青藤堿對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的影響*

石宇紅，彭瓊，任亞飛，許佳，李麗梅，李寶貞，莫漢有

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院 風濕免疫科，廣西 桂林 541002）

基礎研究·論著

青藤堿對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的影響*

石宇紅，彭瓊，任亞飛，許佳，李麗梅，李寶貞，莫漢有

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院 風濕免疫科，廣西 桂林 541002）

目的觀察青藤堿對Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎模型大鼠（CIA）低氧誘導因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及基質(zhì)金屬蛋白9（MMP-9）的影響，探討青藤堿對類風濕關節(jié)炎（RA）滑膜血管新生的作用機制。方法40只遠交群大鼠，隨機選取10只作為對照組，余30只大鼠采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑的方法復制關節(jié)炎模型。15 d后造模大鼠隨機分為模型組、雷公藤組、青藤堿組，每組10只。雷公藤組：雷公藤多甙片9.68 mg/（kg·d）灌胃給藥；青藤堿組：青藤堿片100 mg/（kg·d）灌胃給藥；模型組灌服等體積0.9%氯化鈉注射液。1次/d，共28 d。期間測量大鼠踝關節(jié)腫脹度。灌藥28 d后處死大鼠，免疫組織化學法檢測關節(jié)滑膜組織HIF-1α水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清中VEGF、MMP-9水平。結果與模型組比較，青藤堿組和雷公藤組大鼠關節(jié)腫脹度減輕（P＜0.05）；青藤堿組和雷公藤組滑膜組織中HIF-1α表達降低（P＜0.05）；青藤堿組和雷公藤組血清中VEGF、MMP-9表達降低（P＜0.05）。結論青藤堿可降低CIA踝關節(jié)腫脹，療效與雷公藤多甙相當。其機制可能是通過下調(diào)HIF-1α的表達及VEGF、MMP-9水平，從而減少滑膜新生血管生成。

青藤堿；Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎；低氧誘導因子1α；基質(zhì)金屬蛋白9

新生血管翳是類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）關節(jié)破壞的關鍵。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管新生與低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）[1]、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[2-3]、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）[4]有關，其共同作用可影響新生血管的形成。

青藤堿是從青風藤中提取的單體，其對RA、強直性脊柱炎等自身免疫性疾病有較好的治療作用。本研究通過復制Ⅱ型膠原誘導關節(jié)炎大鼠（collagen-induced arthritis rats，CIA）模型，探討青藤堿對模型大鼠HIF-1α、VEGF及MMP-9的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級遠交群（sprague dawley，SD）大鼠，雄性，40只，體重120～160 g。由桂林醫(yī)學院實驗中心提供（動物許可證號：SYXK桂2013-0001）。在桂林醫(yī)學院實驗中心動物室適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑

青藤堿（正清風痛寧片，湖南正清制藥集團股份有限公司，批號：Z43020278），雷公藤多甙片（浙江得恩德制藥有限公司，批號：Z33020422），牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex公司），不完全弗氏佐劑（美國Sigma公司），HIF-1α小鼠單克隆抗體（美國Thermo公司），羊抗鼠二抗（福州邁新生物工程有限公司），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（大連寶生生物工程有限公司），VEGF試劑盒（南京建成生物工程研究所），MMP-9試劑盒（北京中山生物技術有限公司）。

1.3 實驗儀器

基因擴增儀（德國Biometra公司），凝膠電泳結果圖像分析儀（上海培清JS-780），可調(diào)式微量移液器（德國Eppendorf公司），光學顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司，IX71），病理組織切片機（德國LEICA RM公司，2025），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5804R），微量臺式高速冷凍離心機（美國Thremo公司）。

1.4 動物模型的復制及分組

健康雄性SD大鼠40只，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為對照組，其余30只復制Ⅱ型CIA大鼠模型。取適量濃度為2 mg/ml牛Ⅱ型膠原溶液逐滴加入等容積的弗氏不完全佐劑中，牛Ⅱ型膠原終濃度調(diào)整為1 mg/ml。用勻漿器在冰浴中充分乳化至滴加水中不擴散，取乳化后的混合物按200 μg/只，于尾根部皮下注射，7 d后按牛Ⅱ型膠原100 μg/只，尾根部皮下加強免疫1次。免疫15 d后，將大鼠分為模型組、雷公藤組、青藤堿組，每組10只。

1.5 給藥方法及樣本制備

分組后開始灌胃給藥，對照組正常條件下喂養(yǎng)，不做任何處理；模型組給予0.9%氯化鈉注射液100.00 mg/（kg·d）；雷公藤組給予雷公藤多甙片9.68 mg/（kg·d）；青藤堿組給予青藤堿片100.00 mg/（kg·d）。以上藥物均連續(xù)灌胃28 d。28 d后戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，2 500 r/min離心20 min，取血漿，分裝后置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。取腕關節(jié)、膝關節(jié)或踝關節(jié)的滑膜組織于4%多聚甲醛中固定。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 關節(jié)腫脹度測量 第1次免疫前在大鼠后肢踝關節(jié)上方0.5 cm處進行標記，分別于免疫前及給藥完成后用足趾容積測量儀測量踝關節(jié)排水體積，計算關節(jié)腫脹度。腫脹度=（Vt-Vo）/Vo×100%，Vo為造模前的容積，Vt為給藥完成后的容積。

1.6.2 滑膜病理學評分 留取血樣后處死大鼠，取腕關節(jié)、膝關節(jié)或踝關節(jié)放入4%多聚甲醛固定16 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脫鈣，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋切片、蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。光鏡下觀察關節(jié)滑膜增生、滑膜下炎癥程度及血管翳生成情況?；の⒀軝z測：每個標本在100倍光鏡下隨機抽取5個視野做毛細血管計數(shù)，以5個視野計數(shù)的均值作為每個標本的血管計量指標。微血管密度結果判定：低倍鏡下找到病灶中微血管最密集（熱點）的3個區(qū)，高倍鏡（400倍）下計數(shù)該3個區(qū)的微血管數(shù)或微淋巴數(shù)，取3個高倍鏡下的微血管數(shù)平均值。

1.6.3 免疫組織化學法檢測HIF-1α的表達 滑膜組織切片先脫蠟、水化，0.01 mol/L、pH 6.0檸檬酸微波修復，3%雙氧水H2O2封閉，正常山羊血清封閉，加一抗，40℃過夜；加二抗，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，加二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液，沖洗、復染、封片、鏡檢。HIF-1α陽性細胞為在胞質(zhì)或胞核中可見黃色或棕褐色陽性產(chǎn)物的細胞。每張切片隨機檢測10個高倍鏡視野。①陽性細胞所占比例評分：陰性為0分，＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為 4分。②按陽性著色程度評分：無著色、與背景色一致為0分，淺黃色略高于背景色為1分，棕黃色、明顯高于背景色為2分，棕褐色為3分。③兩者乘積判定陽性結果。

1.6.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測VEGF 濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋，加入血漿標本稀釋液1.0 ml至標準品中，待徹底溶解后，靜置15 min混勻（濃度為2 μg/L），然后根據(jù)需要進行稀釋。以生物素化抗體稀釋液稀釋生物素化抗體，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮酶結合物。要求注入自動洗板機的洗滌液為350 μl，注入與吸出間隔15～30 d，洗板4次。除空白孔外，分別將標本或不同濃度標準品（100μl/孔）加入相應孔后用封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育90 min，洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液（100μl/孔），用封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育60 min，洗板4次。除空白孔外，加入酶結合物工作液（100μl/孔），封住板孔，37℃孵箱孵育30 min，洗板4次。加入底物顯色劑100 μl/孔，37℃避光孵育15～20 min（視顏色深淺靈活掌握），加入終止液100μl/孔，混勻后即刻（5 min內(nèi)）測量450 nm處吸光度值。

1.6.5 ELISA法檢測MMP-9的表達 采用血漿樣品，肝素鋰抗凝。其余步驟同VEGF。經(jīng)稀釋后加至預經(jīng)單抗或明膠包被的反應微孔，37℃溫育反應2 h，洗滌5次后加入辣根過氧化物-親和素偶聯(lián)物，37℃、30 min；再洗滌 5 次后加入 100 μl/孔 3，4，5-三甲氧基苯甲醛底物液室溫反應10～15 min，最后加入50 μl 1.8 mol/L鹽酸終止反應。根據(jù)標準曲線計算MMP-9表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節(jié)腫脹度比較

造模后第15天除對照組外，其他3組大鼠踝、跖趾關節(jié)及趾關節(jié)出現(xiàn)不同程度紅腫，用藥28 d后，對照組、模型組、雷公藤組、青藤堿組大鼠關節(jié)腫脹度分別為（11.21±3.12）%、（67.46±13.72）%、（31.46±12.57）%和（38.51±13.86）%，各組關節(jié)腫脹度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.293，P=0.001）。模型組與對照組的關節(jié)腫脹度比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=24.311，P=0.000），青藤堿組、雷公藤組與模型組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.456和2.919，P=0.015和0.004），青藤堿組和雷公藤組關節(jié)腫脹度比模型組低，藥物干預作用明顯。

2.2 大鼠踝關節(jié)病理學變化

HE染色結果顯示，對照組大鼠滑膜細胞扁平形，排列整齊，有少量纖維及毛細血管，關節(jié)結構完整，軟骨層表面光滑，無結構破壞。模型組大鼠滑膜細胞層明顯增多，滑膜細胞水腫，排列紊亂，部分滑膜組織可見呈絨毛狀增生，炎癥細胞及纖維細胞浸潤，有較多毛細血管，關節(jié)軟骨粗糙，關節(jié)腔內(nèi)有纖維素樣滲出。雷公藤組滑膜細胞排列尚整齊，纖維組織輕度增生，可見少量炎癥細胞，血管增生不明顯，關節(jié)軟骨表面基本光滑，關節(jié)腔纖維素樣滲出不多。青藤堿組滑膜細胞層數(shù)較模型組增多，達到5、6層，有少量炎癥細胞存在，較雷公藤組稍增多，關節(jié)軟骨組織有輕度破壞。各組各項病理學評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組與對照組病理學評分（總分、滑膜增生、炎癥細胞浸潤、新生血管數(shù)）比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.321、9.425、8.923 和 9.425，均P=0.000），青藤堿組與模型組病理學評分（總分、滑膜增生、炎癥細胞浸潤、新生血管數(shù)）比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.162、2.131、2.836 和 2.126，P=0.041、0.042、0.021和0.045）。見表1和圖1。

2.3 青藤堿對Ⅱ型CIA大鼠滑膜HIF-1α蛋白表達的影響

免疫組織化學法結果顯示，HIF-1α蛋白在正常關節(jié)組織中不表達或僅有微弱表達，而在低氧狀態(tài)下則在胞質(zhì)或胞核中可見黃色或棕褐色的陽性產(chǎn)物。對照組基本沒有HIF-1α蛋白表達；模型組有HIF-1α陽性物質(zhì)在細胞質(zhì)或細胞核中高表達，呈深褐色，尤其是位于滑膜最外層細胞；而雷公藤組和青藤堿組HIF-lα輕度表達。采用半定量積分法進行分析，對照組、模型組、雷公藤組、青藤堿組大鼠HIF-1α 蛋白表達量分別為（1.422±0.783）、（7.354±2.548）、（3.122±1.178）和（3.743±1.624），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=13.781，P=0.000）。模型組與對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.345，P=0.000），青藤堿組、雷公藤組與模型組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.358和 2.615，P=0.024 和 0.011）。見圖 2。

表1 各組大鼠滑膜病理學評分比較 （n=10，分，±s）

表1 各組大鼠滑膜病理學評分比較 （n=10，分，±s）

注:?與模型組、對照組比較，P＜0.05

組別 總分 滑膜增生 炎癥細胞浸潤 新生血管數(shù)對照組 0.093±0.035 0.021±0.008 0.031±0.009 0.023±0.002模型組 0.782±0.095 0.517±0.013 0.137±0.062 0.218±0.145青藤堿組 0.563±0.168?0.275±0.129?0.106±0.028?0.161±0.163?雷公藤組 0.457±0.211?0.246±0.137?0.095±0.031?0.147±0.153?F值 14.985 10.468 6.729 8.873P值 0.000 0.000 0.000 0.001

圖1 大鼠踝關節(jié)腔病理學改變 （HE×200）

圖2 大鼠關節(jié)滑膜組織HIF-1α的表達 （鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法×200）

2.4 CIA大鼠外周血中VEGF和MMP-9的水平

各組外周血VEGF、MMP-9水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=42.563和38.956，均P=0.000）。模型組與對照組的VEGF、MMP-9水平比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.332和5.314，均P=0.000），青藤堿組與模型組的VEGF、MMP-9水平比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.033和5.821，P=0.040和 0.013）。見表 2。

表2 各組大鼠外周血中VEGF和MMP-9的表達比較（n=10，μg/L，±s）

表2 各組大鼠外周血中VEGF和MMP-9的表達比較（n=10，μg/L，±s）

注：?與模型組、對照組比較，P＜0.05

組別 VEGF MMP-9對照組 28.6±5.4 16.2±4.8模型組 135.7±18.5 82.4±9.3雷公藤組 74.8±10.3?40.6±8.5?青藤堿組 68.2±11.3?42.5±10.1?F值 42.563 38.956P值 0.000 0.000

3 討論

RA是我國常見的自身免疫性疾病之一，嚴重者可導致人群喪失勞動力和致殘，嚴重影響患者的生活和生存質(zhì)量。目前其發(fā)病機制仍未完全明確?；赗A的主要病理改變是在炎癥的刺激下，大量炎癥細胞增生、浸潤，關節(jié)滑膜充血、水腫、組織疏松，毛細血管通透性增高，纖維素及漿液滲出至關節(jié)腔內(nèi)，滑膜細胞合成包括腫瘤壞死因子及白細胞介素等多種細胞因子，促進關節(jié)滑膜成纖維細胞增殖和微血管新生，滑膜血管翳形成，繼而侵蝕軟骨與骨組織，造成關節(jié)結構破壞，最終導致關節(jié)畸形及功能損害[5-7]。新生血管形成和細胞外基質(zhì)降解是RA病理過程的核心環(huán)節(jié)，控制新生血管形成和細胞外基質(zhì)降解成為控制RA關節(jié)軟骨侵蝕破壞的關鍵。VEGF是已知的最強刺激血管新生的因子之一，在血管新生中發(fā)揮核心調(diào)控作用[8-9]。在血管的發(fā)育過程中，HIF-1對血管新生也起重要作用，通過抑制HIF-1α的降解，可使VEGF表達增加，最終導致缺血組織的血管新生[10]。既往研究也發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠模型中滑膜組織有HIF-1α高表達，并與炎癥程度呈正相關[11]。在缺氧條件下RA患者滑膜細胞HIF-1α與VEGF表達增高密切相關，提示HIF-1α-VEGF信號途徑在類風濕炎的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。MMP-9是一類可有效降解細胞外基質(zhì)和細胞膜成分的蛋白水解酶，同時通過釋放生長因子、趨化因子及細胞因子等，參與人體許多生理及病理過程。在對腫瘤血管新生的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MMP-9可在卵巢上皮癌過度表達，促進腫瘤血管的生成[12]。在對類風濕關節(jié)炎的研究中也發(fā)現(xiàn)，在MMP-9的作用下可出現(xiàn)滑膜襯里細胞增生、大量炎癥細胞浸潤、滑膜下細胞增生及滑膜下層血管生成，導致增生的滑膜組織向軟骨面生長，形成血管翳，從而出現(xiàn)關節(jié)破壞[13]。提示MMP-9在關節(jié)滑膜血管新生的過程中也發(fā)揮重要作用。

青風藤在我國用于治療類風濕關節(jié)炎的歷史悠久，青藤堿是從中藥青風藤中提取的單體生物堿，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用，現(xiàn)已用于RA的治療。目前研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可通過下調(diào)T細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達，減少細胞對鐵離子的攝入，從而抑制T細胞的活化與增殖；還可減少白細胞介素6的產(chǎn)生，抑制B細胞的活化，從而抑制關節(jié)免疫炎癥和關節(jié)破壞作用[14]。其還可以通過抑制滑膜細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、致炎因子干擾素-γ及一氧化氮等，發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛的效果[15-17]；并且青藤堿可提高CIA大鼠外周血OPG水平，OPG/RANKL比值升高，提示其有骨保護作用[16]。但對于血管新生方面的研究，國內(nèi)研究較少。本研究初步討論青藤堿對HIF-1α、VEGF及MMP9的影響，為青藤堿多種藥理學的免疫研究提供依據(jù)。

本實驗對CIA大鼠模型給予雷公藤多甙和青藤堿治療后，發(fā)現(xiàn)青藤堿可以降低CIA大鼠的關節(jié)腫脹程度，并且在光鏡下也看到其對滑膜血管新生有抑制作用，其作用與雷公藤多甙效果相當。HIF-1α的表達水平提示其可降低HIF-1α在滑膜的表達，結合對外周血VEGF和MMP-9的檢測，顯示青藤堿可降低VEGF和MMP-9的表達，效果與雷公藤多甙相當。因此筆者認為，青藤堿的抗風濕機制除前面所說的免疫抑制和抗炎鎮(zhèn)痛等作用外，還有可能通過影響HIF-1α、VEGF及MMP-9的表達，抑制血管新生，從而減少滑膜血管翳的生成，減少關節(jié)破壞。

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（童穎丹 編輯）

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《中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志》創(chuàng)刊于1991年，期刊號ISSN1005-8982/CN43-1225/R，旬刊，系中國科技論文統(tǒng)計源期刊、北京大學圖書館中文核心期刊、中國核心學術期刊（RCCSE）（A-）及湖南省十佳期刊，被中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、超星域出版、美國《化學文摘》（CA）、俄羅斯《文摘雜志》（AJ）等國內(nèi)外多個檢索系統(tǒng)收錄，公開發(fā)行。本刊是中華人民共和國教育部主管的國家級綜合性醫(yī)學學術期刊，以服務于廣大醫(yī)藥衛(wèi)生科技人員，促進國內(nèi)外醫(yī)學學術交流和醫(yī)學事業(yè)發(fā)展為宗旨。由中南大學、中南大學肝膽腸外科研究中心主辦，中南大學湘雅醫(yī)院承辦。

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投稿細則

Effect of Sinomenine on synovial angiogenesis in rats with collagen-induced arthritis*

Yu-hong Shi,Qiong Peng,Ya-fei Ren,Jia Xu,Li-mei Li,Bao-zhen Li,Han-you Mo
(Department of Rheumatology and Immunology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541002,China)

ObjectiveTo observe the effect of Sinomenine on the expression of hypoxia-inducible factor-1 α (HIF-1α),vascular endothelial growth factor (VEGF)and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9)in rats with typeⅡcollagen-induced arthritis(CIA),and to explore its therapeutic roles and mechanism.MethodsTotally 40 male SD rats were recruited,among which 10 were randomly selected as the normal control group.The CIA model was established in the rest 30 rats by subcutaneous injection of typeⅡ collagen of bovine emulsion in the tail root and induction of incomplete Freund's adjuvant.On day 15 primary immunization rats were randomly divided into 3 groups,i.e.model group,Tripterygium Glycosides(TG)group(at a daily dose of 9.68 mg/kg body weight),and Sinomenine(SIN)group(at a daily dose of 100 mg/kg body weight),10 in each group.The corresponding medication was given to the rats of each group by gastrogavage once daily for 28 days.An equal volume of sodium chloride injection was given to the rats in the normal control group and the model group by gastrogavage,once daily for 28 successive days.The swelling degree of the joints was measured.The rats were sacrificed after 28-day treatment.Plasma levels of VEGF and MMP-9 were measured with ELISA.The expression of HIF-1α in synovium was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the swelling degree of the joints was significantly alleviated in the TG group and the SIN group (P＜0.05),the HIF-1α expression obviously decreased in the synovium of theTG group and the SIN group(P＜0.05),the plasma levels of VEGF and MMP-9 were lower in the TG group and the SIN group (P＜0.05).ConclusionsSIN could markedly alleviate the swelling degree of joints in the CIA model rats.Its therapeutic efficacy is equal to that of TG.Its mechanism might be by down-regulating the HIF-1α expression in joints and the plasma levels of VEGF and MMP-9,thereby reducing synovial neovascularization.

Sinomenine;type Ⅱ collagen-induced arthritis;hypoxia-inducible factor-1α;vascular endothelial growth factor;matrix metalloproteinase-9

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R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.001

1005-8982（2017）17-0001-06

2016-07-05

國家自然科學基金（No：81460257）；廣西中醫(yī)藥管理局課題（No：gzzc1238）；廣西省桂林市攻關課題（No：20140120-1-2）