支架的設(shè)計提供一種思路，為支架內(nèi)血栓形成及內(nèi)膜增生的防治提供一種新的途徑。在以后的實驗中，通過優(yōu)化每個支架所用的t-PA質(zhì)粒的量，以期達到最佳的轉(zhuǎn)染效果；將動物觀察時間延長到6個月甚至1年或許能夠更好地了解t-PA基因涂層支架的遠期效果；還可以嘗試將t-PA質(zhì)粒涂層到其他材料的支架上進行觀察。

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（童穎丹 編輯）

Preparation of nanoparticle gene-coated stent and its antithrombotic effect*

Xia He1,Jun Ji1,Xiao-ling Chen1,Wei Hu2
(1.Department of Pathology,2.Department of Cardiovascular Internal Medicine,Shenzhen Sun Yat-sen Cardiovascular Hospital,Shenzhen,Guangdong 518020,China)

s:ObjectiveTo prepare albumin nanoparticle tissue-type plasminogen activator (t-PA)genecoated stent and observe its effect on prevention of in-stent thrombosis and intimal hyperplasia in rabbits.MethodsStainlesssteel stentwascoated with thecoatingliquid which wasprepared from themain components of vascular basement membrane (hyaluronic acid+typeⅣcollagen+laminin+fibronectin).To prepare albumin nanoparticlet-PAgene-coated stent,thet-PAgene plasmid was packaged by albumin nanoparticles and then connected to the coating surface.A rabbit iliac artery intimal hyperplasia model was constructed with balloon catheter.The nanoparticlet-PAgene-coated stent was implanted into the iliac artery andt-PAgene was transfected with the aid of therapeutic ultrasound.The blood levels of prothrombin time,t-PA and D-dimer were measured before and 1,2 and 4 weeks after operation.The vascular obstruction and in-stent thrombosis after stent implantation were observed by stereoscope and routine pathological examination.Morphometry wasused to measure intimalthicknessand area to determine intimalhyperplasia.The expressions of t-PA and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)were detected by immunohistochemistry.ResultsThet-PAgene-coated stent was successfully prepared.The expression of t-PA protein in theimplanted arteries was observed,accompanied by an increase in blood t-PA and D-dimer.There was no significant change in prothrombin time after implantation of the gene-coated stent.In-stent thrombosis and intimal hyperplasia were successfully suppressed.ConclusionsThet-PAgene-coated stent can successfully inhibit in-stent thrombosis and intimal hyperplasia without affecting systemic coagulation of the rabbit.The complete synchronization of stenting and gene therapy provides the experimental basis for the development of nano-gene-coated stent and prevention of in-stent thrombosis.

gene-coated stent;tissue-type plasminogen activator;albumin nanoparticle;thrombosis

R543；R654.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.003

1005-8982（2017）17-0013-06

2016-11-10

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（No：A2015529）

季軍，E-mail：jijun3@126.com