HPLC-MS/MS與ICP-MS分別測定血液中14種全氟化合物及常見金屬元素

張睿佳,周枝鳳,李敏杰,李子煥,曾利蘭,馬安德*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫學(xué)系，廣東 廣州 510515；2.華銀檢測中心，廣東 廣州 510515)

HPLC-MS/MS與ICP-MS分別測定血液中14種全氟化合物及常見金屬元素

張睿佳1,周枝鳳1,李敏杰1,李子煥1,曾利蘭2,馬安德1*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫學(xué)系，廣東 廣州 510515；2.華銀檢測中心，廣東 廣州 510515)

為了解廣東兒童血液中全氟化合物(PFCs) 和常見金屬元素的含量水平，為兒童健康評估提供數(shù)據(jù)，該文采用蛋白沉淀法提取樣品，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測樣品中14種PFCs。同時(shí)，以石墨全自動(dòng)消解儀消解血液樣品，電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS) 檢測血液中鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、銅(Cu) 和錳(Mn) 元素。結(jié)果顯示，兒童血液中14種PFCs被普遍檢出，其中全氟辛基磺酸(PFOS) 和全氟辛基羧酸(PFOA) 的檢出率及濃度最高，但在一些個(gè)體中發(fā)現(xiàn)較高濃度的其它碳鏈PFCs。PFCs濃度有隨著年齡增長而下降的趨勢，但除了全氟丁基磺酸外，無性別差異。另一方面，兒童血液中檢出的Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn含量在正常范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)有性別差異。研究顯示PFCs普遍存在兒童血液中，兒童PFCs暴露水平的研究應(yīng)引起重視。在今后的監(jiān)測中，不僅要關(guān)注PFOS和PFOA，也要關(guān)注其它碳鏈PFCs。

全氟化合物；金屬元素；HPLC-MS/MS；ICP-MS

全氟化合物(Perfluorinated compounds,PFCs) 是一類碳原子上的氫原子均被氟原子取代的人造有機(jī)化合物。PFCs因擁有極高的表面活性和獨(dú)特的疏水疏油特性，被廣泛應(yīng)用于商業(yè)和工業(yè)產(chǎn)品中，如疏水表面活性劑、阻燃劑、光致抗蝕劑、疏油抗污劑、涂料添加劑等。PFCs具有極強(qiáng)的熱、化學(xué)和生物穩(wěn)定性，能持久地存在于自然環(huán)境中[1]。2009年5月，在瑞士日內(nèi)瓦召開的第四屆斯德哥爾摩公約締約國大會(huì)上，全氟辛基磺酸及其鹽類(PFOS)被作為一類重要的新型持久性有機(jī)污染物，列入公約附件B中加以限制[2]。PFCs的環(huán)境污染問題已十分嚴(yán)重，幾乎所有的環(huán)境介質(zhì)和生物體中均發(fā)現(xiàn)了PFCs，無論是在地表水、地下水、自來水、土壤、沉積物和污水污泥，還是各種生物體的組織和血液中，甚至在人跡罕至的北極地區(qū)，也發(fā)現(xiàn)了PFCs的蹤跡[3]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)研究表明：PFCs具有肝臟毒性、神經(jīng)毒性、發(fā)育與生殖毒性、內(nèi)分泌干擾和致癌作用等多種毒性，被認(rèn)為是一類具有全身多臟器毒性的環(huán)境污染物[4]。PFCs對人體健康具有較大危害，尤其是影響兒童健康[5-6]。兒童處于生長發(fā)育的敏感階段，多種器官易受到環(huán)境有害物損害。因此，十分有必要關(guān)注兒童PFCs的暴露水平。 此外，長期的研究已經(jīng)證實(shí)鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、銅(Cu) 和錳(Mn) 等常見金屬元素與人體健康息息相關(guān)[7]。PFCs的暴露會(huì)對人體健康造成危害，常見金屬元素的過量或者缺乏也會(huì)對人體健康造成影響，同時(shí)分析兩者在血液中的含量情況，有助于進(jìn)一步的健康監(jiān)測，為預(yù)防策略提供依據(jù)。

從2001年至2006年，中國的全氟辛基磺酸(PFOS)生產(chǎn)量從不足50噸/年增長到250噸/年，截至2011年P(guān)FOS的生產(chǎn)量累積達(dá)到1 800噸[8]。在中國，大部分PFCs的制造廠商位于東部和南部，尤其是沿海地區(qū)，如浙江省、福建省和廣東省等[9]。 廣東省是中國人口最多和最發(fā)達(dá)的省份之一[10]，學(xué)者對PFCs的研究主要集中在水體、大氣和土壤等環(huán)境介質(zhì)方面，有關(guān)人群暴露水平的研究缺乏，特別在兒童方面。本研究旨在了解廣東兒童血液中PFCs和常見金屬元素的含量水平，為兒童健康評估提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

2015年10月至2015年12月收集廣東省珠三角地區(qū)336份0～7歲兒童血樣。

1.2 儀器與試劑

SHIMADZU LC-20A DXR液相色譜輸入泵、SHIMADZU LC-20AX進(jìn)樣器、SHIMADZU CTO-20A 柱溫箱(日本島津公司)；API4000-Qtrap Mass Spectrometer System 三重四極桿質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。Vortex-5 渦旋混合器(江蘇海門其林貝爾)，CT15RT 高速冷凍離心機(jī)(上海天美公司)，KQ-500DB 超聲儀(江蘇昆山超聲公司)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國熱電-賽默飛公司)，Milli-Q Elixt超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)。

全氟丁酸(PFBA，98%)、全氟戊酸(PFPeA，98%)、全氟己酸(PFHxA，98%)、全氟庚酸(PFHpA，98%)、全氟癸酸(PFDA，97%)、全氟十一酸(PFUnDA，95%) 和全氟丁基磺酸(PFBS，98%) 購自德國CNW公司。全氟壬酸(PFNA，97%)、全氟十二酸(PFDoDA，96%) 和全氟十四酸(PFTeDA，96%) 購自英國Alfa公司。全氟十三酸(PFTrDA，96%)和全氟己基磺酸(PFHxS，98%) 購自美國Sigma-Aldrich公司。全氟辛酸(PFOA，95.5%) 和PFOS(98%)購自Dr.Ehrenstorfer公司。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)13C4-全氟辛酸(MPFOA) 和13C4-全氟辛基磺酸(MFPOS)，購自加拿大Wellington實(shí)驗(yàn)室。色譜純的甲醇和乙腈購自德國Merck公司。Ca、Mg、Fe、Zn、Cu 和Mn標(biāo)準(zhǔn)溶液購自美國NSI Solution公司。濃硝酸購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 HPLC-MS/MS條件

負(fù)離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，離子源參數(shù)：GAS1為50 psi、GAS2為60 psi、CUR為30 psi、離子源溫度650 ℃，兩對離子對進(jìn)行監(jiān)測。分析色譜柱： Accucore C18(2.6 μm,100 mm×4.6 mm,美國熱電公司)，捕集色譜柱：Hypersil GOLD C18(5 μm,50 mm×4.6 mm,美國熱電公司)。柱溫為40 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相為甲醇(A)-5 mmol/L醋酸銨(B)溶液，整個(gè)梯度洗脫時(shí)間為10 min。梯度洗脫程序：0～1.5 min，70%B，1.5～2.5 min，70%～30%B，2.5～4.5 min，30%～10%B，4.5～6.5 min，10%B，0.5 min后升至70%B直到10 min。

1.4 ICP-MS條件

儀器在使用前至少預(yù)熱穩(wěn)定0.5 h，使用質(zhì)譜調(diào)諧液在STD模式下對儀器的靈敏度、氧化物和雙電荷等進(jìn)行調(diào)諧至達(dá)到檢測要求。冷卻氣流速為13.84 L/min，輔助氣流速為0.795 L/min，載氣流速為0.93 L/min，RF功率為1 548.6 W，采樣深度為5 mm，重復(fù)次數(shù)為3次，停留時(shí)間為0.05 s。

1.5 樣品的處理方法

血漿樣品前處理方法參考Lien等[11]報(bào)道的方法。移取0.2 mL血漿于EP管中，隨后依次加入0.04 mL 100 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液，0.05 mL甲醇-水(體積比1∶1) 和0.4 mL乙腈。渦旋1 min后，于13 000 r/min離心10 min，移取0.55 mL上清液于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

移取0.5 mL 全血于消解罐內(nèi)，加入6 mL 65%硝酸，加熱100 ℃，消解4 h，消解完全冷卻后，超純水定容至25 mL，進(jìn)行ICP-MS分析[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

選擇甲醇作為流動(dòng)相時(shí)大多數(shù)PFCs能獲得更好的靈敏度、峰形和分辨率[1]。為了獲得最佳的分離條件，本研究考察了流動(dòng)相中緩沖鹽的種類(甲酸和乙酸銨)及濃度(2、5、10、15 mmol/L) 的影響。結(jié)果表明，當(dāng)以甲酸為流動(dòng)相的緩沖鹽時(shí)，得到的PFCs峰寬大、峰形差、信號低。流動(dòng)相中乙酸銨濃度為2 mmol/L時(shí)，PFCs尤其是PFPeA的響應(yīng)信號低。當(dāng)乙酸銨濃度>10 mmol/L時(shí)，大多數(shù)PFCs的響應(yīng)信號受到抑制并且PFBA峰拖尾。相比之下，流動(dòng)相中乙酸銨為5 mmol/L時(shí)，各PFCs的峰形良好，響應(yīng)高，因此選擇5 mmol/L乙酸銨為緩沖鹽，優(yōu)化得到最佳的梯度洗脫程序如“1.3”所述。Zabaleta等[14]在流動(dòng)相中加入離子對試劑1-甲基吡啶，以改善響應(yīng)信號和峰形。本研究無需在流動(dòng)相中添加離子對試劑，即能獲得尖銳和對稱的峰。圖 1為加標(biāo)樣品的典型TIC色譜圖。

在負(fù)離子模式下，PFCs具有較高的靈敏度，故監(jiān)測模式選擇負(fù)離子模式。為了獲得較高響應(yīng)信號，用200 ng/mL的PFCs標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化離子源參數(shù)(電壓、溫度和輔助氣流等) 和質(zhì)譜條件(去簇電壓和碰撞能等)。每個(gè)PFCs有2對離子對，選取響應(yīng)高的1對離子對作為定量離子對，另1對作為定性離子對(除了PFBA和PFPeA)。具體的優(yōu)化參數(shù)見表1。

2.2 質(zhì)量控制與保證

為控制操作過程中的污染，每隔20個(gè)血漿樣品，做1個(gè)操作空白樣(純水)。實(shí)驗(yàn)所用的器材和試劑，均經(jīng)過LC-MS/MS檢測，無PFCs檢出。為了保證分析數(shù)據(jù)的可靠性，每20個(gè)血漿樣品隨行1個(gè)質(zhì)控樣品。14種PFCs的方法檢出限和定量下限分別為0.03～0.15 ng/mL和0.1～0.5 ng/mL。將低、中和高3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液(2、10、40 ng/mL) 加入初生小牛血清中，連續(xù)3 d每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測定3次，獲得14種PFCs的相對回收率為 92.2%～113.6%；基質(zhì)效應(yīng)值為100%時(shí)，表示無基質(zhì)干擾，本文獲得14種PFCs的基質(zhì)效應(yīng)范圍為83.8%～106.1%；批間和批內(nèi)準(zhǔn)確度范圍為80.1%～112.3%；批間和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<13%。

表1 全氟化合物的液相色譜和質(zhì)譜參數(shù)

*quantification transition

2.3 血液中PFCs的測定

在兒童血漿中14種PFCs均能被檢出，PFOS和PFOA的檢出率接近100%，其余12種PFCs的檢出率<70%。因PFBA和PFTeDA的檢出率<10%，這兩種物質(zhì)不再進(jìn)行下一步統(tǒng)計(jì)比較。兒童血漿中PFOS的平均和中位濃度最高，分別為49.2、22.7 ng/mL；其次是PFOA，平均值為4.0 ng/mL，中位值為2.6 ng/mL；其余12種PFCs的平均值和中位值均小于1 ng/mL(圖2)。 本文所測兒童血液中PFOS和PFOA濃度高于南昌市和原陽縣兒童血液濃度[15-16]，這可能與人口數(shù)量和工業(yè)化程度有關(guān)。南昌市常住人口約400萬，而珠三角地區(qū)常住人口達(dá)到5 874.27萬[16]。河南省是農(nóng)業(yè)大省，工業(yè)化程度比珠三角地區(qū)低，并且原陽縣是河南省的貧困縣[15]。兒童血漿中PFOS和PFOA仍是2種最主要的PFCs，這與之前的研究結(jié)果一致[15,17]。 但本文短鏈PFCs(碳鏈<6，即PFBA、PFPeA和PFHxA) 的檢出率和濃度高于文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]。據(jù)報(bào)道，近幾年主要的氟化合物制造商改用短鏈PFCs來取代PFOS和PFOA[20]，這能部分解釋某些個(gè)體中出現(xiàn)較高濃度的其它碳鏈PFCs的原因。

兒童血漿中PFCs濃度隨著年齡的增長而下降，除了PFPeA 和 PFHpA，表明兒童在胎兒期或者嬰兒期有高水平的PFCs暴露，這可能與PFCs通過胎盤和母乳進(jìn)入嬰兒體內(nèi)有關(guān)[21- 22]。 男童血漿中14種PFCs濃度的高低順序依次為：PFOS>PFOA>PFHxS>PFNA>PFDA>PFUnDA>PFPeA>PFHxA>PFHpA>PFDoDA≈PFTrDA≈PFBS≈PFBA≈PFTeDA，在女童血漿中也發(fā)現(xiàn)相似的濃度次序。經(jīng)Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析后，只發(fā)現(xiàn)男童血漿中PFBS濃度高于女童(p<0.01)。男童血漿中PFBS的濃度很低(<0.1 ng/mL)，因而，本文中不同性別兒童血漿中PFBS的差異，可能是由抽樣誤差引起。兒童血漿中PFCs濃度彼此間的相關(guān)系數(shù)范圍為-0.267～0.472(p<0.05)，PFHpA、PFOA、PFNA和PFDA相互間的相關(guān)系數(shù)較強(qiáng)，表明這幾種PFCs的暴露來源相似。在來自中國12個(gè)城市的人群和深圳人群的研究中，亦發(fā)現(xiàn)PFHpA、PFOA、PFNA和PFDA相互間有強(qiáng)相關(guān)性[23- 24]。

2.4 血液中金屬元素的測定

兒童血液中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn的平均值分別為76.47、36.67、412.71、4.54、1.06、17.31 mg/L，中位值分別為76.37、36.43、416.25、4.54、1.03、16.7 mg/L。個(gè)體血液中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn的含量在正常范圍內(nèi)。男童血液中Ca、Mg和Cu的濃度高于女童，反之另外3種金屬元素在女童血液中較高，但經(jīng)t檢驗(yàn)后，均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié) 論

PFCs普遍存在兒童血液中。雖然PFOS和PFOA的含量最高，但在一些個(gè)體中能檢出較高濃度的其它碳鏈PFCs。在今后的監(jiān)測中，不僅要關(guān)注PFOS和PFOA，還要關(guān)注其它碳鏈PFCs。PFCs濃度有隨著年齡增長而下降的趨勢，關(guān)注兒童早期PFCs的高暴露，減少兒童早期暴露，有利于避免PFCs對兒童造成的健康危害。兒童血液中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu和Mn的含量在正常水平內(nèi)，并且沒有性別差異。這在一定程度上體現(xiàn)國內(nèi)宣傳教育常見金屬元素對人體重要性的工作成效，家長對于兒童補(bǔ)充常見金屬元素的意識(shí)提高。

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Analysis of 14 Perfluorinated Compounds and Common Metal Elementsin Blood by HPLC-MS/MS and ICP-MS

ZHANG Rui-jia1,ZHOU Zhi-feng1,LI Min-jie1,LI Zi-huan1,ZENG Li-lan2,MA An-de1*

(1.Hygiene Detection Center,School of Public Health,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.Huayin Testing Center,Guangzhou 510515,China)

The aim of this paper was to understand the concentrations of perfluorinated compounds(PFCs) and common metal elements in children’s blood and provide data for the assessment of children’s health.The samples were extracted by protein precipitation,and then detected by high liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Meanwhile,the samples were digested with graphite automatic instrument,and then calcium(Ca),magnesium(Mg),iron(Fe),zinc(Zn),copper(Cu) and manganese(Mn) in samples were determined by inductively coupled plasma-mass spectrometry(ICP-MS).The PFCs in children’s blood were widely detected.The frequencies and concentrations of perfluorooctane sulfonate(PFOS) and perfluorooctanoic acid(PFOA) were the highest,whereas some other PFCs with higher concentrations were found in some blood samples.A negative correlation was found between the concentrations of PFCs and the children’s age.There was no gender difference in the concentrations of PFCs except perfluorobutane sulfonate.The concentrations of Ca,Mg,Fe,Zn,Cu and Mn were in normal range.The PFCs in children’s blood were widely determined.Concerns regarding children exposure to PFCs are needed.Focus should be paid not only on PFOS and PFOA,but also on other PFCs in the future monitoring.

perfluorinated compounds；metal elements；HPLC-MS/MS；ICP-MS

2017-05-05；

2017-05-15

國家自然科學(xué)基金(21607070)；國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX09103101-053)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.005

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)08-0975-05

*通訊作者：馬安德，博士，教授，研究方向：環(huán)境污染和毒藥物研究，Tel：020-61648462,E-mail:mandmy@smu.edu.cn