混合菌種發(fā)酵紅豆腐特征香氣成分的鑒定

崔曉紅，高柳，鄧小飛，趙金梅，馬力，劉平

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

·分析與檢測(cè)·

混合菌種發(fā)酵紅豆腐特征香氣成分的鑒定

崔曉紅，高柳，鄧小飛，趙金梅，馬力，劉平*

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

為了研究雅致放射毛霉和少根根霉混合發(fā)酵紅豆腐的特征香氣成分，采用頂空固相微萃取的方法對(duì)混菌發(fā)酵紅豆腐的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，通過氣相色譜-嗅聞法(gas chromatography-olfactometry, GC-O)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)進(jìn)行香氣成分分析，主要采用檢測(cè)頻率法及香氣活性值(odor activity value, OAV)法，確定紅豆腐中的特征性香氣成分。分析結(jié)果表明，紅豆腐的特征香氣成分有丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、異戊酸、苯甲醛、苯酚、己酸乙酯、辛酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、吲哚，這些化合物對(duì)紅豆腐的香氣具有重大貢獻(xiàn)。

紅豆腐；特征香氣；氣相色譜-聞香法；檢測(cè)頻率法；香氣活性值

腐乳，作為一種傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，在中國(guó)已經(jīng)有1 000多年的歷史。紅豆腐作為腐乳的一種，具有較高的蛋白質(zhì)含量及特有的風(fēng)味，被人們作為開胃菜，深受人們喜愛[1]。腐乳可分為霉菌型腐乳、酶促型腐乳、自然發(fā)酵腐乳和細(xì)菌型腐乳[2]。市售腐乳主要為霉菌型腐乳，其發(fā)酵霉菌主要為毛霉和根霉。其中，雅致放射毛霉和少根根霉是腐乳發(fā)酵的代表菌種。目前對(duì)混合菌種發(fā)酵腐乳的香氣研究較少，對(duì)其特征香氣成分的研究幾乎沒有，本研究選取雅致放射毛霉和少根根霉混合發(fā)酵紅豆腐，對(duì)其特征香氣進(jìn)行分析研究。

氣相色譜-嗅聞技術(shù)(GC-Olfactometry，GC-O)是鑒定香氣活性化合物的有效手段，它以人的鼻子作為檢測(cè)器，將氣相色譜的分離能力與人類鼻子的敏感嗅覺相聯(lián)系。這不僅能提供設(shè)備檢測(cè)到的數(shù)據(jù)，也能獲得對(duì)特征香氣物質(zhì)的感官分析。常用的GC-O嗅聞檢測(cè)技術(shù)包括風(fēng)味提取稀釋分析(aroma extract dilution analysis，AEDA)、檢測(cè)頻率分析(detection frequency，DF)和時(shí)間-強(qiáng)度分析(time-intensity analysis)等[3-5]。氣相色譜-嗅聞技術(shù)在醬油[6]、酒類[7-8]，金華火腿[9]等的特征香氣成分的鑒定中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

本研究主要利用固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)結(jié)合GC/MS-O技術(shù)對(duì)雅致放射毛霉和少根根霉混合菌種發(fā)酵紅豆腐的特征香氣進(jìn)行了分析研究，主要采用檢測(cè)頻率法結(jié)合香氣活性值(OAV)法鑒定紅豆腐的特征香氣成分，為深入了解腐乳獨(dú)特風(fēng)味的化學(xué)本質(zhì)及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雅致放射毛霉、少根根霉，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大豆，石膏辣椒粉、姜、花椒粉、白酒、黃酒、蒜、食鹽，市售；鄰二氯苯(1 000 μg/mL)，上海展云化工有限公司；C8-C20烷烴系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司；GCMS-QP2010PLUS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，日本島津公司；ODP3嗅探儀，德國(guó)GERSTEL公司；TB-214型電子天平，北京塞多利斯天平有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅豆腐的制備

將大豆除雜，清洗干凈后，加入3～4倍的水，室溫下浸泡8 h左右，瀝干，加入約10倍的水磨漿，再用4層紗布濾漿，然后煮沸到100 ℃，豆?jié){加熱溫度應(yīng)控制在96～100 ℃，保持5 min，加入石膏點(diǎn)漿，靜置蹲腦，將凝固的豆花倒入模型中壓制成紅豆腐白坯。將雅致放射毛霉及少根根霉菌懸液以5∶1的比例，以噴灑的方式接種到白坯上，接種量為10%，然后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h得毛坯。準(zhǔn)確稱取毛坯，加入食鹽、輔料等腌制7 d。將腌制完成的紅豆腐瀝干水分后裝入食品包裝袋，抽真空后置于25℃下進(jìn)行后期發(fā)酵成熟得紅豆腐。

1.2.2 頂空固相微萃取

稱取3.0 g研磨均勻的紅豆腐樣品，加1 mL水，加入3 μL濃度為100 μg/mL的鄰二氯苯(1 000 μg/mL鄰二氯苯用甲醇稀釋10倍)作為內(nèi)標(biāo)物，置于15 mL頂空進(jìn)樣瓶，60 ℃下平衡20 min，再用老化后的75 μm PDMS/CAR萃取頭對(duì)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行萃取，頂空吸附40 min后插入GC進(jìn)樣口解析5 min。

1.2.3 GC-MS分析

色譜條件：色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度32 ℃，保持5 min，再以4 ℃/min的速度升溫至130 ℃，最后以10 ℃/min的速度升溫至200 ℃；載氣(He)流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；接口溫度：250 ℃；電離方式：EI；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z40～350。

定性分析：計(jì)算機(jī)檢索NIST 05、NIST 05s譜庫(kù)，并結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行定性。保留指數(shù)使用C8-C20系列烷烴的保留時(shí)間作為參考，通過公式(1)計(jì)算化合物的RI值[10]。

(1)

式中：n為碳原子數(shù)；Ti為待測(cè)組分的保留時(shí)間；Tn及T(n+1)為有n個(gè)和n+1個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

定量分析[11]：以鄰二氯苯為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度、樣品中各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，計(jì)算紅豆腐樣品中各組分的含量，做3次平行，取平均值。

1.2.4 GC-MS-O分析方法

用配有嗅覺檢測(cè)器(ODP)的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀完成紅豆腐特征香氣的分析，GC-MS分析條件同1.2.3，柱流量一部分進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器，而另一部分則進(jìn)入嗅覺探測(cè)器。

(1)檢測(cè)頻率法

8個(gè)經(jīng)聞香培訓(xùn)3個(gè)月以上的評(píng)價(jià)員作為評(píng)價(jià)小組，進(jìn)行GC-O分析，每一成員均熟悉紅豆腐香氣。每位評(píng)價(jià)員嗅聞通過色譜柱分離后洗脫的化合物，將他們嗅聞結(jié)果所得到的單一香味色譜圖進(jìn)行匯總。檢測(cè)頻率法的分析結(jié)果用圖來表示，以DF因子為縱軸，RI為橫軸作圖，稱為DF色譜圖。一般來說DF因子越高說明其濃度較大或者說其香味強(qiáng)度較大，屬于關(guān)鍵香味活性化合物[3]。

(2)香氣活性值法(OAV)

香氣活性值法(OAV)，即濃度與閾值的比值確定關(guān)鍵香氣成分。根據(jù)Guadagni香氣理論，所檢測(cè)到的揮發(fā)性化合物中含量高且閾值低的香氣成分對(duì)紅豆腐香氣的貢獻(xiàn)較大，以含量高閾值低的香氣成分作為關(guān)鍵香氣成分。OAV值≥1的化合物被確定為紅豆腐的活性香氣化合物[12]。OAV按公式(2)計(jì)算：

OAVi=Ci/OTi

(2)

式中，OAVi，物質(zhì)i的香氣活性值；Ci，紅豆腐組分i的質(zhì)量濃度，mg/kg；OTi，組分i在水中的香氣閾值，mg/kg。

2 結(jié)果與分析

通過GC-MS鑒定出紅豆腐的揮發(fā)性風(fēng)味成分見表1，共鑒定出68種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類13種，酯類22種，酚類1種，醛類6種，硫醚類5種，酮類2種，烴類7種，雜環(huán)類6種，酸類4種，其他2種。

表1 紅豆腐揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表1

保留指數(shù)文獻(xiàn)保留指數(shù)化合物名稱濃度/(ng·g-1)保留指數(shù)文獻(xiàn)保留指數(shù)化合物名稱濃度/(ng·g-1)860850[17]正己醇213.44±27.74849851[15]烯丙基硫醚163.23±33.24950940[14]2,6-二甲基-4-庚醇22.06±0.99883—正丁基縮水甘油醚17.65±0.79969982[13]1-辛烯-3-醇36.76±1.2610801094[15]二烯丙基二硫醚257.35±1.4111001080[15]芳樟醇738.24±49.401200—4-烯丙基苯甲醚647.06±45.9011501131[14]苯乙醇473.53±48.501233—單硫代苯甲酸48.53±0.9511371102[15]4-萜烯醇2.92±0.27酮類酯類600624[15]丁酮86.76±6.04576—醋酸乙烯酯7.35±0.48877885[14]2-庚酮33.82±1.28605611[13]乙酸乙酯166.18±1.68烴類686698[15]丙酸乙酯127.9±3.93888899[17]1,3,5,7-環(huán)辛四烯38.24±3.65721732[15]異丁酸乙酯66.18±1.18943912[15](1S)-(-)-β-蒎烯858.82±58.60776786[13]丁酸乙酯60.29±0.84976952[15]羅勒烯45.59±0.89793805[15]反式丁烯酸乙酯5.88±0.9910171041[17]α-松油烯164.71±14.69841836[15]2-甲基丁酸乙酯116.18±10.981018—右旋萜二烯625.00±36.94856847[16]異戊酸乙酯108.82±15.451035—間異丙基甲苯238.24±33.92872882[17]乙酸異戊酯151.47±4.361073—2-異丙烯基甲苯169.12±5.64915904[16]戊酸乙酯39.71±1.01雜環(huán)類921—1-乙酰氧基-2-丁酮58.82±0.84856842[15]2-甲基吡嗪16.18±0.26947984[17]3-羥基丁酸乙酯482.35±21.56910896[15]2,5-二甲基吡嗪160.29±9.19995—苯酰異硫氰酸酯17.64±0.941004998[15]2,3-二甲基-5-乙基吡嗪350.00±24.97996989[14]己酸乙酯2945.59±195.4210351010[17]2-乙?；量?3.24±1.4210471030[15]乳酸丁酯2.94±0.3912951290[13]吲哚339.71±38.3210831095[15]辛酸甲酯7.35±1.211427—6-氨基-3-甲基嘌呤29.41±0.7511541158[15]煙酸乙酯154.24±12.80酸類11601162[14]苯甲酸乙酯30.88±2.32711702[15]異丁酸147.05±1.1811731186[14]辛酸乙酯170.59±28.37822841[17]丁酸77.94±1.1813961388[14]癸酸乙酯39.71±3.87876870[15]2-甲基丁酸291.18±4.471639—對(duì)苯二酚二丙酸酯4.41±0.54882864[15]異戊酸222.06±8.491948—2-苯基-1,3-丙二醇二氨基甲酸酯145.59±30.24其他酚類741—1,2-丙二胺17.65±2.56992995[13]苯酚857.35±54.9812831278[14]茴香腦758.82±10.89

注：濃度以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，n=3；—, 未檢索到相關(guān)報(bào)道或無法得到相關(guān)數(shù)值。

2.1 檢測(cè)頻率法鑒定紅豆腐特征香氣成分

檢測(cè)頻率法可以使感官人員在很短的時(shí)間內(nèi)鑒定出特征風(fēng)味物質(zhì)[13]。表2記錄了紅豆腐中至少被2個(gè)感官評(píng)定人員嗅聞到的物質(zhì)，共有27種，通過匹配保留指數(shù)、質(zhì)譜和香氣屬性鑒定出24種化合物，3種化合物可能由于痕量而未被鑒定出來。

表2 紅豆腐中的香氣活性物質(zhì)

續(xù)表2

序號(hào)保留指數(shù)文獻(xiàn)保留指數(shù)名稱鑒定方式香氣描述 DF151004998[15]2,5-二甲基-3-乙基吡嗪MS、RI焙烤香21610351010[17]2-乙?；量㎝S、RI烤面包香41710801094[15]二烯丙基二硫醚MS、RI大蒜味41811001080[15]芳樟醇MS、RI百合花香71911501131[14]苯乙醇MS、RI玫瑰香62011541158[15]煙酸乙酯MS、RI樹木味32111601162[14]苯甲酸乙酯MS、RI蜂蜜花香42211731186[14]辛酸乙酯MS、RI奶油香52312951290[13]吲哚MS、RI臭味62413961388[14]癸酸乙酯MS、RI菠蘿香,水果香3u1未知物刺激性臭味5u2未知物花香3u3未知物腐臭味4

根據(jù)它們的氣味特征，可將這16種化合物分為4組。第一組是由果香和花香組成，包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、苯乙醇等；第二組由酸臭味、腥臭味和醚臭味組成，包括丁酸、苯酚、吲哚等；第三組是由焙烤味和堅(jiān)果香組成，包括2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪等；第四組是由不同香氣氣味屬性組成，如具有青草香的羅勒烯，具有藥香的2-乙?；量┑取?/p>

通過SPME-GC-O技術(shù)在DB-5MS柱上共檢測(cè)到27種香味活性化合物(表2所示)，圖1是紅豆腐的DF譜圖。由圖1可知，丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸、苯甲醛、苯酚、己酸乙酯、芳樟醇被評(píng)價(jià)小組中至少7人檢測(cè)到。由于這7種物質(zhì)具有強(qiáng)烈的風(fēng)味，它們可能對(duì)紅豆腐的特征風(fēng)味具有極大的貢獻(xiàn)。此外，丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、苯乙醇、吲哚均被8個(gè)評(píng)價(jià)人員中的6個(gè)評(píng)價(jià)人員檢測(cè)到，其余至多被5人檢測(cè)到。為進(jìn)一步確定紅豆腐的特征香氣成分，對(duì)其OAV值進(jìn)行了計(jì)算。

圖1 腐乳香氣活性化合物的DF譜圖Fig.1 Aromagram of aroma-active compounds in fermented bean curd by the detection frequency method

2.2 OAV值法鑒定紅豆腐的特征香氣成分

將紅豆腐樣品進(jìn)行定量分析后，計(jì)算潛在風(fēng)味物質(zhì)的風(fēng)味活性(OAV)值，選取DF值大于4的20種化合物如表3所示，計(jì)算找到香氣閾值的化合物的OAV值，使在紅豆腐中獲得的特征香氣成分有更為可靠的評(píng)價(jià)。其中u1和u3為未知化合物，不能計(jì)算其OAV值，而由于在文獻(xiàn)中未查到羅勒烯、2-乙?；量⒍┍蛎训拈撝?，所以不能計(jì)算其OAV值。

表3 紅豆腐中主要風(fēng)味物質(zhì)的OAV值

注：na. 未查到相關(guān)數(shù)據(jù)。

由表3可知，OAV值≥1的化合物有丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、異戊酸、苯甲醛、苯酚、己酸乙酯、辛酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、吲哚，這些化合物的DF值均≥5。而丁酸及2-甲基丁酸的DF值為8，但由于其濃度較小，OAV值小于1，說明其對(duì)紅豆腐的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，不能作為紅豆腐的特征香氣成分。

表3顯示，OAV值≥1的香氣化合物包括3種酯類，2種醇類，2種醛類，1種酸類，1種酚類及1種雜環(huán)類。其中酯類有丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，酯類物質(zhì)主要在紅豆腐發(fā)酵過程中由有機(jī)酸和醇類在酶的催化作用下反應(yīng)生成[15]，酯類物質(zhì)可以賦予紅豆腐愉悅的果香、窖香等香氣特征，對(duì)紅豆腐的香氣具有很大的貢獻(xiàn)。

芳樟醇和苯乙醇的閾值較小，對(duì)紅豆腐的香氣貢獻(xiàn)大，賦予紅豆腐花香的香氣特征。醇類物質(zhì)的生成是由于脂肪的氧化分解或者羰基化合物的還原[19]。苯乙醇具有玫瑰花香，與苯丙氨酸的代謝相關(guān)或者由葡萄糖代謝合成，是多種食物的關(guān)鍵香氣組成成分，如芝士、西紅柿等[20-21]。芳樟醇具有百合花香，主要來源于天然植物香料中，使紅豆腐具有愉悅的香氣。

苯甲醛和3-甲硫基丙醛OAV值≥1且DF值≥6的物質(zhì)，苯甲醛具有苦杏仁味，具有導(dǎo)致氣味協(xié)同作用的效果，是非常有效的風(fēng)味修飾劑[22]。3-甲硫基丙醛作為一種含硫的物質(zhì)，主要來自含硫氨基酸(如硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸)、肽等的降解，在水中的閾值很低，是醬油的關(guān)鍵風(fēng)味化合物[16,23]，黃明泉等[14]研究表明3-甲硫基丙醛對(duì)紅豆腐的香味具有重要影響。

異戊酸作為OAV值≥1的酸類物質(zhì)，具有酸臭味，賦予紅豆腐特有的香氣特征。酸類物質(zhì)不僅提供酸味而且還提供一定的風(fēng)味，另外還是合成酯類化合物的前體物質(zhì)之一[17]。

苯酚作為唯一一種在紅豆腐中檢測(cè)到的酚類物質(zhì)，可能來自酪氨酸的分解，因?yàn)槔野彼峤Y(jié)構(gòu)中含有苯酚的結(jié)構(gòu)[24]。苯酚還可以作為防腐劑和殺菌劑，延長(zhǎng)紅豆腐的保質(zhì)期。孫菁赫等[25]報(bào)道苯酚為克東紅豆腐的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

吲哚也稱2,3-苯并吡咯，屬于含氮化合物，天然存在于茉莉，苦橙，長(zhǎng)壽花等精油和咖啡中，吲哚在較高的濃度下具有強(qiáng)烈的糞便臭味，擴(kuò)散力大并且留香持久，稀釋到一定的濃度后，就具有花的香味，可用于調(diào)配咖啡香精等。吲哚可能是在微生物的作用下，由色氨酸裂解直接產(chǎn)生，這也可能是導(dǎo)致紅豆腐中游離的色氨酸較低的原因[26-27]。馬艷莉等[28]研究表明吲哚為紅豆腐的關(guān)鍵香氣成分。

結(jié)合檢測(cè)頻率法和香氣活性值法，可以得出DF值≥5且OAV值≥1的物質(zhì)可以鑒定為紅豆腐的特征香氣成分。本次鑒定出的紅豆腐特征香氣成分有丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、異戊酸、苯甲醛、苯酚、己酸乙酯、辛酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、吲哚，這些化合物構(gòu)成了紅豆腐特有的風(fēng)味。

3 結(jié)論

本研究采用風(fēng)味分析技術(shù)(GC-O)研究混菌發(fā)酵紅豆腐。采用固相微萃取技術(shù)對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取，接著進(jìn)行聞香分析與質(zhì)譜分析，采用檢測(cè)頻率法結(jié)合香氣活性值法鑒定出丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、異戊酸、苯甲醛、苯酚、己酸乙酯、辛酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、吲哚為紅豆腐的特征香氣成分。

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Identification of characteristic aroma compounds in red bean corruption fermented by mixed strain

CUI Xiao-hong, GAO Liu, DENG Xiao-fei, ZHAO Jin-mei, MA Li, LIU Ping*

(School of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

The red bean corruption is a kind of sufu with long production history and strong local characteristics. The characteristic aroma compounds in red bean corruption fermented byActinomucorelegansandRhizopusarrizuswereanalyzedbyheadspacesolid-phasemicroextraction(HS-SPME)combinedwithgaschromatography-massspectrometry(GC-MS)andgaschromatography-olfactometry(GC-O).Odorantsoffermentedbeancurdwereinvestigatedbydetectionfrequencymethodandodoractivevaluesmethod.Itshowedthatcharacteristicaromacompoundswerecomposedbyavarietyofcompoundsincludingethylbutyrate, 3-(methylthio)propionaldehyde,isovalericacid,benzaldehyde,phenol,ethylcaproate,ethylcaprylate, 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol,phenethylalcohol,andindole.

red bean corruption; characteristic aroma components; gas chromatography-olfactometry (GC-O); detection frequency method; odor active value (OAV)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702031

碩士研究生(劉平副教授為通訊作者，E-mail：453298621@qq.com)。

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(Z2014062)；四川省教育廳項(xiàng)目(15ZA0140)；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(ycjj2016044)；省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610623073)

2016-09-19，改回日期：2016-10-27